Foxp3/SMARCE1信號軸促進宮頸癌細胞侵襲和遷移

龍嘉莉，劉曙光，馬紅梅，曾超

(中山大學附屬第八醫院病理科，廣東 深圳 518033)

目前，宮頸癌仍是婦女癌癥相關死亡的主要原因。雖然近年來宮頸癌在全世界的發病率已顯著下降，但其死亡率在發展中國家仍在增加。一般來說，早期宮頸癌患者治療后的5年生存率可達90%以上，而中晚期患者的5年生存率不到30%[1]。因此，找到驅動宮頸癌進展的因素尤為重要。本團隊前期實驗研究[2]發現，隨著宮頸病變級別的增加，叉頭樣轉錄因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)表達強度和陽性率增加，證實Foxp3在宮頸癌的進展過程中起著重要作用。為進一步探究Foxp3對宮頸癌生物學行為的影響及分子調控機制，本實驗采用基因芯片篩選出Foxp3下游基因SMARCE1，并證實Foxp3調控SMARCE1促進宮頸癌Hela細胞的侵襲和遷移。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌Hela細胞系由本實驗室保存。DMEM培養基、10%胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000均購自美國賽默飛公司；蛋白濃度測量試劑盒購自上海碧云天公司；一抗兔抗人單克隆抗體Foxp3、SMARCE1購自美國Abcam公司；兔多抗GAPDH購自杭州賢至生物公司；HRP標記羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；Transwell小室購自美國康寧公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染 宮頸癌Hela細胞采用含10%胎牛血清及1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI-1640培養基進行培養，置于37 ℃，5% CO2培養箱中。將生長狀態良好、匯合度為85%左右的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。Foxp3 shRNA序列為：

CCTCCAGAGAGAGATGGTA，質粒表達載體由上海吉瑪公司合成。Foxp3 shRNA配套的陰性對照質粒的Hela細胞作為對照組。利用從Hela細胞中提取的mRNA，通過逆轉錄聚合酶鏈反應擴增人Foxp3全長cDNA。引物序列設計如下：

Foxp3-F:5-′TGGTACCGAGCTCGCCACCATGCCCACCAGGCCTGGCAAG-3′；

Foxp3-R:5-′GATATCTGCAGAATTCTCAGGGGCCAGGTGTAGGGTTG-3′。將Foxp3 DNA片段克隆入pcDNA3.1構建重組pcDNA3.1-Foxp3質粒。取對數生長期的Hela細胞進行轉染，按照脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000說明書轉染干擾或過表達質粒表達載體，轉染對應的空質粒的Hela細胞作為對照組。

1.2.2 Western blot(WB)實驗 轉染后繼續培養48 h后采用WB法檢測Hela細胞中Foxp3的表達情況。采用BCA試劑盒進行蛋白定量，使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉膜、5%脫脂奶粉封閉后使用1∶1 000稀釋后的一抗過夜孵育，選擇HRP標記的二抗標記后采用ECL發光試劑盒顯影后采用Bio-Rad凝膠成像系統檢測染色條帶的強度，計算目的蛋白和內參蛋白的光密度比值。

1.2.3 細胞遷移和侵襲實驗 取轉染24 h的后的Hela細胞，用0.25%胰蛋白酶消化收集，無血清培養基調整細胞密度為3×105個/mL備用。在24孔板中預先加入1 mL的DMEM完全培養基(含雙抗)，并放入Transwell小室，1 h后在Transwell上室分別接入200 μL各組細胞懸液，37 ℃，5% CO2培養箱培養24 h。培養完成后，取出Transwell，固定、清洗后染色，于顯微鏡下觀察拍照。侵襲實驗需制備帶Matrigel膠的Transwell上室，余步驟同遷移實驗。

1.2.4 生物信息分析 基因芯片分析Hela細胞敲低Foxp3表達后的差異表達基因。生物信息分析由上海GENECHEM公司進行。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件分析數據。兩組間比較用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染效率

采用WB法觀察Foxp3 shRNA轉染Hela細胞的Foxp3表達情況。結果顯示，Foxp3 shRNA轉染組的Hela細胞中Foxp3蛋白表達比對照組下降(P<0.05)。見圖1。

2.2 Foxp3 shRNA轉染后對細胞遷移能力的影響

Transwell遷移實驗結果表明，轉染Foxp3 shRNA的Hela細胞遷移細胞數量較對照組Hela細胞細胞遷移數量少(P<0.05)。見圖2。

2.3 Foxp3 shRNA轉染后對宮頸癌Hela細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結果表明，轉染Foxp3 shRNA的Hela細胞侵襲細胞數量較對照組Hela細胞細胞侵襲數量少(P<0.05)。見圖3。

2.4 SMARCE1是Foxp3下游表達相關基因

采用基因芯片技術尋找Foxp3下游基因。通過shRNA敲除Hela細胞中Foxp3的表達后，發現1 427個基因上調，1 511個基因下調，其中包括SMARCE1。見圖4。

2.5 Foxp3 shRNA轉染后宮頸癌Hela細胞SMARCE1表達下調

WB驗證Foxp3 shRNA轉染后Hela細胞中SMARCE1的表達情況。WB顯示，轉染Foxp3 shRNA后，與對照組相比，SMARCE1蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖5。

2.6 Foxp3 shRNA和轉染SMARCE1質粒共轉染后宮頸癌Hela細胞遷移情況

Transwell遷移實驗表明，共轉染Foxp3 shRNA和SMARCE1質粒組的細胞較共轉染Foxp3 shRNA和pcDNA3.1空質粒組細胞遷移數量多(P<0.05)。見圖6。

2.7 Foxp3 shRNA和轉染SMARCE1質粒共轉染后宮頸癌Hela細胞侵襲情況

Transwell侵襲實驗表明，共轉染Foxp3 shRNA和SMARCE1質粒組的細胞較共轉染Foxp3 shRNA和pcDNA3.1空質粒組細胞侵襲數量多(P<0.05)。見圖7。

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，近年來更有向年輕化發展的趨勢。宮頸癌的發生、發展是一個多基因改變且多步驟的復雜過程，因此，探討宮頸癌發生發展過程中的分子機制，尋找有效分子的靶向治療方法，將對加強和促進宮頸癌的防治工作提供實驗研究的基礎。

最新研究[3]表明，除了T細胞譜系之外，Foxp3在一系列癌癥中表達，包括卵巢[4]、肺[5]和前列腺癌。然而，Foxp3對癌癥的影響非常有爭議。在結腸直腸癌[6]、黑色素瘤[7]和肺癌[8]中，高水平的Foxp3提示與不良的預后有關。相反，高水平的Foxp3卻有利于乳腺癌的預后[9]。本團隊前期實驗發現，隨著宮頸病變級別的增加，Foxp3表達強度和陽性率增加，提示Foxp3可能在宮頸病變組織水平的分化和生長中發揮重要作用[2]。研究組進一步證實，Foxp3通過外源敲低Foxp3表達抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲。染色質重塑對于全身性生理穩態是必不可少的。染色質重塑的異常通常導致癌癥的發生和發展[10]。因此，在許多類型的癌癥中經常觀察到參與染色質重塑的基因突變[11]。SMARCE1是SWI/SNF染色質重塑復合物的組分，通過以ATP依賴性方式改變核小體內的DNA-組蛋白觸點而改變染色質結構[12]。證據[13-15]表明，較高的SMARCE1表達與乳腺癌、胃癌和卵巢癌的預后相關，SMARCE1可以作為預測癌細胞侵襲和遷移能力的指標。在本研究中，課題組通過基因芯片分析，篩選出SMARCE1作為宮頸癌細胞中Foxp3的下游差異表達基因。此外，SMARCE1的過表達可以拮抗Foxp3敲低介導的宮頸癌細胞遷移和侵襲的抑制，表明SMARCE1至少部分促進Foxp3介導的遷移和宮頸癌細胞的侵襲。這是首次提出SMARCE1可作為Foxp3下游作用基因，并揭示了SMARCE1調節對Foxp3在宮頸癌中的致癌作用的功能意義。

綜上，Foxp3可調控下游SMARCE1促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲，該結果對Foxp3在宮頸癌中的致癌功能提供了新線索，這表明Foxp3/SMARCE1信號軸可能是宮頸癌進展的新途徑。