基于鐵死亡基因結腸癌分子預后模型的建立與分析

黃 奔，孫姍姍，王 潔，趙 鴻△

(南京醫科大學第一附屬醫院：1.檢驗學部；2.放射科，江蘇 南京 210009)

結直腸癌是世界范圍內第三大常見惡性腫瘤，據預計至2030年全球將有超過220萬新發病例和110萬死亡病例[1]。有學者指出，轉移性結腸癌患者5年生存率僅為14%[2]。腫瘤患者的治療決策和預后預測主要依賴于TNM分期系統[3]。然而TNM分期對患者預后的評估存在局限性，如即使患者處于同一分期，其預后結局可能明顯不同[4]。因此，分子預后便受到了研究者的關注。

鐵死亡是區別于細胞自噬和細胞凋亡的一種新型細胞死亡形式，是一種鐵依賴性和活性氧(ROS)依賴性細胞死亡[5]。有研究表明，在多種生理條件和病理應激下均可引發鐵死亡，在腫瘤發生過程中發揮了關鍵作用[5]。DU等[6]指出，HSPA4、ISG20L2、NRAS、IL17D、NDRG1、ACSL4、G6PD 7個鐵死亡基因在預測肝細胞癌預后方面可能比傳統臨床病理因素更穩定、可靠。胡文龍等[7]利用癌癥基因圖譜(TCGA)數據庫構建了基于5個鐵死亡相關基因的肺鱗癌預后模型，對肺鱗癌患者的個體化治療提供了參考。因此，鐵死亡相關基因的分子預后模型被許多研究者認為可作為癌癥患者預后決策[8-9]。本研究通過利用TCGA結腸癌數據集，分析鐵死亡相關基因在結腸癌中的分子作用機制，構建了基于鐵死亡基因結腸癌分子預后模型，旨在為結腸癌提供新型分子預后標志物，為結腸癌的診療及預后評估提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料來源 在TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載結腸癌轉錄組測序數據和患者臨床信息。共有結腸癌組織473份，正常組織41份。從文獻中檢索鐵死亡相關基因，并在鐵死亡數據庫FerrDb(http://www.zhounan.org/ferrdb/)下載鐵死亡相關基因的數據集文件，包括驅動基因、抑制基因和基因標志物，將鐵死亡基因與患者基因表達數據進行合并，獲取患者鐵死亡相關基因表達數據。

1.2方法

1.2.1功能富集分析 以|log2FC|>1，FDR<0.05為條件，使用R 4.1.0軟件中的“limma”程序包對鐵死亡相關基因進行差異表達分析，使用“clusterProfiler”程序包對差異表達基因進行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析，了解鐵死亡相關基因的生物學功能。

1.2.2COX回歸分析 根據鐵死亡相關基因表達數據，結合患者臨床信息中的生存數據，使用單因素和多因素COX回歸分析，篩選與患者預后有關的鐵死亡基因。

1.2.3模型的建立 根據多因素COX回歸分析篩選的基因構建基于鐵死亡基因結腸癌分子預后模型。根據文獻報道的公式建立風險預后方程，即風險評分=β1×mRNA1EXP + β2×mRNA2EXP+……+βn×mRNAnEXP。β為相應mRNA的多因素回歸系數，mRNAnEXP為相應mRNA的表達量。

1.3統計學處理 采用R 4.0.1軟件和SPSS25.0統計軟件進行數據分析，采用Wilcoxon非參數秩和檢驗分析腫瘤組織和正常組織鐵死亡相關基因表達的差異；COX回歸分析鐵死亡相關基因與患者生存率的相關性；Kaplan-Meier法分析高、低風險組生存率的差異；P<0.05為差異有統計學意義。采用R 4.1.0軟件的“survminer”程序包繪制高、低風險組患者總體生存率的生存曲線圖；采用受試者工作特征曲線曲線評價基于鐵死亡基因結腸癌分子預后模型的靈敏度和特異度。

2 結 果

2.1鐵死亡相關基因分析 在結腸癌中共篩選到72個差異表達的鐵死亡相關基因。見表1。其中上調表達47個，下調表達25個。差異基因表達的火山圖和表達熱圖見圖1。差異表達基因主要富集在細胞對化學應激的反應、氧化應激的反應及ROS代謝過程等生物學過程中；富集在細胞頂端、基底外側質膜、脂滴等細胞學成分；富集在有機陰離子跨膜轉運蛋白活性、抗氧化活性、氧化還原酶活性等分子功能。見圖2A。差異表達基因主要參與鐵死亡、癌相關的中心碳代謝、P53信號途徑以及與腫瘤相關的信號通路。見圖2B。

表1 差異表達的鐵死亡相關基因

A：鐵死亡相關基因的表達火山圖，綠色代表下調基因，紅色代表上調基因；B：鐵死亡相關基因的表達熱圖。圖1 差異鐵死亡相關基因的表達分析

A：鐵死亡相關基因GO富集分析圖；B：鐵死亡相關基因KEGG信號通路富集分析圖。圖2 GO和KEGG功能富集分析

2.2COX回歸分析 6個鐵死亡相關基因與結腸癌患者預后相關，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。DRD4、TFAP2C、ENPP2、CAV1 4個鐵死亡相關基因可參與模型的構建。見表3。

表2 COX回歸分析

表3 多因素COX回歸分析

2.3模型分析 根據風險評分=0.377×DRD4EXP+0.115×TFAP2C EXP+0.058×ENPP2EXP+0.014×CAV1EXP計算TCGA數據集中每例結腸癌患者的風險評分并分為高風險分組和低風險分組。高風險組患者總體生存率明顯低于低風險組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

A：高低風險組患者生存曲線圖；B：風險評分的分布圖；C：4個鐵死亡相關基因在高、低風險組的表達熱圖；D：TCGA結腸癌數據集中患者總體生存率和風險評分的分布圖。圖3 模型分析

2.4影響患者預后的臨床因素 患者年齡、Stage分期、T分期、N分期、M分期、風險預測因子均與患者預后相關(P<0.05)；患者年齡和風險預測因子為患者預后的不良因素(HR=1.041、1.144,95%CI:1.019～1.063、1.072～1.221，P=0.001)。見圖4。風險預測因子和其他臨床特征預測患者生存率的列線圖見圖5。

A：單因素COX回歸分析的森林圖；B：多因素COX回歸分析的森林圖。圖4 COX回歸分析

圖5 列線圖

2.5模型評價 基于鐵死亡基因結腸癌分子預后模型預測患者1、3、5年生存率的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.714、0.750、0.759。見圖6A。預測患者3、5年生存率的AUC均大于相應TNM分期系統的AUC。見圖6B、C。表明基于鐵死亡基因結腸癌分子預后模型預測性能具有良好的靈敏度和特異度。

A：預測患者生存率的ROC曲線圖；B：預測患者1年生存率的ROC曲線圖；C：預測患者3年生存率的ROC曲線圖；D：預測患者5年生存率的ROC曲線圖。圖6 ROC曲線

2.6功能分析 高、低風險組患者NRP1、TIGIT、PD-L1、CD44、TNFSF4免疫檢查點比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖7A、B。高、低風險組患者YTHDC2、YTHDF2、YTHDC1、RBM15、FTO、WTAP、METTL14、HNRNPC等m6A相關基因表達比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖7C。高、低風險組患者免疫細胞共抑制、免疫細胞共刺激、免疫檢查點、免疫T淋巴細胞、促炎癥作用比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖7D。表明高、低風險組患者免疫相關功能存在一定差異。

A、B：高、低風險組免疫檢查點比較；C：高、低風險組m6A相關基因比較；D：高、低風險組免疫相關功能比較。與低風險組比較，aP<0.05。圖7 高、低風險組患者免疫相關功能比較

3 討 論

鐵死亡是一種非凋亡的、鐵依賴的調控細胞死亡形式，其標志為鐵依賴性脂質過氧化物的積累[10]。多數腫瘤處于高氧化應激狀態，為防止發生氧化損傷，腫瘤細胞需增強清除ROS的能力，因此，多數腫瘤細胞均易受到鐵死亡的影響[11]。鐵死亡通過去除環境中缺乏關鍵營養素或因感染或環境壓力而受損的細胞，在腫瘤發生中具有關鍵作用[5]。近年來，許多研究揭示了鐵死亡相關基因在腫瘤中的作用機制，也使鐵死亡相關基因的分子預后價值受到了關注。

本研究通過生物信息學的分析，首次構建了基于鐵死亡相關基因的結腸癌分子預后模型，差異表達分析結果顯示，結腸癌組織中有72個失調表達的鐵死亡相關基因，主要參與了鐵死亡、癌相關的中心碳代謝、P53信號途徑以及其他與腫瘤相關的信號通路，提示這些失調表達的鐵死亡相關基因可能參與了結腸癌的發生與進展。本研究構建的基于鐵死亡基因結腸癌分子預后模型基于4個鐵死亡相關基因，即DRD4、TFAP2C、ENPP2和CAV1。這些基因在鐵死亡相關信號途徑中發揮了重要的作用。JIANG等[12]發現，TFAP2C基因在轉錄水平增加列腺癌相關轉錄物1 (PCAT1)表達，PCAT1可減少鐵積累和氧化損傷反應激活SLC7A11表達，從而抑制鐵死亡。機制分析結果顯示，TFAP2C可誘導PCAT1 通過原癌基因MYC編碼的轉錄因子/微小RNA-25-3p/SLC7A11信號阻斷鐵死亡促進癌細胞耐藥。ENPP2是一種參與脂質代謝的脂質激酶，ENPP2基因表達可調節其他鐵死亡相關基因——GPX4、ACSL4、NRF2的表達，從而增強了細胞中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶存活信號保護心肌細胞免受Erastin誘導的鐵死亡[13]。LU等[14]指出，CAV1基因表達水平與ROS呈負相關，因此,CAV1是鐵死亡途徑的重要抑制因子之一。CAV1 在頭頸癌組織中過表達抑制了鐵死亡過程，導致腫瘤細胞的侵襲性表型[14]。表明這些基因在與鐵死亡相關的癌癥途徑中均發揮了重要作用，可作為潛在的分子標志物。

本研究將結腸癌患者分為高、低風險組，兩組患者差異基因均主要富集于免疫相關通路中，在免疫檢查點和m6A相關基因方面存在明顯差異。有研究表明，在鐵死亡過程中SLC7A11 的轉錄調控發揮了重要作用[15]。免疫檢查點，如CD44基因則可通過增強SLC7A11的穩定性表達，從而降低癌細胞對氧化應激和鐵死亡的敏感性[15]。在TYRO3表達的腫瘤細胞中，TYRO3基因可協同調節鐵死亡基因——SLC3A2的表達，抑制抗 PD-1/PD-L1引發的鐵死亡，并降低 M1/M2巨噬細胞比率，促進腫瘤微環境的發展[16]。本研究高風險組患者顯示著免疫檢查點的高評分。有學者認為，腫瘤細胞能利用被激活的免疫檢查點通路實現免疫逃避，促進腫瘤的惡化[8]。在分子途徑方面，免疫檢查點分子，如CTLA4、PD-1均可向T淋巴細胞發送信號，調節效應T淋巴細胞反應。T淋巴細胞可通過誘導腫瘤細胞鐵死亡消除腫瘤細胞[17]。T淋巴細胞衍生的γ-干擾素可通過調節鐵死亡基因——ACSL4的表達改變腫瘤細胞脂質代謝，并與花生四烯酸結合誘導免疫原性腫瘤鐵死亡，作為CD8+T淋巴細胞介導腫瘤殺傷的一種作用方式[18]。本研究結果也表明了鐵死亡與m6A修飾存在重要聯系。SHEN等[19]研究表明，暴露于鐵死亡誘導劑后由于甲基化酶METTL4水平明顯上調，去甲基化酶FTO明顯下調，肝細胞中m6A修飾的水平明顯增加。機制分析結果顯示，m6A修飾上調BECN1 mRNA增強了自噬性鐵蛋白降解，并最終導致鐵死亡。XU等[20]指出，METTL3介導的m6A修飾可穩定SLC7A11轉錄并促進其翻譯，從而抑制細胞鐵死亡，促進癌細胞增殖。此外，微小RNA -4443可通過調節FSP1 m6A修飾介導的細胞鐵死亡，誘導非小細胞肺癌細胞產生順鉑耐藥的表型[21]。因此，鐵死亡與免疫檢查點和m6A修飾均存在重要的聯系。有學者認為，調節鐵死亡可能是一種潛在的腫瘤治療策略[22]。本研究結果還分析了鐵死亡相關基因與其他多種免疫基因表達的關系，雖然尚缺乏文獻報道，但需大樣本實驗加以驗證。

本研究高風險組患者總體預后較差，或許是由于高、低風險組鐵死亡基因表達的差異，引起上述多種免疫檢查點和免疫相關基因的差異表達所致。此外，在ssGESA分析中還發現，高、低風險組患者免疫細胞刺激/抑制狀態、免疫T淋巴細胞效應方面均存在差異，可能由于鐵死亡基因的表達不同，通過調節體內激活劑或抑制劑進而調控腫瘤細胞的鐵死亡，也導致了患者預后的差異[23]。

綜上所述，成功構建了基于鐵死亡基因結腸癌分子預后模型。與TNM分期比較，具有較好的預測患者3、5生存率的能力，有望為結腸癌患者個性化治療和預后評估提供新參考。DRD4、TFAP2C、ENPP2、CAV1 4個鐵死亡相關基因有望成為結腸癌的新型預后分子標志物。