高三尖杉酯堿通過抑制 ERK1/2 信號通路逆轉卵巢癌細胞順鉑耐藥的研究

程琛，楊建，秦公照，具晟

(1.南京醫科大學附屬蘇州醫院婦科，江蘇 蘇州 215002；2.蘇州大學附屬第一醫院胸外科，江蘇 蘇州 215001)

卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，病死率較高，以順鉑(cisplatin，DDP)為基礎的化療是目前臨床上常用的治療手段之一，但長期使用DDP會引起耐藥問題，尋找有效方法改善順鉑耐藥可有效改善治療效果[1]。高三尖杉酯堿(homoharringtonine，HHT)最初提取自海南三尖杉，用于治療白血病，改善白血病耐藥[2]。有研究[3-4]顯示，HHT對鼻咽癌、肝癌等腫瘤有抑制功效，可促進細胞凋亡并抑制細胞增殖。ERK是MAPK家族中發現較早的成員，其包括ERK1、ERK2等異構體，參與細胞增殖、分化、凋亡等多個生理過程的調控[5]。文獻[6]表明，ERK1/2 信號在腫瘤中過度激活，抑制ERK1/2 信號可降低卵巢癌細胞增殖能力。HHT通過抑制ERK1/2 逆轉黑色素瘤耐藥[7]。目前尚未發現HHT對卵巢癌耐藥的作用和影響機制的相關研究。本研究旨在探討HHT調控ERK1/2 信號對卵巢癌細胞DDP耐藥的影響，為臨床改善卵巢癌DDP耐藥，明確HHT抗腫瘤機制提供思路和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢癌細胞A2780(美國ATCC)；ERK1/2信號激活劑isoproterenol hydrochloride(ISO)(美國Sigma)；兔抗Bax一抗(武漢菲恩生物科技有限公司)；兔抗Bcl-2一抗(美國ABclonal)；兔抗ERK1/2一抗、兔抗p-ERK1/2一抗(美國Santa Cruz Biotechnology)；ERK1/2信號抑制劑PD98059(美國MedChemExpress)；HHT(規格：25 mg，純度：≥98.0%，成都普思生物科技股份有限公司)；胎牛血清(美國GIBCO)；DDP(美國Sigma)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 卵巢癌細胞A2780培養在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，采用DDP濃度梯度法培養DDP耐藥卵巢癌細胞A2780/DPP，建立耐藥細胞株A2780/DPP[8]。在耐藥細胞培養時添加2 nmol/L的DDP，用來維持細胞耐藥性，培養箱的細胞培養參數為37 ℃，5% CO2。

1.2.2 實驗分組 卵巢癌細胞A2780/DPP分為對照組、DDP組、HHT組、聯合組、ERK1/2抑制劑組、DDP+ERK1/2抑制劑組、ERK1/2激活劑組、聯合+ERK1/2激活劑組。對照組細胞正常培養；DDP組細胞用80 μmol/L的DDP處理；HHT組細胞用2 μmol/L的HTT處理；聯合組細胞用80 μmol/L的DDP和2 μmol/L的HTT聯合處理；ERK1/2抑制劑組細胞用25 μmol/L[9]的ERK1/2信號抑制劑PD98059處理；DDP+ERK1/2抑制劑組細胞用80 μmol/L的DDP和25 μmol/L的ERK1/2信號抑制劑PD98059處理；ERK1/2激活劑組細胞用20 μmol/L[10]的ERK1/2信號激活劑ISO處理；聯合+ERK1/2激活劑組細胞用80 μmol/L的DDP、2 μmol/L的HTT、20 μmol/L的ERK1/2信號激活劑ISO處理。各組細胞從實驗0 h開始處理，48 h后，進行相關實驗檢測。

1.2.3 CCK-8實驗檢測細胞增殖 卵巢癌細胞A2780/DPP種植到96孔板內，每孔接種1×104個細胞，細胞貼壁以后，進行分組處理，每組設置3個復孔，并設置空白組，即孔內不添加細胞。48 h后，使用CCK-8試劑盒測定細胞存活率。細胞存活率=[(實驗組OD-空白組OD)÷(對照組OD-空白組OD)]×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 卵巢癌細胞A2780/DPP種植到6孔板內，每個孔中接種1×105個細胞，細胞貼壁后，進行細胞分組，48 h后，收集細胞(每個檢測樣本收集1×106個細胞)，2 000 g離心10 min，PBS洗滌細胞兩次，用500 μL的結合緩沖液懸浮細胞，依次加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI，在室溫條件下避光孵育15 min，上流式細胞儀測定。Annexin V-FITC激發波長488 nm，發射波長525 nm，PI激發波長535 nm，發射波長615 nm。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達 卵巢癌細胞A2780/DPP種植到6孔板內，每個孔中接種1×105個細胞，細胞貼壁后，進行細胞分組，48 h后，收集細胞，添加500 μL的細胞裂解液，放在冰上孵育60 min，4 ℃、12 000 g、離心10 min，吸取上清，經過比辛酸(Bisoctanoic acid，BCA)方法測定蛋白濃度。將蛋白與5×Loading Buffer混合煮沸5 min。進行SDS-PAGE凝膠電泳，在濃縮膠中利用80 V的電壓電泳，在分離膠中使用120 V的電壓電泳，200 mA轉膜1.5 h。將PVDF膜置于50 g/L的脫脂奶粉中，室溫結合1.5 h，然后放在一抗稀釋液(Bax、Bcl-2、ERK1/2一抗按照1∶1 000稀釋，p-ERK1/2一抗按照1∶600稀釋)，4 ℃孵育過夜。再將PVDF膜放在二抗溶液(1∶4 000稀釋)中，室溫孵育1 h。使用ECL化學發光試劑盒分析目標蛋白。以β-actin作為內參，Image J掃描條帶的灰度，根據條帶的灰度值，計算目的蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HHT和DDP聯合作用誘導卵巢癌細胞A2780/DPP凋亡

與對照組比較，DDP和HTT組卵巢癌細胞A2780/DPP存活率、凋亡率及凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2表達無統計學差異(P>0.05)；聯合組卵巢癌細胞A2780/DPP存活率降低；凋亡率明顯升高；促凋蛋白Bax表達增多；抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 HHT和DDP聯合作用可抑制卵巢癌細胞A2780/DPP中ERK1/2信號通路激活

與對照組比較，DDP組和HTT組卵巢癌細胞A2780/DPP中p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；聯合組卵巢癌細胞A2780/DPP中p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 抑制ERK1/2信號可改善卵巢癌細胞A2780/DPP耐藥

與對照組比較，DDP組卵巢癌細胞A2780/DPP細胞存活率、凋亡率及p-ERK1/2/ERK1/2、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；ERK1/2抑制劑組存活率降低；凋亡率增加；p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達減少；Bax蛋白表達增多；Bcl-2蛋白表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組、DDP組、ERK1/2抑制劑組比較，DDP+ERK1/2抑制劑組細胞存活率降低；凋亡率增加；p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達減少；Bax蛋白表達增多(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 激活ERK1/2信號對HTT影響卵巢癌細胞A2780/DPP耐藥的逆轉作用

與對照組比較，聯合組卵巢癌細胞A2780/DPP細胞存活率降低，凋亡率增多，p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增多，Bcl-2蛋白表達減少，差異有統計學意義(P<0.05)；ERK1/2激活劑組細胞存活率升高，凋亡率減少，p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達增多，Bax蛋白表達減少，Bcl-2蛋白表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)。與聯合組比較，聯合+ERK1/2激活劑組卵巢癌細胞A2780/DPP細胞存活率升高，凋亡率減少，p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達增多，Bax蛋白表達減少，Bcl-2蛋白表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

化療是卵巢癌治療的常見手段，而卵巢癌細胞產生化療藥物耐藥是導致卵巢癌患者治愈率低的關鍵因素之一。DDP作為卵巢癌化療常見藥物，很多患者在治療初期對DDP敏感，但最終產生DDP耐藥，積極尋找有效方法改善卵巢癌DDP耐藥有重要意義[11]。HHT存在于三尖杉屬植物如三尖杉、海南粗榧中，臨床上多用于治療白血病[12]。有研究[13]顯示，HHT不僅對血液腫瘤有良好的抑制效果，還可以抑制鼻咽癌細胞增殖，誘導胃癌細胞凋亡。HHT逆轉黑色素瘤細胞耐藥[7]。本研究顯示，單獨使用DDP或HHT對卵巢癌細胞A2780/DPP增殖影響不明顯(P>0.05)，聯合使用DDP和HHT可明顯下調卵巢癌細胞A2780/DPP增殖活性(P<0.05)，提示HHT可逆轉卵巢癌細胞A2780/DPP耐藥。

腫瘤細胞凋亡減少對腫瘤快速增長具有重要意義，細胞凋亡涉及多個基因、信號通路、蛋白等的表達調控作用。其中Bcl-2蛋白家族成員較多，包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，分別在細胞凋亡過程中發揮誘導和抑制功效，Bax屬于促凋亡蛋白而Bcl-2屬于抗凋亡蛋白[14]。本研究發現，單獨使用DDP或HHT對卵巢癌細胞A2780/DPP凋亡影響不明顯(P>0.05)，DDP和HHT聯合作用后卵巢癌細胞A2780/DPP凋亡率明顯提高(P<0.05)，且Bax蛋白表達增多(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達減少(P<0.05)，說明HHT和DDP有協同促癌細胞凋亡的功效，進一步證明了HHT有逆轉卵巢癌細胞A2780/DPP耐藥的作用。MAPK是經典的信號通路，包括ERK等亞家族，ERK激活后進入細胞核，影響多種轉錄因子的活性，其中ERK1/2研究較多[15]。ERK1/2在腫瘤中發揮多種作用，不僅與細胞生長、凋亡等有關，還參與腫瘤耐藥過程，ERK1/2激活誘發腫瘤獲得性耐藥，導致細胞不可控生長，促進免疫逃逸，降低藥物敏感性[16]。文獻[17]證實，ERK1/2在腫瘤中過度磷酸化，可誘導卵巢癌生長。本研究發現，HHT和DDP聯合使用可誘導卵巢癌細胞A2780/DPP中p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達減少，并且ERK1/2信號抑制劑可逆轉卵巢癌細胞A2780/DPP耐藥，增加細胞凋亡，HHT作用機制可能與ERK1/2信號有關。進一步通過逆轉實驗驗證顯示，ERK1/2信號激活劑逆轉HHT對卵巢癌細胞A2780/DPP耐藥作用，說明HHT能夠通過抑制ERK1/2信號逆轉卵巢癌細胞A2780/DPP耐藥。

綜上，HHT對卵巢癌細胞A2780/DPP耐藥有改善作用，機制可能與抑制ERK1/2信號有關，對卵巢癌DDP耐藥臨床治療有重要意義。