基于超高效液相色譜－四極桿－靜電場軌道離子阱質譜的羊乳脂肪球膜全蛋白譜泌乳期時序差異研究

張 榮，賈 瑋，2*

（1．陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2．陜西農產品加工技術研究院，陜西 西安 710021）

隨著人們膳食營養結構的完善和生活水平的提高，對乳制品市場的需求不斷增加，同時，國家為促進奶業發展實施了一系列政策，使得羊乳市場進入快速成長期，成為國內乳品市場的一股新能量［1］。羊乳因脂肪顆粒小、微量元素及維生素含量高且不含牛乳中易致敏蛋白等特點，被認為是最接近母乳的乳品，也是現代人類的健康營養佳品［2］。隨著羊乳產業的升級和加工技術的不斷發展，對羊乳的營養功能成分研究也需要在現有基礎上繼續深入。

乳脂肪是羊乳的主要成分之一，以脂肪球的形式存在于乳體系中。乳脂肪球形成于乳腺分泌細胞中，首先在內質網膜表面合成前體，隨后以微脂質滴的形式聚成大小約0.2～8 nm的球體，相互融合生長并通過細胞質到達細胞頂端，待從上皮細胞分泌出去時再包裹上一層等離子膜即乳脂肪球膜［3］。乳脂肪球膜結構復雜，主要由以糖蛋白為主的特異性膜蛋白質和以神經鞘脂類為主的磷脂組成［4］。乳脂肪球膜雖然在整個乳體系中占比很少，但具有重要的生物功能特性，如抗黏附性、抗菌、抗癌等，并且與腸道相關疾病、自閉癥和多發性硬化癥等疾病相關，同時也參與信號傳導和細胞調節、凋亡、分化、生長等生物過程［5］。乳脂肪球膜中含有25%～60%的蛋白質，其中含量較高且具有顯著生理活性功能的蛋白質有嗜乳脂蛋白（BTN）、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（XDH/XO）、血小板糖蛋白4（CD36）、脂肪酸結合蛋白（FABP）、脂滴包被蛋白-2（PLIN2）和黏蛋白-1（MUC1）等［6］。

乳脂肪球膜（MFGM）蛋白因結構特異和具有多重生物功能，越來越受到人們的關注［7］。研究發現母乳與牛乳中的MFGM蛋白存在較大差異，母乳中存在1 230種特異性蛋白質，且有24種蛋白質參與免疫相關的通路［8］，牦牛乳與牛乳中的主要乳脂肪球膜蛋白在相對豐度上雖有所不同，但其生物學功能幾乎無差異［9］。同時非標記蛋白質組學技術結合MaxQuant軟件及Andromeda搜索引擎，為蛋白質組學中的大多數定量實驗提供了完整的解決方案［10］。

為了更好地了解不同泌乳期羊乳的MFGM蛋白質組成并評估其差異，本研究從羊初乳和羊常乳樣品中分離提取MFGM蛋白，使用蛋白質組學技術與高分辨質譜技術結合MaxQuant軟件對其種類和數量進行研究。隨后使用偏最小二乘判別分析篩選并確證標志性特征蛋白質，使用基因本體論（Gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析評估了差異蛋白質的潛在生物活性功能，以便更好地了解羊乳MFGM蛋白質的組成，為今后羊乳的深加工及副產品加工提供方向。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

納升級液相色譜系統（EASY-nLC 1000）串聯四極桿－靜電場軌道阱高分辨質譜儀、真空冷凍干燥機、酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；Milli－Q Integral型純水儀（美國Millipore公司）；AL204－IC型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

胰蛋白酶（測序級），甲酸、乙腈（色譜純）（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；BCA快速蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術公司）；十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、Tris、尿素、碳酸氫銨（分析純，美國Sigma公司）；10 kDa超濾管購自美國Millipore公司。

羊乳樣品取自陜西省西安市的關中奶山羊養殖場，選取40只健康且沒有急性乳腺炎和明顯臨床疾病的關中奶山羊，年齡為2～4歲。在2021年5月采集產后0～5天的羊乳初乳和產后1～6個月的羊乳常乳樣品各20份，并于2～4 h內運送至實驗室。分析前，將各個樣本集各自混合以減少個體差異。

1.2 蛋白質的分離提取

量取50 mL羊初乳和50 mL羊常乳樣品，在4℃下于12 000 r/min離心40 min獲得乳脂肪層、乳清層和固體顆粒。將乳脂肪層轉移至新的離心管并用磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，pH 6.8）超聲洗滌15 min，在4℃下以12 000 r/min離心20 min。重復該洗滌過程3次。隨后，用0.4%十二烷基硫酸鈉超聲洗滌乳脂肪層1 min，在4℃下以12 000 r/min離心20 min，收集MFGM蛋白。使用BCA快速蛋白定量試劑盒對不同泌乳期的羊乳MFGM蛋白質進行測定。

1.3 超濾輔助樣品制備及消化

取100 μL提取的MFGM蛋白樣品，加入10 μL 100 mmol/L二硫蘇糖醇，于56℃下孵育1 h，以保持蛋白質巰基處于還原狀態。冷卻至室溫后，加入碘乙酰胺至終濃度為55 mmol/L，在25℃下避光孵育30 min完成巰基烷基化。將孵育完成樣品轉移至10 kDa超濾離心管中，加入100 μL尿素緩沖液（150 mmol/L Tris HCl和8 mol/L尿素，pH 8.0）洗滌MFGM蛋白樣品兩次，隨后加入100 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液離心。取胰蛋白酶-50 mmol/L碳酸氫銨溶液，使酶與底物的質量比為1∶50，加入超濾離心管中，37℃下酶解12 h。加入1%甲酸終止消化，使用C18柱對樣品酶解肽溶液進行脫鹽凍干，以40 μL 0.1%甲酸復溶后進行質譜鑒定。

1.4 儀器條件

色譜條件：Hypersil Gold aQ C18反相色譜柱（100 mm×75 μm，3 μm，Thermo Fisher Scientific公司），流動相A：4 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸），流動相B：4 mmol/L甲酸銨乙腈溶液（含0.1%甲酸）；流速：250 nL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30℃；梯度洗脫程序：0～50 min，5%～35%B；50～95 min，35%～100%B；95～100 min，100%B；100～110.1 min，100%～5%B；110.1～120 min，5%B。

質譜條件：加熱電噴霧離子源（HESI），鞘氣流速48 L/min，輔助氣流速5 L/min；噴霧電壓3.8 kV；離子源溫度350℃；毛細管溫度300℃。在m/z300～1 700范圍內采集所有數據信息，正離子模式下一級掃描的分辨率為70 000（m/z200的半峰寬），二級掃描的分辨率為17 500，最大離子注入時間為120 ms，在線性離子阱中對前20個響應最高的前體離子進行碎裂，隔離窗口為m/z2，碰撞能量高達27 eV。通過UniProtKB在線數據庫下載羊的蛋白序列數據庫，使用MaxQuant 1.6.7.0軟件對二級實際譜圖與肽段理論碎裂譜圖進行匹配，以Andromeda為搜索引擎，并采用非標記定量（Label-free quantification，LFQ）算法進行相對定量分析。使用Target-decoy搜索策略調整肽段和蛋白質鑒定的閾值，使錯誤發現率在0.01。

2 結果與討論

2.1 羊乳脂肪球膜全蛋白譜鑒定及表達差異分析

通過肽段在不同泌乳期的羊乳中鑒定出473種MFGM蛋白，并對419種蛋白實現了定量，其LFQ強度跨越近5個數量級，其中羊初乳中定量331種蛋白質，羊常乳中定量252種蛋白質。初乳中MFGM表達的蛋白種類遠遠高于常乳，說明初乳富含免疫球蛋白和生物活性蛋白，營養價值更為豐富。在鑒定出的MFGM蛋白中，羊初乳中含有包括6-磷酸果糖激酶、α-1-抗蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白和維生素D結合蛋白在內的167種特征表達蛋白，羊常乳中含有包括粘蛋白-15、脂滴包被蛋白-1、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3－1在內的88種特征表達蛋白，164種蛋白在這兩組樣品中共有表達（圖1）。

圖1 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白的組成表達差異Fig.1 MFGM protein of goat milk at different lactation periods

對2組樣品集的混合樣品分別平行3次進樣，得到的LFQ強度先進行均值歸一化處理，將數據矩陣轉換為高斯型分布，以消除3次平行分析之間離子強度的系統性偏差，使所鑒定蛋白豐度更具可比性［11］；隨后進行單變量分析，分別以2和0.05為倍數變化及顯著性差異的閾值，繪制雙對數火山圖，最終獲得羊初乳和羊常乳樣品中具有顯著差異的蛋白質310種，其中羊初乳中上調蛋白質有131種，下調蛋白質有179種（圖2）。不同泌乳期羊乳中鑒定出的特征蛋白質及共有蛋白質豐富了人們對于羊乳蛋白質成分的了解，為羊乳基嬰幼兒乳粉和功能食品的研發及進一步的功能開發提供了有效的理論基礎。

圖2 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白的火山圖Fig.2 Volcano plot of goat milk MFGM protein at different lactation periods

2.2 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白質的化學計量學分析

以篩選的具有顯著性差異的蛋白質為基礎，利用正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least－squares discrimination analysis，OPLS－DA）對羊初乳和羊常乳樣品進行分析。2組樣本的R2X為0.962，R2Y為0.992，Q2為0.999，表明所建立的模型具有良好的擬合能力和預測性能［12］。樣品明顯分開且各自聚集緊密（圖3），表明羊初乳和羊常乳樣品之間觀察到的分布差異主要是由于生物學原因。選擇VIP值大于1.2的蛋白為標志物進行后續研究（表1）。使用熱圖對羊初乳和羊常乳中鑒定的具有顯著表達差異，同時滿足VIP值大于1.2的MFGM蛋白質進行可視化分析。左邊的每一個方格代表一種MFGM蛋白質，其顏色表示該蛋白表達的相對豐度，相對豐度越高顏色越深，紅色代表上調，藍色代表下調；右邊為每種MFGM蛋白在Uniprot中的基因名稱（圖4）。在羊初乳和羊常乳樣品中有47個顯著差異的特征蛋白顯示兩個不同的趨勢，其中羊初乳中的上調蛋白包括載脂蛋白E（APOE）、紫蘇苷-2（PLIN2）、Ras相關蛋白18（RAB18）、多聚免疫球蛋白受體（PIGR）和黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（XDH）等21種，下調蛋白包括EH結構域蛋白1（EHD1）、EH結構域蛋白4（EHD4）、Ras樣原癌基因A（RALA）、跨膜蛋白263（TMEM263）等26種。

表1 羊初乳和常乳中顯著表達的差異MFGM蛋白質（P＜0.05，fold change（FC）＞2，VIP＞1.2）Table 1 Significantly expressed proteins in colostrum and mature milk（P＜0.05，fold change（FC）＞2，VIP＞1.2）

圖3 不同泌乳期羊乳的OPLS－DA分析圖（n=3）Fig.3 OPLS－DA analysis diagram of goat milk at different lactation periods（n=3）

圖4 不同泌乳期羊乳特征MFGM蛋白組成及表達差異Fig.4 Composition and expression difference of characteristic MFGM of goat milk at different lactation periods

APOE可調節免疫反應的激活和持續的炎癥反應，從而在動脈粥樣硬化中具有保護作用［13］。PLIN2主要分布在脂質滴表面，通過阻礙主要的三酰基甘油脂酶ATGL的相互作用保護脂滴免受脂解，對于哺乳期脂滴的代謝和分泌至關重要［14］。PIGR通過多聚免疫球蛋白A和免疫球蛋白M分子上的J鏈結合，進而介導PIGR的跨上皮細胞轉運及分泌，發揮免疫球蛋白在粘膜屏障中的病原體清除作用，提高機體免疫力［15］。在哺乳動物中的XDH是復雜金屬黃素蛋白質的基準物，可廣泛催化醛類、嘧啶、嘌呤和喋呤的羥基化反應［16］。Ras相關蛋白是在活性鳥苷三磷酸（GTP）結合態和非活性鳥苷二磷酸（GDP）結合態之間循環的二元分子開關。這種轉換機制在各種不同的GDP/GTP結合蛋白如細菌伸長因子、異三聚體G蛋白和多種具有不同生物學功能的小GTP酶中高度保守，其活性異常也可能在自閉癥和其它神經系統疾病中發揮重要作用［17］。EH結構域蛋白是參與受體回收的關鍵適配器蛋白，可對一些關鍵的內吞事件進行功能調節，包括各種受體的內化和再循環，EHD1控制轉鐵蛋白受體、主要組織相容性復合體Ⅰ蛋白質和β-整合素等受體從內吞小泡到質膜的循環。同時，EHD1已被證明可協同促進有氧糖酵解［18］。

2.3 不同泌乳期羊乳MFGM蛋白質的生物信息學分析

使用DAVID數據庫對羊初乳和羊常乳差異表達的MFGM蛋白質從生物過程、細胞成分和分子功能3大分支進行GO富集注釋，各分支中最顯著的富集注釋信息見圖5A～C。MFGM蛋白參與不同的生物學過程，其中，細胞過程、定位和生物調節為主要參與。另外，MFGM蛋白也在生物粘附、代謝過程和免疫過程中發揮作用，參與通路的蛋白質在泌乳期間的豐度變化可為不同階段生長發育提供特定營養與保護。特征差異蛋白質所參與的代謝過程可調節嬰兒腸道的結構和功能成熟［19］。MFGM蛋白主要富集在脂質微滴、細胞外間隙和細胞外囊泡等，說明初乳中的低豐度蛋白組分是血清中蛋白質在乳腺細胞的緊密連接處通過細胞外囊泡在細胞間或跨細胞傳遞到乳脂肪球膜中，進而參與行使關鍵生理功能［20］。這些蛋白在羊乳中的分子功能包括ATP依賴活性、結合作用、催化活性。為對羊初乳和羊常乳的差異表達MFGM蛋白生物學功能進行更深入分析，使用KEGG分析了MFGM蛋白所參與的主要通路，結果如圖5D所示。圖中顯示了差異表達的MFGM蛋白參與的通路，表明趨化因子和細胞因子信號通路介導的炎癥過程和整合素信號通路為主要參與通路。整合素從細胞外基質發出信號完成乳腺上皮細胞分化和羊乳合成［21］。趨化因子作用于免疫系統的細胞表面，招募細胞到損傷或感染位點，參與啟動和調節急性組織損傷或代謝不平衡觸發的炎性反應［22］，這也證實了羊初乳可在一定程度上降低機體炎癥反應。半乳糖的代謝通過Leloir途徑進行，首先由半乳糖變構酶將α-D-半乳糖異構化為β-D-半乳糖，然后由半乳糖激酶將β-D-半乳糖磷酸化。隨后半乳糖-1-磷酸通過半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶將UDP葡萄糖轉化為UDP半乳糖并釋放葡萄糖-1-磷酸，UDP半乳糖通過UDP-半乳糖-4-差異構酶轉化為UDP葡萄糖［23］，而羊初乳和羊常乳在調節半乳糖代謝方面存在差異。

圖5 不同泌乳期羊乳蛋白GO功能注釋和KEGG通路富集Fig.5 GO functional annotation and KEGG pathway enrichment of goat milk protein at different lactation periods

3 結論

本研究采用非標記蛋白質組學方法，對羊初乳和羊常乳的乳脂肪球膜蛋白質進行了研究。羊初乳和羊常乳中共定量419種MFGM蛋白，其中羊初乳中存在167種特征表達蛋白，羊常乳中有88種，164種蛋白在這兩組樣品中共有表達。通過單變量及多變量分析篩選出羊初乳和羊常乳樣品中47個顯著差異的特征蛋白。GO功能富集分析發現，所鑒定乳脂肪球膜蛋白質主要參與的生物過程是細胞過程、定位和生物調節，KEGG通路為趨化因子和細胞因子信號通路介導的炎癥過程和整合素信號通路。為了充分利用羊乳的乳脂肪球膜營養保健功能，有必要進一步詳細描述羊乳乳脂肪球膜中這些蛋白質的分子結構和相關的生物學功能。