HPLC法測(cè)定壯西-11中大黃酚含量

秦 丹

呼倫貝爾市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000

蒙藥壯西-11是在壯西-10丸基礎(chǔ)之上改進(jìn)工藝，由奶制紅石膏、大黃、土木香、木香、訶子等十一味藥材組成的復(fù)方制劑[1]。具有消瘀、散結(jié)、理氣、通脈、消炎的作用，用于月經(jīng)不調(diào)、氣瘀、血瘀癥、盆腔炎、附件炎、膀胱炎等。方中君藥為奶制紅石膏，指標(biāo)成分不易控制，故選用臣藥大黃作為指標(biāo)成分[1]。大黃為蓼科植物掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、唐古特大黃(Rh.tanguticumMaxim.ex Balf.)或藥用大黃(Rh.officinaleBaill.)，具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃之功效[2]。現(xiàn)代研究證明，大黃藥理活性的主要成分為蒽醌類、蒽酮類、鞣質(zhì)、多糖等報(bào)道較多[3-4]。大黃蒽醌類衍生物主要包括蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚及大黃酸[5]。在壯西-10丸研究基礎(chǔ)之上，本制劑選擇大黃酚作為質(zhì)量控制指標(biāo)，并建立了測(cè)定壯西-11中大黃酚含量的高效液相色譜方法，專屬性強(qiáng)，更便于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695型液相色譜儀(2998 PDA Detector)、 UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)(島津儀器有限公司)。Sartorius BSA224S和BT 125D型電子天平，數(shù)顯恒溫水浴鍋，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 材料 大黃酚對(duì)照品(批號(hào)：110796-201922，純度99.4%)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；壯西-11由內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 參照2020年版《中國(guó)藥典》一部“大黃藥材含量測(cè)定”項(xiàng)下含量測(cè)定方法，最終選定的色譜條件為色譜柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液(90∶10);檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：0.8 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫：30 ℃，理論塔板數(shù)不低于3000[2,6]。色譜圖如圖1、圖2所示。

圖1 對(duì)照品溶液高效液相色譜圖

圖2 供試品溶液高效液相色譜圖

2.2 溶液制備方法 對(duì)照品溶液：取大黃酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL約含0.1 mg的溶液，即得。供試品溶液：參照2020年版《中國(guó)藥典》一部“大黃藥材含量測(cè)定”項(xiàng)下含量測(cè)定方法，將本品研細(xì)取約1.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加入10 mL鹽酸溶液(8%)，超聲處理2 min，再加入三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，取出，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，分取三氯甲烷層，剩余酸液再用三氯甲烷提取4次，10 mL/次，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[2,7]。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取大黃酚對(duì)照品約2.36 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻(0.0938 mg/mL)。精密吸取對(duì)照品溶液適量，以甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度為2.814 μg/mL、3.752 μg/mL、 5.628 μg/mL、6.566 μg/mL、7.504 μg/mL的系列溶液。按上述色譜條件，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，測(cè)得線性回歸方程Y=74220X-7454(R2=0.9997，n=10)。結(jié)果表明大黃酚質(zhì)量濃度在2.814～7.504 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取大黃酚對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值為1.23%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果表 (n=5)

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 制備供試品溶液，平行6份，記錄峰面積，結(jié)果樣品中大黃酚含量的RSD值為1.8%，顯示方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0 h、2.5 h、5 h、7.5 h、10 h、12.5 h、15 h依次進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果大黃酚峰面積的RSD值為0.74%。結(jié)果表明：供試品溶液在15 h穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表3。

表3 供試品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 取本品(大黃酚含量為0.216 mg/g)9份，每3份為1組，每一組精密加入大黃酚對(duì)照品溶液(0.1014 mg/mL)1 mL、1.3 mL、1.6 mL，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，大黃酚的加樣回收率結(jié)果良好。結(jié)果見表 4。

表4 大黃酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品含量測(cè)定 分別取3批壯西-11各約1.2 g，進(jìn)樣測(cè)定并記錄峰面積，計(jì)算制劑中大黃酚的含量，結(jié)果見表5。

表5 三批壯西-11中大黃酚的含量表

3 討論

3.1 流速考察 在流速分別為0.8 mL/min、1.0 mL/min，其余色譜條件不變，對(duì)供試品溶液進(jìn)樣考察。結(jié)果表明，供試品溶液中的大黃酚色譜峰在上述兩種流速下均能較好分離，但隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，流速為1.0 mL/min時(shí)柱壓偏高，0.8 mL/min，柱壓相對(duì)理想，且含量無明顯差異，選擇流速為0.8 mL/min。

3.2 提取效率的考察 試驗(yàn)中考察了甲醇加熱回流30 min、60 min、90 min不同提取時(shí)間對(duì)提取含量的影響，結(jié)果表明甲醇加熱回流提取60 min，大黃酚的含量基本穩(wěn)定不變，且高于加熱回流提取30 min及90 min時(shí)，故選擇甲醇加熱回流時(shí)間為60 min。

3.3 萃取次數(shù)的考察 試驗(yàn)中考察了三氯甲烷提取次數(shù)：2次、3次、4次、5次(10 mL/次)對(duì)提取含量的影響，結(jié)果表明三氯甲烷萃取5次與4次含量基本不變，且含量高于萃取3次，故選擇萃取次數(shù)為4次。

3.4 色譜柱考察 選用不同的色譜柱(SHIMADZU Shim-pack GIST C18，SHIMADZU-GL WondaCract ODS-2)對(duì)供試品溶液進(jìn)樣考察。結(jié)果表明，分離度、理論塔板數(shù)均能夠滿足要求，說明耐用性較好。

本試驗(yàn)采用HPLC法對(duì)壯西-11中的大黃酚成分開展了方法學(xué)考察，建立了高效液相色譜方法，通過對(duì)三批樣品含量的測(cè)定進(jìn)一步驗(yàn)證了大黃酚含量測(cè)定的穩(wěn)定性。該方法簡(jiǎn)便易操作，靈敏度和準(zhǔn)確度較高，穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及加樣回收試驗(yàn)都理想，可以用于壯西-11中大黃酚的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。