紫蠊乳膏制備工藝優化及藥理作用的研究

魏彬彬 駱丹妮 秦松瑩 查 夢 張小飛 史亞軍 鄒俊波

陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室/陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046

增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是創傷修復的一種必然產物，嚴重地影響了機體的正常功能及美觀，給患者的身體和心理都帶來了極大的疼痛。由于它們確切的發病原因和機制還不清楚，所以目前醫學研究中并無一種具有特殊性的根治途徑[1]。故從天然藥物中篩選出更為安全、有效的藥物治療顯得尤為迫切。

瘢痕被前人稱為“黃瓜癰”“肉龜”等。從中醫學角度出發，認為疤痕和外邪、正虛有極大關系，其發生的原因在于“氣滯血瘀、余毒未清”，還有諸多表現如濕熱內盛、氣虛、血虛及陰虛等；其治療方法通常是活血、散瘀、清熱、解毒[2]。美洲大蠊是傳統動物類藥材中“蜚蠊”的重要基源和藥材之一，傳統的功效主要包括通利血脈、斂瘡生肌等[3]，多用于癥瘕積聚、瘡癰腫毒。由于其療效確切，以其為主要原料的中成藥在臨床上廣泛使用，尤其在各種創面的修復上，療效顯著。紫草的藥理作用主要包括清熱、涼血、解毒以及解肌透疹等。其常用于治療瘡毒潰瘍、斑疹以及表皮顏色紫黑、水火及急性燒燙傷等[4]。由此可見，美洲大蠊和紫草治療增生性瘢痕具有中醫理論依據及臨床應用支撐。另外，本次實驗制作兔耳增生性瘢痕模型[5]，探討紫蠊乳膏對增生性瘢痕的治療效果，為祛瘢痕藥的進一步研究提供新的思路。

1 材料

1.1 藥品及主要試劑 紫草(亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司，批號: 20201108)；美洲大蠊干品(彌渡縣云峰美蠊養殖基地，批號:20201128)；硬脂酸(山東中旺油脂有限公司，批號：SA-1801)；三乙醇胺(山東鑫隆輝化工進出口有限公司，批號:20200806)；羊毛脂(宏尚生物科技有限公司，批號:20200514)；液體石蠟(中淼石油化工有限公司，批號:20181231)；吐溫-80(邢臺鑫藍科技有限公司，批號:20191008)；重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠(recombinant bovine basic fibroblast growth factor gel,RBBFGFG，珠海億勝生物制藥有限公司，批號:20201024)；磷酸氫二鈉[福晨(天津)化學試劑有限公司，批號: 20200507]；中性樹膠(Biosharp生物公司，批號: 70120150)；Annexin V-FITC雙染試劑盒(四川川柏生物科技有限公司，批號:P-CA-202)；(ALT/GPT)ELISA試劑盒(四川川柏生物科技有限公司，批號: CR20170604)。

1.2 主要儀器 旋轉蒸發儀(河南華豐儀器有限公司)；RS36型全自動染色機(常州派斯杰醫療設備有限公司)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；數字切片掃描儀[Pannoramic 250，3DHISTECH(Hungary)]等。

2 紫蠊乳膏的制備及處方優化

2.1 紫草和美洲大蠊的提取

2.1.1 紫草的提取 由于所需的活性成分紫草素在高溫下會被破壞，因此在該實驗中，通過冷浸法制備紫草油。制備方法如下：將紫草切碎并浸入菜籽油中，9 d后，將藥渣濾掉，剩余的紫草油可供后續實驗使用。

2.1.2 美洲大蠊的提取 取200 g美洲大蠊，加10倍量90%的乙醇，回流2 h，過濾，藥渣加8倍量水，提取兩次，每次提取1 h，收集水提液，使用旋轉蒸發儀濃縮至稠浸膏后備用。

2.2 制備 本品屬于O/W型乳膏劑，處方中的硬脂酸、液狀石蠟和羊毛脂均可作為乳化物的油相；紫草和美洲大蠊提取物、蒸餾水、三乙醇胺等均可以用作水相；羊毛脂作為保濕劑；尼泊金乙酯作為抗蝕性的防腐劑。如圖1所示。

圖1 紫蠊乳膏制備工藝流程圖

2.3 處方優化

2.3.1 處方設計 紫蠊乳膏：紫草、美洲大蠊提取物適量、硬脂酸3.0、羊毛脂0.5g、 液體石蠟3.0 mL、吐溫-80 1.0mL、尼泊金乙酯0.5g、三乙醇胺適量、蒸餾水適量。

2.3.2 紫蠊乳膏最佳處方篩選 預實驗[6]發現處方優化中的關鍵是三乙醇胺的用量，所以本實驗主要通過調整三乙醇胺的用量來選出紫蠊乳膏的最優處方。見表1。

表1 紫蠊乳膏處方用量

表1(續)

2.3.3 處方穩定性評價 乳膏劑的測評方法可以參考2020年版《中國藥典》(四部)[7]。其評價指標主要包括：乳膏劑的外觀、性狀、離心穩定性、耐寒性和耐熱性、pH 值等。各項考核指標的評分詳見表2(滿分:100分)。由3人以上對各個指標的平均得分進行疊加，作為最終的評分。

表2 各項考察指標評分表

2.3.4 處方穩定性評價結果 通過比較，可以看出，方中主要藥物(紫草提取物、美洲大蠊提取物)的用量與三乙醇胺的用量在一定程度上有相關性。如表3所示，在改變兩者的比例的情況下，發現在各項內容的測定結果中，處方4明顯優于其他處方。因此，篩選得到的最佳處方是處方4。

表3 紫蠊乳膏穩定性試驗評分

本次實驗以以上五項內容為評價指標，優化了紫蠊乳膏的處方。確定其最優處方為處方4。即：紫草提取物2.5 mL(10%)，美洲大蠊提取物2.5 mL(10%)，硬脂酸3.0 g(12%)，三乙醇胺3.0 mL(12%)，羊毛脂0.5 g(2%)，液體石蠟3.0 mL(12%)，蒸餾水9.0 mL(36%)，吐溫-80 1.0 mL(4%)，尼泊金乙酯0.5 g(2%)。采用該處方及相應的制備工藝可制備質地均勻細膩、性狀和含量均穩定的乳膏。

3 紫蠊乳膏對兔耳瘢痕模型的影響

3.1 兔耳增生性瘢痕模型制備 依據文獻復制兔耳增生性瘢痕模型[8]。在該實驗中，取4只新西蘭大白兔,體重介于2.0～2.5 kg之間，其中3只被固定在固定板上，并用75%的酒精對兔耳進行消毒。使用濃度為40 mg/kg的1%戊巴比妥鈉溶液，從兔耳緣靜脈注入，再將麻醉后的大白兔于兔耳腹側避開血管，制作直徑約為 0.8 cm的圓形創面，每只兔左右耳腹側分別制備3個創面，各個創面的間距約1.0 cm，完整地切除各創面全層皮膚，然后將其剝離并完全刮去軟骨膜，保留軟骨。手術工作完畢后把兔放在籠中喂養，自由進食、飲水。

3.2 分組與給藥 將新西蘭大白兔隨機分為4組。分別為空白組 、模型組 、紫蠊乳膏組、重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠組(簡稱：RBBFGFG組)。除了空白組外，其余的各組處理方法為：模型組涂抹生理鹽水，紫蠊乳膏組涂抹紫蠊乳膏，RBBFGFG組涂抹陽性藥。連續用藥21 d后對各組瘢痕進行大體觀察。

表4 兔耳增生性瘢痕治療方案

3.4 給藥期間瘢痕面積變化 說明與模型組相比，紫蠊乳膏組和RBBFGFG組創面修復較快，瘢痕面積明顯減小，說明兩組數據差異有顯著性意義。

3.5 兔耳瘢痕對比圖 由表5、表6得：紫蠊乳膏組、RBBFGFG組這兩組與模型組比較，瘢痕體積明顯縮小，且據圖2觀察其質地變軟，顏色變淺，有向空白組轉化的趨勢，證明紫蠊乳膏能有效改善瘢痕組織內纖維過度沉積的現象。

表5 給藥21 d后兔耳增生性瘢痕厚度

表6 兔耳創面瘢痕面積

A：空白組；B：模型組；C：紫蠊乳膏組；D：RBBFGFG組

3.6 兔耳瘢痕病理切片

3.6.1 標本 將需檢測兔耳組織共4例，用10%中性甲醛固定，固定狀態良好。于2021-04-15送到成都里來生物科技有限公司進行檢測，于2021-04-26得到檢測結果。

3.6.2 方法 固定組織經全自動脫水機脫水[9]，包埋，切片后如圖3所示。

圖3 兔耳瘢痕HE切片檢測流程圖

3.6.3 圖像采集 采用3DHISTECH(Hungary)生產的Pannoramic 250數字切片掃描儀對HE切片進行圖像采集[10]，每張切片先于40倍下觀察大體病變，而后選擇要觀察的具體區域，分別采集100倍和400倍的圖片，觀察具體的病變情況[11]，如圖4所示。

圖4 兔耳瘢痕HE切片檢查圖

3.6.4 結果 病理檢查顯示，空白組耳組織形態結構清晰完整，耳廓外覆有皮膚組織，內部由彈性軟骨作為支撐；皮膚組織表皮較薄，表面被覆角質層，鱗狀上皮層內細胞排列較為整齊，未見明顯變性壞死；真皮內致密膠原交錯排列，紅染，膠原內可見血管、皮脂腺和毛囊等皮膚附屬器，未見明顯變性壞死；皮下可見疏松結締組織、脂肪組織和肌肉組織、血管和神經等；未見明顯病理變化。模型組耳表面皮膚組織受損，表皮內鱗狀上皮細胞變性壞死，見細胞胞核固縮，胞質溶解，真皮內膠原排列紊亂，少量膠原溶解壞死，壞死區域內可見皮脂腺、毛囊等皮膚附屬器基本不見；表皮、真皮及皮下可見大量嗜酸性細胞及少量淋巴細胞聚集；未見其他明顯病理變化。RBBFGFG組耳表面皮膚組織受損，表皮及真皮溶解壞死，部分區域表皮壞死后缺失，表面可見痂皮形成，內含大量壞死細胞碎皮、白細胞及粉染漿液；真皮及皮下大量膠原纖維溶解壞死，形態結構模糊，壞死區域內可見嗜酸性粒細胞及淋巴細胞浸潤；未見其他明顯病理變化。紫蠊乳膏組耳組織形態結構清晰完整，耳廓外覆有皮膚組織，表皮較薄，表面被覆角質層，鱗狀上皮層內細胞排列較為整齊，真皮內致密膠原交錯排列，紅染，膠原內可見血管、皮脂腺和毛囊等皮膚附屬器，未見明顯變性壞死；皮下可見疏松結締組織、脂肪組織和肌肉組織、血管和神經等；未見明顯病理變化。

4 討論

增生性瘢痕(HS)多發生于皮膚創傷的愈合過程[12]。迄今為止，尚無理想藥物治療。我國傳統中藥在治療瘢痕方面有著悠久歷史，如積雪草苷、苦參堿、丹參酮ⅡA、血竭素 B、地龍等均在治療瘢痕方面取得良好效果[13]。紫草和美洲大蠊是我國常見的一種中藥，紫草素是紫草中提取的主要活性成分，西醫學研究[14]發現：紫草素可以抗菌消炎，緩解創面造成的不適感，促進傷口快速愈合等作用。美洲大蠊始載于《神農本草經》，有活血化瘀、解毒消積、生肌之功效，多用于癥瘕積聚、瘡癰腫毒，外用可消腫生肌[15]。另外，美洲大蠊治療增生性瘢痕具有中醫理論依據及臨床應用支撐。因此紫蠊乳膏在抑制增生性瘢痕中具有潛在的應用前景，有望成為治療HS的藥物之一。

由處方的優化和實驗結果可知，紫蠊乳膏最佳處方為紫草提取物2.5 mL；美洲大蠊提取物2.5 mL；硬脂酸3.0 g；三乙醇胺3.0 mL；羊毛脂0.5 g；液體石蠟3.0 mL；蒸餾水9.0 mL；吐溫-80 1.0 mL；尼泊金乙酯0.5 g。在本實驗中，成功建立了兔耳瘢痕模型，每組獲得6個瘢痕創面，具有統計學意義。實驗結果表明: 紫蠊乳膏對兔耳瘢痕有明顯抑制作用，在藥物治療組中瘢痕體積均減小，差異有顯著性意義(P< 0.05)，且質地變軟，顏色變淺，具有向正常皮膚(空白組)轉化的趨勢。藥物治療后HE切片顯示，與空白相比，模型動物耳表面皮膚組織壞死及炎細胞浸潤較為明顯，病變程度較重[16]；與模型組相比，RBBFGFG組未見明顯減輕，紫乳膏組耳表面皮膚組織結構較為完整清晰，未見明顯病理變化。所以紫蠊乳膏抑制增生性瘢痕有一定療效。

本研究建立了紫蠊乳膏的最優處方，并通過藥理實驗為祛瘢痕藥物的進一步研發提供參考。