數字PCR技術在晚期肺腺癌患者血漿ctDNA EGFR基因突變檢測中的應用初探

彭韻霖，唐中，方莉

(川北醫學院附屬醫院，1.產前診斷中心；2.檢驗科；3.川北醫學院醫學檢驗系，四川 南充 637000)

在精準醫療大背景下，晚期肺腺癌患者的治療手段已經從傳統的放化療過渡到靶向治療[1]，即針對特定靶點進行治療。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是癌癥的重要驅動因子，EGFR蛋白酪氨酸激酶功能與腫瘤細胞增殖、血管生成等密切相關。因此在治療前應明確EGFR基因突變狀態，再采用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine-kinase inhibitor，TKI)進行治療。既往研究結果顯示，應用TKI可改善患者的無進展生存時間(progression-free survival，PFS)，但部分患者在EGFR-TKI治療10個月后產生耐藥性。研究[2-3]顯示，耐藥患者中，約50%存在EGFR基因20號外顯子第790位點突變(即T790M基因突變)，這是EGFR對TKI耐藥最主要的機制，其中19-del外顯子缺失突變和21外顯子L858R點突變是EGPR突變中最常見的兩種亞型。明確患者EGFR基因突變狀態，并在治療過程中監測T790M耐藥突變基因的出現，是晚期肺腺癌患者靶向治療的關鍵。

臨床采用血漿循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)進行EGFR基因突變檢測，具有侵襲力低、反復獲取等優勢。但ctDNA在血漿中含量極微，因此迫切需要高靈敏度的檢測方法來檢測血漿ctDNA中的EGFR基因突變狀態[4]。目前研究[5-8]顯示，Super-ARMS PCR 具有較高的特異度，但其靈敏度相對較低，假陰率較高。據2016年全國ctDNA基因突變檢測室間質量評價調查活動結果報告顯示，采用二代測序(next-generation sequencing，NGS)法的實驗室結果符合率為79.1%、ARMS-PCR符合率為78.6%，而采用數字PCR的實驗室符合率為100%。因此，應用數字PCR檢測可明顯提高ctDNA基因突變的檢出率。但既往研究多采用微滴數字PCR對EGFR基因突變狀態進行檢測，僅可檢測突變豐度為0.001%的突變樣本[9-10]。既往研究[11]采用芯片式數字PCR對使用EGFR-TKI的患者進行耐藥突變T790M的監測，其相比于NGS具有更高的靈敏度。本研究應用基于芯片的數字PCR產品，將樣本分為20 000個獨立的反應單元，分散于20 000個微孔集成在一張100 mm2的芯片上，在隔絕外部污染的密閉芯片中進行PCR擴增，通過芯片式數字PCR對晚期肺腺癌患者血漿ctDNA中EGFR基因突變情況進行檢測，借以驗證數字PCR在血漿EGFR基因突變檢測中的臨床可用性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例篩選 選取2017年7月至2017年12月于川北醫學院附屬醫院收治的26例按國際肺癌研究協會(IASLC)(第八版)肺癌TNM分期[12]確診為III～IV期肺腺癌患者為研究對象，患者年齡48～79歲，其余臨床資料包含性別、吸煙史等。患者均由病理活檢確診。本研究經院倫理委員會審核批準，患者及家屬知情同意。排除其他腫瘤疾病，且已經過靶向治療和新輔助化療患者。

1.1.2 主要儀器與耗材 PAXgene Blood ccfDNA Tube(德國Qiagen公司)、芯片式數字聚合酶鏈式反應(dPCR)分析系統(南京科維思公司)、迷你離心機、恒溫金屬浴、37 ℃水浴箱、Eppendorf臺式高速冷凍離心機(德國艾本德公司)、移液器(德國艾本德公司)、微型旋渦混勻器、QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen公司)、DNA Clean&Concentrator-5(Zymo Research公司)、EGFR基因 L858R突變檢測試劑盒(南京科維思公司)、EGFR基因19DEL突變檢測試劑盒(南京科維思公司)、無水乙醇、異丙醇。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 應用PAXgene Blood ccfDNA Tube采血管經肘正中靜脈收集患者外周血樣本10 mL，1 900×g低速離心15 min，分離血漿于-80 ℃冰箱凍存待用。

1.2.2 血漿ctDNA抽提 將血漿按QIAGEN公司QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取試劑說明提取血漿ctDNA，再采用DNA Clean&Concentrator-5濃縮提純DNA，OD260 nm /OD280 nm=1.8～2.0，放入-80 ℃冰箱凍存待用。

1.2.3 數字PCR實驗 (1)將所有試劑及樣本置于冰上融化，顛倒混勻、離心后置于管架上，同時將芯片上樣器打開預熱，配制L858R和19del反應混合液，總體積為14.5 μL，包含7.25 μL數字PCR反應液，0.72 μL EGFR基因19DEL突變檢測反應液，6.53 μL DNA樣本，每批樣本包含1個陰性質控品，1個陽性質控品。(2)反應芯片的制備：將數字PCR通用芯片和上樣槽安裝到芯片上樣器上，用移液器將14.5 μL反應混合液加入到上樣槽中。按下工作按鈕將反應混合液均勻的涂到數字PCR通用芯片上，將補液器安裝到芯片填充液前端，在芯片表面加入數滴芯片填充液，以覆蓋整個芯片表面，蓋上芯片密封蓋，按壓15 s，取下芯片組件，注入芯片填充液，將芯片密封好，并將其置于紫外燈下固化。(3)dPCR擴增：將制好的芯片按以下反應體系進行擴增：96 ℃ 10 min，60 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，39個循環；60 ℃ 2 min，1個循環；10 ℃，保溫待數據分析。(4)將芯片在dPCR擴增儀中放置10 min后從儀器中拿出，室溫避光靜置15 min，平衡溫度至室溫。平衡后的芯片依次放入dPCR分析儀中，識讀芯片唯一標識符并捕獲樣本所有反應孔FAM、VIC、ROX通道的熒光信號，ROX通道用于判斷是否有樣本存在，從而確定病例突變狀態。

1.2.4 陽性判斷標準 FAM陽性孔/(VIC陽性孔+FAM陽性孔)比值>0.1%為陽性，≤0.1%為陰性。

1.2.5 質量控制 陽性質控品的FAM陽性孔/(VIC陽性孔+FAM陽性孔)比值應>0.1%，陰性質控品FAM陽性孔/(VIC陽性孔+FAM陽性孔)比值應≤0.1%。

1.3 統計學分析

采用SPSS24.0軟件對數據進行分析與處理。計數資料以[n(%)]表示，采用Fisher確切概率法；相關性采用Pearson相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 數字PCR檢測血漿ctDNA EGFR基因突變結果

26例患者中，檢出基因突變6例，突變檢出率為23.1%，其中19del突變兩例，L858R突變3例，19del及L858R雙突變1例。見表1及圖1。

表1 數字PCR檢測EGFR基因19del、L858R突變結果

2.2 血漿ctDNA EGFR突變狀態與臨床特征的相關性

相關性分析顯示，EGFR基因突變與患者性別、年齡、吸煙史無相關性(P>0.05)，而腫瘤分期與EGFR基因突變狀態有相關性(P<0.05)。見表2。

表2 血漿ctDNA EGFR突變結果與臨床特征的關系[n(%)]

3 討論

EGFR基因是NSCLC的主要驅動基因，突變較易發生于亞裔、女性、腺癌、不吸煙或少吸煙的患者，分子靶向藥物TKI靶向治療可有效改善EGFR基因敏感突變攜帶者的預后[13-14]。19-del和L858R是EGFR最常見的敏感突變位點，19del突變患者臨床首選EGFR-TKI靶向治療，L858R突變患者臨床首選抗血管生成藥物聯合EGFR-TKI治療。ctDNA是一種可代替腫瘤組織檢測腫瘤特異性改變的樣本，其在取材安全無創、動態監測、不受腫瘤異質性的影響有著無可比擬的優勢，但其在循環系統中的豐度極低，易受到高濃度野生型血漿游離DNA的干擾，且呈高度片段化，因此需要靈敏度極高的方法對血漿EGFR基因突變進行檢測。

目前，EGFR檢測常見方法有ARMS法、聚合酶鏈反應技術或NGS技術等，這些檢測方法要么敏感度有限無法滿足臨床需求，要么操作復雜、技術難度高，成本高。數字PCR是一種可以通過分析血漿ctDNA對低頻突變檢測，從而確定NSCLC患者EGFR基因突變狀態，對比于常規ARMS法具有更高的靈敏度。芯片式數字PCR由于其整個擴增反應都在密閉的芯片中進行，相較于ddPCR減少了外界污染帶來的影響，同時其結果判讀簡單、直觀，更適于臨床工作人員使用，是目前CDFA唯一批準進入臨床檢測的數字PCR。

本研究基于具有高靈敏度的芯片式數字PCR法對26例未進行抗腫瘤治療的III～IV期肺腺癌患者進行血漿19-del和L858R突變位點檢測，共檢測出EGFR基因突變6例，突變率為0.11%～2.23%，其中L858R突變檢出率為15.4%(4/26)，19del突變檢出率為11.5%(3/26)，略低于Yung等[11]的結果，原因可能為本研究樣本量有限，結果可能存在偏倚；本研究患者與其存在結構異質性(如不同腫瘤分期患者比例不同)。

相關性分析顯示，EGFR基因突變狀態與患者性別、年齡、吸煙史無明顯相關性(P>0.05)，而腫瘤分期與EGFR基因突變狀態有相關性(P<0.05)，與Karachaliou等[15]的研究結果基本一致，可能是晚期EGFR基因突變狀態與腫瘤分期相關。目前研究[16]指出，在不考慮腫瘤組織EGFR基因突變狀態的晚期NSCLC患者中，對血漿ctDNA進行EGFR基因突變檢測，結合腫瘤分期顯示，IV期病例相較于III期患者血漿EGFR突變檢出率較高，可能是由于不同分期患者于血漿中釋放的ctDNA含量不同所致，進一步證實了血漿ctDNA EGFR基因突變檢出率可能與患者腫瘤分期有關。

本研究應用數字PCR對ctDNA EGFR突變等位基因和野生型等位基因進行絕對定量，突變EGFR/突變EGFR+野生型EGFR的濃度比值定義為EGFR突變豐度。EGFR突變患者中，僅兩例患者19-del突變陽性孔數>10，信號比值>1%，整體突變豐度水平較低。Yang等[17]研究指出，對于EGFR基因突變豐度>5.15%的患者采用EGFR-TKI具有更好的PFS。Yung等[11]研究顯示，NSCLC部分緩解和完全緩解的患者EGFR突變序列濃度降低，而疾病進展患者突變持續存在。研究提示，應用數字PCR技術不僅僅局限于指導靶向治療的用藥，還可基于數字PCR的絕對定量的優勢，檢測EGFR突變豐度，通過突變豐度及其變化預測NSCLC疾病的轉歸及EGFR-TKI的療效。

本實驗也存在一定不足：(1)由于樣本量的限制，結果可能存在偏倚；(2)無法排除由于技術操作、樣本因素所導致的假陰性結果；(3)雖然數字PCR設備已獲得CFDA批準上市，但迄今為止暫無CFDA批準的數字PCR檢測試劑盒；(4)由于檢測所需血漿樣本量較大，本實驗僅檢測了19del突變及L858R突變，未明確26例患者中是否存在原發性T790M耐藥，后續可在靶向用藥過程中采用芯片式數字PCR繼續隨訪患者T790M耐藥突變。

綜上，芯片式數字PCR在晚期肺腺癌患者的血漿ctDNA中可以檢出EGFR突變，可為臨床醫生進行治療決策提供一定的理論依據。