Toll樣受體在小兒輪狀病毒腸炎伴心肌損害中的表達和意義

谷肖靈，陳音，李曉琳，彭文娟，劉京濤

輪狀病毒是導致兒童秋季腹瀉的主要病原體之一。輪狀病毒腸炎是由A組輪狀病毒引起的急性傳染性消化道疾病。輪狀病毒感染的臨床表現通常為嘔吐、腹瀉、發熱，同時伴有脫水、電解質紊亂和酸中毒等癥狀，還會累及其他器官如神經系統、呼吸系統以及心臟、肝臟等器官，嚴重者可發生心源性休克或猝死[1-2]。天然免疫在輪狀病毒腸炎中發揮重要作用。Toll樣受體蛋白(Toll-like receptors，TLR)是經典的模式識別受體家族，在天然免疫中發揮關鍵作用。單核細胞主要表達TLR2和TLR4，通過促進炎性細胞因子的生成參與機體非特異性免疫[3]。然而，外周血單核細胞中TLR2及TLR4和輪狀病毒腸炎合并心肌損害的關系尚未有研究報道。本研究擬通過檢測輪狀病毒腸炎合并心肌損害患兒外周血單核細胞中TLR2及TLR4水平，分析其在診斷輪狀病毒腸炎合并心肌損害患兒中的臨床應用前景。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2019年12月至2021年12月三門峽市中心醫院收治的輪狀病毒腸炎患兒50例為研究對象，其中25例合并伴心肌損害患兒為觀察組，25例無心肌損害患兒為對照組。觀察組中男10例，女15例；年齡0.7～1.8歲，平均(1.66±2.19)歲；對照組中男11例，女14例；年齡0.6～1.9歲，平均(1.21±0.46)歲。同期選取25例在我院健康體檢兒童為健康組，其中男12例，女13例；年齡0.4～1.9歲，平均(1.14±0.45)歲。3組研究對象性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 參照《兒童輪狀病毒胃腸炎預防診療專家共識(2020年版)》中輪狀病毒腸炎的診斷標準[4]。心肌損傷診斷標準：(1)肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)均增高；(2)CK-MB和cTnI有1項異常，行心電圖、心臟彩超、心臟遠達三位片等心臟器械檢查，顯示心電圖以R波為主的2個或2個以上導聯存在ST-T波改變，或心臟增大，或局限性運動減弱等[5]。

1.3 納入標準 (1)符合輪狀病毒腸炎的診斷標準；(2)年齡0～2歲；(3)該研究已獲得三門峽市中心醫院倫理委員會批準(2020-KY-0026)，所有患兒入組前家屬均簽署知情同意書。

1.4 排除標準 (1)合并肌肉疾病、中毒性腦病、腦炎、肝腎疾病、心律失常、心肌炎、先天性心臟病患兒；(2)存在先天性疾病患兒；(3)存在嚴重心力衰竭、休克患兒。

1.5 檢測方法 入院時即抽取外周血5 mL，2.5 mL放置于抗凝管中并采用免疫熒光法檢測C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)。另外2.5 mL放入含乙二胺乙酸的抗凝管內，離心后分離血漿和血細胞保存在-80 ℃冰箱。采用N-乙酰半胱氨酸法及酶聯免疫吸附測定檢測肌酸激酶(creatine kinase,CK)、CK-MB、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素-8(interleukin,IL-8)、CRP、γ干擾素(interferon γ，INF-γ)濃度。采用乳酸法檢測LDH。

1.6 外周血單核細胞采集 采集外周血5 mL，通過Ficoll Pague試劑盒(GE Healthcare Life Science)分離液獲得單核細胞。

1.7 外周血單核細胞內的TLR2、TLR4檢測 總RNA采用Trlzol法試劑盒(Invitrogen，15596-026)進行提取，根據說明反轉錄得到cDNA，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測外周血單核細胞中TLR2、TLR4的mRNA表達。TLR2 mRNA正向引物序列：5′-TTT GCT GGA CTT ACC TTC CTT G-3′，反向引物序列：5′-CAG TAT CTC GCA GTT CCA AAC A-3′；TLR4 mRNA正向引物序列：5′-TGG ATA CGT TTC CTT ATA AG-3′，反向引物序列：5′-GAA ATG GAG GCA CCC CTT C-3′。使用β-actin作為內參照。采用2-△△CT方法計算目的mRNA表達量。

1.8 流式細胞儀器檢測外周血單核細胞中TLR2、TLR4蛋白的表達 將分離獲得的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌2次后用100 μL PBS懸浮細胞，分別加入PE小鼠組織相容性抗原-DR抗體(PE histocompatibility antigen DR,PE-HLA-DR)，FITC-葡聚糖偶聯物(FITC-Lineage)，復合熒光蛋白7(phycoerythrin conjugated Cy7,PECy7)-TLR2/4各5 μL。將樣本避光在室溫孵育30 min后，放置于離心機中以1 000 r/min離心5 min(離心半徑13.2 cm)后棄去上清液，加入無菌PBS重新懸浮細胞，將樣本放置在流式細胞儀(美國BD)檢測。

2 結果

2.1 3組心肌酶譜比較 觀察組心肌酶類各項指標顯著均高于對照組和健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組心肌酶類各項指標均高于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組心肌酶譜比較

2.2 3組血清炎癥因子比較 觀察組炎癥因子各項指標顯著均高于對照組和健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組炎癥因子各項指標均高于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清炎癥因子比較

2.3 3組外周血單核細胞中TLR2、TLR4基因表達比較 觀察組患兒的外周血單核細胞中TLR2、TLR4基因表達均顯著高于對照組和健康組，差異均有統計學意義(P<0.05)。對照組患兒的外周血單核細胞中TLR2、TLR4基因表達均高于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組外周血單核細胞TLR mRNA比較

2.4 3組外周血單核細胞中TLR2、TLR4蛋白表達的比較 觀察組患兒的外周血單核細胞中TLR2、TLR4基蛋白表達均顯著高于對照組和健康組，差異均有統計學意義(P<0.05)。對照組患兒的外周血單核細胞中TLR2、TLR4蛋白表達均高于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表4。

表4 3組外周血單核細胞TLR平均熒光強度比較

圖1 外周血中單核細胞中TLR蛋白表達

3 討論

輪狀病毒是屬呼腸狐病毒科的一種RNA病毒，分為A～G 7個組，其主要通過糞-口途徑傳播，也可通過水和食物傳播。其中A組輪狀病毒可致嬰幼兒腸炎，B組輪狀病毒與成人腸炎有關[6-7]。輪狀病毒腸炎常見于6～24個月的嬰幼兒，偶見于新生兒，其潛伏期通常為2～3 d。起病較急，最初癥狀多為發熱，臨床表現主要為腹瀉、無黏液及膿血，排黃色水樣便且量多，嚴重者可出現輕度至中度脫水癥狀，甚至導致死亡[8]。此外，30%～50%的患兒早期會出現呼吸道癥狀[9]。輪狀病毒腸炎的發病機制目前尚不清楚，一些研究表明，輪狀病毒腸炎主要由病毒侵入小腸引起，導致小腸絨毛萎縮和腫脹，以及固有層細胞增殖，導致小腸的分泌和吸收功能障礙，從而誘發腹瀉[10]。

輪狀病毒感染不僅導致患兒腸炎發作，還會損害其他器官，如神經系統、呼吸系統及肝腎等多個器官，并引發小兒病毒性心肌炎等[11]。輪狀病毒已成為導致兒童病毒性心肌炎的主要病原體之一，文獻報道輪狀病毒感染時造成的嚴重腹瀉會導致血液濃縮、脫水及酸中毒等，這些引起心肌不同程度的損傷，心肌損害發生率高達50%～70%[12]。心肌細胞酶廣泛分布于全身，在骨骼肌和心肌中含量最高，心肌細胞膜防止心肌細胞酶外滲到血液中。當心肌受損時，心肌酶被釋放到血液循環中，導致病例組血清LDH、AST、CK和CK-MB水平升高。CK-MB在心肌損傷早期迅速升高[13]。在本研究中發現，輪狀病毒腸炎伴心肌損害患兒的血清AST、LDH、CK和CK-MB顯著高于對照組和健康組。這些研究結果表明，輪狀病毒腸炎患兒的心肌損傷可能與脫水引起的電解質紊亂和循環障礙有關。

單核-巨噬細胞作為重要的炎性細胞參與機體免疫應答，在特異性免疫應答中他們可分泌多種炎癥趨化細胞因子參與免疫調節并介導炎性反應[14]。TLRs作為模式識別受體，是先天免疫和適應性免疫的前哨，在宿主天然免疫中發揮關鍵作用[15]。研究表明TLR2和TLR4介導先天性免疫應答，激活細胞內級聯反應從而誘導炎性反應。有關于小兒輪狀病毒感染后機體免疫應答機制的研究表明，在患兒體內發現了至少5種TLRs的高表達，他們通過激發TNF-α、IL-8、CRP、INF-γ等各種細胞因子的產生，啟動并參與輪狀病毒性腹瀉患兒免疫反應及病理生理過程。研究報道，中藥參苓白術散通過調節TLR4信號通路抑制輪狀病毒腸炎[16]。我們前期已發表的研究發現，TLR2和TLR4的基因轉錄和翻譯后蛋白水平在輪狀病毒感染大鼠腸道上皮的表達上調，提示他們可能參與輪狀病毒感染后腸炎的進展[17]。在該研究中我們發現，輪狀病毒腸炎伴心肌損害患兒外周血單核細胞中TLR2和TLR4的基因和蛋白水平明顯高于對照組和健康組。以上研究結果表明TLR2和TLR4在預測患兒輪狀病毒腸炎伴心肌損害中具有一定臨床應用前景。

綜上所述，本研究發現輪狀病毒腸炎患兒外周血單核細胞中TLR2和TLR4的基因和蛋白表達與心肌損害的發生、發展有關，采用心肌酶聯合TLR2和TLR4水平協助評價有助于對提高心肌損害診斷的準確性，并減少漏診率。