雞蛋中喹諾酮類獸藥殘留及檢測方法

李 婷

（固安縣農業農村局 065500）

隨著畜牧業的現代化、集約化和規模化生產。獸藥(包括獸藥添加劑)在降低發病率與死亡率、提高飼料利用率、促生長和改善產品品質方面起到十分顯著的作用，已成為現代畜牧業不可缺少的物質基礎。

喹諾酮類是一類人工合成抗菌藥物，此類藥物對多種革蘭陰性菌有殺菌作用，廣泛用于泌尿生殖系統疾病、胃腸疾病，以及呼吸道、皮膚組織的革蘭陰性細菌感染的治療。

1 喹諾酮類獸藥殘留產生原因

在實際的養殖過程中，獸藥及獸藥添加劑的安全合理使用，在降低畜禽發病率與死亡率、提高飼料利用率、促進畜禽生長和改善肉質方面起到十分顯著的作用。但因有些養殖戶過分追求藥效或更高的經濟利益，未按規定使用獸藥或沒有按照規范使用獸藥。

2 喹諾酮類獸藥殘留的危害

喹諾酮類獸藥殘留會引起惡心、嘔吐、疼痛等胃腸道不適；也會引起頭痛、頭暈、睡眠不良等癥狀。人類長期食用含較低濃度的動物性食品，容易誘導耐藥性的傳遞，從而影響該類藥物的臨床療效 。我國于2002 年規定了環丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸和氟甲喹等7 種QNs藥物在動物肌肉組織中的最高殘留限量為10～500μg/kg。產蛋雞禁用氟喹諾酮類獸藥。

3 檢測方法

喹諾酮類獸藥殘留的檢測方法有很多。主要有酶聯免疫法、高效液相色譜法、液相色譜--質譜分析法。最廣泛使用的方法是酶聯免疫法。

3.1 酶聯免疫吸附法

喹諾酮類酶聯免疫試劑盒（ELISA 試劑盒）具有方便、快速、靈敏等特點，特別適合大批量樣品篩查。其原理是樣品中氟喹諾酮類藥物與酶標板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標記物，催化底物顯色，根據顯色的深淺來判斷樣品中喹諾酮類藥物的含量。但此法的缺點是檢測結果是氟喹諾酮類藥物的量，只能作為初篩。

ELISA 試劑盒的性能指標從靈敏度、精密度、特異性、準確度、穩定性幾方面保證檢測的準確。靈敏度體現在兩個方面，一方面是檢出限：檢出目標物質的最低量的能力。另一方面是陽性檢出率：對大量樣品中陽性檢出的能力。精密度是指對同一樣本重復檢測時，每次檢測結果與平均值得接近程度。常用變異系數來表示。影響精密度的因素有：試劑的質量、實驗環境、操作者的水平。特異性常用通過與相應的物質進行交叉反應試驗來確定的。準確度是靈敏度和特異性的綜合指標。準確度是試劑盒質量好壞的關鍵。穩定度是指試劑盒在有效期內和規定條件下保持其性能的能力。

喹諾酮的酶聯免疫試劑盒因生產廠家不同，其操作步驟也不同。其操作大致有以下幾個步驟：樣品前處理：經過一系列處理之后，制成待檢樣液。a.將標準品工作液和待檢液加入酶標板的孔中。b.加入沒標記物工作液，抗體工作液，避光反應。c.經過反應后，樣品中的喹諾酮就會吸附在酶標板上，洗板，洗掉多余的物質。d.加入底物，催化反應顯色，加入終止液，上酶標儀檢測。

3.2 高效液相色譜法

3.2.1 方法原理

根據分析物質在固定相和流動相之間的分配系數的不同達到分離目的，并將分析物質的濃度轉化成信號被記錄下來的方法。其原理是勻漿后的雞蛋樣品經提取液提取后，用正己烷脫脂，再經過C18固相萃取柱進一步凈化，再用溶劑洗脫，洗脫液在高效液相色譜儀上檢測得到圖譜，進而計算出最終檢測結果。

3.2.2 優缺點

優點是分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高，操作自動化，應用范圍廣。

缺點是分析成本高，液相色譜儀價格及日常維護費用貴，受耗材質量影響較大。

3.2.3 常見問題

3.2.3.1 分離度差，色譜峰不正常

（1）流動相比例不合適

流動相的特點：對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在色譜柱中；流動相與樣品不產生化學反應；流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡；流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應；在流動相配制好后，一定要進行脫氣。

流動相的作用：樣品被固定相(柱子填料)吸附以后，在流動相洗脫過程中，樣品的極性不同，在流動相中溶解的濃度也不同，有的可以互溶，有的不容，有的有一定溶解度。從而達到分離效果。

流動相各組分濃度及相應比例，直接影響檢測結果。雞蛋中氟喹諾酮的測定所用的流動+相是mol/L/磷酸/三乙胺——乙腈，其比例是81+19（V/V）。當流動相的無機相和有機相比例不合適，會出現待檢物的各組分分離度差，有時也會出現不正常的色譜峰。

（2）流動相變質

流動相分為無機相和有機相。無機相即無機溶液一般為水、鹽類溶液等；有機相即有機溶劑常見有乙腈、甲醇等。有機溶劑必須為色譜級溶劑，其性能穩定、無雜質、可長期保存。但無機溶液因易變質，不能長期保存。當流動相變質時，會出現雜質峰影響目標峰，出現分離度差。也會出現目標峰不正常，或詭異峰型。從而影響檢測結果。為避免此情況，流動相應現用現配。

（3）樣品雜質較多

當樣品在前處理時提取凈化過程中，凈化不完全。或者樣品本身基質復雜。其最終洗脫液上高校色譜儀時，雜質也會由信號轉化成色譜峰出現在色譜圖中。當雜質峰恰巧與目標峰出峰時間很接近的時候，雜質峰和目標峰會連續出峰。就會出現雜質峰和目標峰分不開的現象。為了避免此種情況，可在樣品提取凈化時，凈化完全。若是樣品本身基質的原因，可適當調整流動相比例，使其雜質峰和目標峰分離。

（4）標準物質污染

標準物質是一種已經確定了具有一個或多個足夠均勻的特性值的物質或材料，作為分析測量行業中的“量具”。其實就是一種計量標準。標準物質必須具有特性量值的準確性、均勻性、穩定性。可份為一級標準物質和二級標準物質。在試劑檢測工作中，應根據實際情況選擇標準物質。

為了檢測結果具有溯源性，應選擇使用有證標準物質，即附有證書的標準物質。認定證書中給出的認定特性值具有溯源性，因為，該值是通過建立了溯源性的嚴格測量程序測定的，所以保證了認定值溯源到準確復現的表示該值的測量單位。認定特性值必須都附有給定置信水平下的測量不確定度。

當作為標準的標準物質被污染時，樣品檢測后的結果經污染后標準物質的數值校準后，檢測結果就會與本來的真值出現誤差，從而造成檢測結果不準確。若被污染后的標準物質雜峰影響目標峰，就會出現色譜峰分離度差，或影響回收率。

在日常檢測工作中，應避免標準物質污染，應嚴格按照要求保存標準物質，并定期對標準物質進行期間核查。

3.2.3.2 目標峰不出峰

（1）色譜柱損壞

液相色譜柱通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為填料，或是在硅膠表面鍵合-CN，-NH3 等官能團的鍵合相硅膠柱，正相柱極性強，洗脫順序由弱到強。反相柱填料主要以硅膠為基質，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團。反相柱極性弱，洗脫順序由強到弱。常用的反相柱有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）。雞蛋中氟喹諾酮的測定所用到的色譜柱為C18色譜柱。

若使用不當或色譜柱使用時間過長，色譜柱就會損壞。因此就會出現目標物不出峰的現象。

通常色譜柱在正確使用時壽命是2 年。但在日常使用時，正確使用和日常維護十分重要。首先要避免壓力和溫度急劇的變化；應逐漸改變溶劑組分的濃度；流動相的PH 值要適宜；液相色譜儀長時間不用時，應使用有機溶劑將色譜柱封柱。

（2）試劑影響

樣品前處理過程中或者配制流動相時會用到的很多試劑，試劑的品種和級別很重要。試劑一般分為普通級、分析純、色譜純。必須按照國家標準中要求的品種和級別，使用試劑。尤其是高效液相色譜儀上直接使用的試劑必須為色譜純。若試劑質量不好、超過有效期等因素的影響，會造成目標物不出峰。

如：雞蛋中氟喹諾酮的測定中樣品提取中用的提取溶劑為磷酸鹽，若磷酸二氫鉀的質量有問題，其雞蛋中的氟喹諾酮該目標物就提取不出來或者提取量較小。自然圖譜上就不會出現目標峰。配置流動相用的磷酸/三乙胺溶液或乙腈出現問題，就會影響目標峰。

日常工作中，應分類、分區保管試劑，并定期查看試劑的性狀、有效期等。

（3）固相萃取柱的影響

固相萃取柱（SPE）是從層析柱發展而來的一種用于萃取、分離、濃縮的樣品前處理裝置。SPE 是利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理。較常用的方法是使液體樣品溶液通過吸附劑，保留其中被測物質，再選用適當強度溶劑沖去雜質，然后用少量溶劑迅速洗脫被測物質，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的。

SPE 固相萃取柱的填料通常是色譜吸附劑，可分為三大類：第一類是以硅膠為基質（例如C18、C8等）；第二類是以高聚物為基質；第三類是以無機材料為基質。雞蛋中氟喹諾酮的測定所用到的固相萃取柱就是C18柱。

樣品基質通常都較為復雜，若固相萃取柱的填充料不吸附其目標物，或者吸附量較小。其洗脫后的樣液經高效液相色譜儀檢測，就會出現目標物不出峰或者回收率低的現象。有時固相萃取吸附劑對目標化合物吸附的同時，也會吸附同類性質的雜質，在載樣的過程中就有可能部分目標化合物不能被吸附，造成對檢測結果有影響。