天然產物抗豬流行性腹瀉病毒研究進展

成溫玉 張博昕 趙鴻遠 陳艷 謝娟平

（1.安康學院現代農業與生物科技學院，安康 725000；2.安康學院農業科技研發中心，安康 725000；3.安康市鎮坪縣畜牧獸醫中心，安康 725600；4.安康學院醫學院，安康 725000）

腹瀉病是豬群中最為普遍的疾病之一，也是一直困擾生豬養殖產業發展的重大難題。由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬病毒性腹瀉是當前危害各養殖場豬群的關鍵病之一。2010年爆發在我國南方地區的PED 迅速席卷了全國近80%的豬場，仔豬高達100%的死亡率給豬場造成重大經濟損失［1］。疫苗接種是防控PED 最主要的手段，目前市面上已經有針對PEDV的滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗和基因重組活載體疫苗。然而該病毒高變異性、疫苗自身的缺陷和豬腸道免疫的特殊性，對于流行的PEDV 變異毒株尚無高效的控制策略，迫切需要開發有效的抗病毒療法彌補疫苗免疫保護的不足［2-3］。

天然產物是一類來源于動物、植物、微生物、昆蟲以及海洋生物中的組成成分或其代謝產物，具有來源廣、成分多樣、結構獨特、副作用低以及不易產生耐藥性等特征。近年來，越來越多的研究發現并揭示了天然產物具有抗PEDV 感染的活性，并且部分天然化合物和中藥復方制劑具有較大的應用潛力［4］。本文對中草藥單體、單味中藥提取物、中藥復方制劑、微生物、動物和藻類來源的天然產物在抗PEDV 的研究現狀進行概述，以期為抗PEDV藥物的創制提供借鑒及參考。

1 中草藥單體物質

1.1 多糖類化合物

天然多糖物質來源極廣，具有廣泛的抗氧化、抗腫瘤、抗病原微生物和免疫調節等活性［5］，被應用于獸藥、動物保健品、飼料添加劑以及動物疫苗中。來源于多種植物中的多糖物質具有抗PEDV 的功能，Lee 等［6］從銀杏外果皮提取的多糖物質被證實具有抑制PEDV 感染的作用，可阻礙病毒對細胞的吸附和侵入，顯著降低病毒引起的細胞病變。趙魯等［7］發現馬齒莧多糖能夠阻礙PEDV 對細胞的吸附并能抑制病毒感染引起的炎癥細胞因子分泌，暗示馬齒莧多糖可能通過其免疫調節功能發揮抗病毒活性。從發酵黃芪中提取的多糖不僅能夠抑制Vero 細胞中PEDV 的復制，而且作為佐劑聯合PEDV 疫苗注射給斷奶仔豬后，顯著提高仔豬血清中sIgA、IFN-γ 和IL-6 的產生，表明黃芪多糖通過增強機體免疫反應發揮抗病毒功能，可用作PEDV 疫苗佐劑［8］。廣藿香具有鎮吐止瀉、健胃解熱之功效，Chen 等［9］從廣藿香的水浸提物中鑒定出4 種多糖物質（PCP1.1、PCP1.2、PCP2.1 和PCP2.2），均具備抑制PEDV 增殖的活性，并且PCP2.1 和PCP2.2 還可阻斷PEDV穿入細胞。隨后該團隊又從益智仁中分離到3 種多糖物質（AOFP1-AOFP3），其中AOFP3 能顯著降低PEDV 感染形成的細胞病變和病毒滴度，同時提高細胞的抗氧化活性，暗示AOFP3 可能通過增強細胞抗氧化活性發揮抗病毒作用［10］。PEDV 感染誘導細胞產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），而ROS 是引起胃腸道黏膜疾病的重要病因，也是引發PEDV 感染過程中細胞自噬、細胞凋亡和內質網應激的關鍵因素［11-12］。由PEDV 感染誘導的細胞自噬反應能夠促進病毒復制，并且ROS 在病毒感染的Vero 中的累積呈時間依賴性，降低PEDV 誘導產生的ROS 有助于抑制病毒的感染［11-12］。Li 等［3］對803 種化合物進行抗病毒篩選，發現25 種化合物具有較強抑制PEDV 的潛力，其中有7 種化合物具備抗氧化活性，并且能夠顯著降低PEDV 感染誘導細胞產生的ROS。上述植物源多糖物質對PEDV 具有良好的抑制效果，對于其他病毒、細菌也具有抵抗性，可作為畜禽抗生素替代品。然而，目前對于多糖抗PEDV 的研究缺乏動物驗證試驗，臨床安全性無法保證，需要開展活體試驗研究和臨床安全性評價。

1.2 黃酮類化合物

黃酮類化合物是多種天然藥物的重要活性成分之一，具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、免疫調節及抗腫瘤等生物學功能，其在抗PEDV 感染過程中也表現出重要作用。研究發現槲皮素對不同的PEDV 毒株都具有抗病毒活性［13］。Li 等［13］采用分子對接分析預測出槲皮素與PEDV 蛋白酶3CLpro 存在相互作用關系，通過異位表達3CLpro 蛋白和熒光共振能量轉移技術證實槲皮素能與3CLpro 特異性地結合并抑制酶活性，進而抑制了病毒復制。除了槲皮素之外，槲皮素-7-鼠李糖苷（Q7R）、芹菜素和木犀草素等黃酮類化合物也顯示出抗PEDV 活性，其中以Q7R 的活性最強，該化合物主要影響PEDV感染的初始階段而發揮抗病毒作用［14］。盡管有研究證實黃酮類化合物可通過其抗氧化作用降低病毒感染誘導的ROS 而發揮抗病毒活性，但Song 等［15］利用Q7R 對PEDV 抗病毒活性研究證實，Q7R 并非依賴于其抗氧化作用來抑制PEDV 的增殖，而是否與槲皮素類似，通過抑制病毒蛋白酶活性發揮PEDV活性有待進一步研究。近年來黃腐酚在抗病毒方面的功效被逐漸挖掘，現已證實其能夠抑制PEDV 對細胞的感染并且對細胞幾乎無毒性作用［16］。采用分子對接和結構模擬分析證實，黃腐酚能與多數冠狀病毒M 蛋白活性中心的半胱氨酸形成穩定的氫鍵，從而抑制M 蛋白活性，發揮抗病毒作用［17］。此外，黃腐酚被證實在TGEV 和SARS-CoV-2 等其他冠狀病毒感染中也表現出抑制效應，可見黃腐酚具有開發成冠狀病毒特異性抑制劑的潛力［17］。綜合上述黃酮類化合物抗PEDV 的研究來看，其主要是通過靶向作用于PEDV 的蛋白酶而發揮抗病毒活性。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是槲皮素的結構類似物，具有廣泛的抗病毒活性。起初Wang 等［18］篩選到EGCG 具有抑制PEDV 的作用，隨后Huan 等［19］證實，EGCG通過阻礙PEDV 的附著、入侵、復制和組裝發揮抗病毒效應。此外，EGCG 被發現也具有抗SARSCoV-2 的作用，無論是體外細胞試驗還是小鼠感染研究，EGCG 均可降低SARS-CoV-2 的增殖［20］。通過電鏡觀察和分子動力學模擬表明，EGCG 可與冠狀病毒3CLpro 和PLPro 蛋白酶結合，從而阻礙病毒復制并誘導機體的抗病毒反應［20］。金絲桃素是從貫葉連翹中提取的具有抗病毒活性的二蒽酮化合物，能顯著抑制Vero 細胞中PEDV 的增殖，通過分子對接和熒光能量共振轉移技術證實，該化合物可與PEDV 3CLpro 結合并阻礙蛋白酶的活性，從而發揮抗病毒作用［21］。

1.3 生物堿

黃連素具有抗菌消炎、抗病毒、免疫調節和改善心腦血管疾病的功效。葉躍天等［22］發現黃連素對PEDV 的復制和組裝起到明顯的抑制作用，并且減弱PEDV 誘導的細胞凋亡反應。Wang 等［18］從FDA 批準的911 種天然產物中篩選到4 種顯著抑制PEDV 感染的活性物質（番茄堿、紐莫康定B0、醉魚草皂苷Ⅳ和表沒食子兒茶素沒食子酸酯），其中番茄堿抗病毒活性最強。與金絲桃素相同，番茄堿能與PEDV 3CLpro 結合并直接阻礙蛋白酶的活性，從而發揮抗病毒作用，并且對其他能夠表達3CLpro 的病毒諸如TGEV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和塞尼卡病毒A 型（SVA）均有很好的抑制效果［18］，由此可見番茄堿在治療和預防PEDV 感染中有很大的應用潛力。高三尖杉酯堿（homoharringtonine，HHT）是存在于三尖杉屬植物的一種用于治療慢性髓細胞白血病的生物堿，其在抗PEDV 感染中也具有效果［23］。無論是抑制細胞中PEDV 的增殖，還是治療PEDV 感染的仔豬，HHT 均表現出良好的生物活性［23］。

1.4 皂苷類化合物

甘草是我國傳統中草藥，其主要的活性成分甘草酸被證實對PEDV 有較強的抑制能力，通過阻礙病毒進入和復制，降低約50% N 蛋白表達量［24］。甘草酸作為高遷移率族蛋白B（high mobility group box-1，HMGB1）的抑制劑，顯著降低了PEDV 感染過程中由HMGB1 介導的細胞炎癥反應，從而減輕PEDV 感染造成的臨床癥狀［24］。以甘草酸為基礎采用水熱法轉化成生物相容性良好的甘草酸碳原子點也展現出很好的抗PEDV 活性［25］。此外，從日本七葉樹種子的提取物中分離鑒定出的7 種皂苷化合物表現出抑制PEDV 增殖的活性，且這些化合物在20 μmol/L 的濃度下對細胞幾乎無毒性影響［26］。

1.5 其他活性物質

歐當歸內酯A（levistolide A，LA）是從中藥川芎中提取的藳本內酯二聚體，在抗PEDV 感染中表現出良好的效果。在病毒對細胞的吸附或穿入階段，LA 通過調控ROS 介導的內質網應激反應發揮抗病毒作用［27］。Yang 等［28］從山茶花中鑒定出4 種五環三萜類化合物通過抑制PEDV 基因編碼的多個蛋白質的合成而影響病毒增殖，發揮較強的抗病毒活性。隨后，該團隊又從防風植物的甲醇抽提物中分離并鑒定出9 種抑制PEDV 增殖的化合物，尤其是一種香豆素類化合物的抗病毒活性最強，通過抑制病毒核衣殼蛋白和棘突蛋白的合成發揮抗病毒活性［29］。2019年，該研究團隊又從檸檬清風藤葉中分離到2 種酚類物質通過抑制病毒的復制發揮較強的抗PEDV 功效［30］。

2 單味中草藥提取物

蘆薈是一種常見的觀賞性藥食同源的植物，具有抗感染、抗炎、抗氧化、防輻射以及提高機體免疫等功能，現已證實其在抗PEDV 感染中發揮重要功能。Xu 等［31］發現蘆薈提取物在PEDV 復制周期的晚期產生抑制作用，且能直接滅活病毒粒子但不影響病毒基因組及蛋白的完整性。同時，以100 mg/kg 的劑量經口灌服仔豬后，對感染PEDV 的仔豬具有明顯的保護作用，仔豬的存活情況、臨床癥狀及腸道組織的病理變化均優于不給藥仔豬，由此可見蘆薈提取物具有較好的抗PDEV 活性和潛在的應用價值［31］。Cho 等［32］篩選了333 種藥用植物水浸提物的抗PEDV 活性，發現朝鮮淫羊藿和金銀花具有抑制PEDV 增殖的作用，其中朝鮮淫羊藿的抗病毒活性強于金銀花，且對細胞的毒性低。進一步將朝鮮淫羊藿的水浸提物添加到感染了PEDV 仔豬的日糧中，發現仔豬的腸道病變、糞便的形態和病毒載量均有明顯改善，提示淫羊藿具有良好的抗PEDV 功效［32］。淫羊藿具有廣泛的抗病毒活性，富含多糖和黃酮等有效成分，二者均能夠刺激淋巴細胞增殖并誘導I 性干擾素和促炎性細胞因子的表達，從而增強機體的抗病毒能力［33］。辣木因營養價值高、生長快、抗逆性強，具有提高豬肉品質的作用，葉子被廣泛用作畜禽飼料。近年來，辣木提取物的抗病毒功能被逐漸挖掘，其中辣木葉的水浸提物可通過抑制PEDV 誘導的細胞凋亡在病毒復制階段發揮抗病毒活性，并且還能夠降低PEDV 誘導的炎癥反應［34］。辣木提取物中富含蘆丁和槲皮素等活性成分［34］，而這些單體物質在抗冠狀病毒感染的活性已被證實，由此可見辣木在抗冠狀病毒感染中具有較大的應用潛力。越南也擁有豐富的藥用植物資源，Trinh 等［35］篩選了17 種藥用植物水浸提物和乙醇浸提物的抗PEDV 活性，發現其中14 種植物的水浸提物和4 種植物的乙醇浸提物均具有抗病毒活性，尤其閉脈斑果藤的乙醇浸提物活性最強。相較于中草藥單體物質，單味中草藥提取物的提取工藝相對簡單，副作用低，可以飼料添加劑的形式應用到豬飼料和飲水中。然而單味中草藥提取物的成分復雜，缺乏其抗病毒作用機制研究，無法保證其臨床應用的安全性。

3 中草藥復方制劑

復方中藥是中醫治療疾病的主要形式和中醫的精髓，既體現了中醫的“辨證論治”，又強調了中醫的“整體觀念”。PED 在中獸醫辯證中屬脾虛濕邪內聚，宜健脾利水止瀉［36］。朱買勛等［36］發現由白術、茯苓、黃芪和黃芩組成的復方術芩提取液能有效抑制PEDV 的致病變作用，其通過直接滅活病毒和抑制病毒復制而發揮抗病毒功效。香連溶液是由黃連、香薷、艾葉等多味中藥提取精制而成，具有殺滅病原、解毒消瘡的功效。常洪濤等［37］發現香連溶液不僅能夠抑制PEDV 的增殖，而且使用該溶液擦拭母豬乳頭并配合環境消毒或產前免疫，可有效降低仔豬PED 的發病率。與香連溶液類似，由杜仲、桑葉等多味中藥組成的杜桑溶液也具有抑制PEDV 增殖的活性，利用該溶液擦拭母豬乳頭并配合環境消毒或母豬產前免疫可有效降低仔豬PED 的發病率［38］，暗示香連溶液和杜桑溶液在阻斷豬場大面積感染PEDV 中具有較大的應用潛力。由黃芩和秦皮等組成的復方中藥，經水煎煮灌服PEDV 感染的仔豬，治愈率可達86.67%；組織觀察發現該復方藥可加速消化道黏膜修復，還可減輕病毒誘導的炎癥反應［39］。此外，該復方中藥可顯著提高腸道單胺氧化酶、琥珀酸脫氫酶等消化酶的活性，促進感染期仔豬對營養物質的吸收，改善機體的免疫能力［40］。王亞欣等［41］采用不同劑量由黃連、魚腥草等組成的復方制劑治療患病仔豬時，發現該復方中藥可治愈53.3%-66.6%的患病仔豬和降低60%以上的仔豬死亡率，并且還能改善仔豬的生長性能和腸道健康。另外，Kim 等［42］用紫花地丁、蒲公英、板藍根和黃連組成的復方中藥對感染PEDV 的仔豬進行保護性試驗，仔豬在平均日增重、腸絨毛萎縮和隱窩增生程度方面均有顯著改善。綜上，復方中藥匯集了多種單味中藥的活性成分，不僅可以間接抑制病毒活性或直接殺滅病毒粒子，而且還能調控機體免疫反應，降低病毒感染造成的損傷，同時還可提高消化道酶活性，修復胃腸道的消化功能。

4 藻類天然產物

藻類含有陸生植物不具有的天然活性物質，近年來多項研究發現并證實多種藻類活性物質具有抗病毒感染的作用。Griffithsin 是從海洋紅藻Griffithsiaspp.提取物中分離到的一種高甘露糖型植物凝集素，最初被發現具有抗HIV 的作用，隨后在抑制PEDV、PDCoV 等病毒感染的活性相繼被證實［43-44］。在PEDV 感染中，Griffithsin 通過阻礙病毒的附著以及干擾病毒在細胞間的傳播發揮抗病毒效應，8 μg/mL重組Griffithsin 可降低細胞中約80% PEDV 的感染，且對細胞無毒性［44］。基于Griffithsin 對SARS-CoV、PDCoV 等冠狀病毒的研究發現，該分子能與冠狀病毒的棘突蛋白S 特異性結合，阻斷病毒入侵［44］。因此，Griffithsin 在開發以冠狀病毒入侵為靶點的抗病毒藥物中具有巨大的潛力。褐藻苷苔的多酚類活性物質具有良好的抗PEDV 活性。Kwon 等［45］從褐藻苷苔中發現2 種在PEDV 感染的晚期對病毒RNA 和蛋白的合成表現出強烈抑制活性的多酚類物質，并且可通過血凝抑制反應阻礙病毒的入侵。在此之前，Park 等［46］也從褐藻苷苔中鑒定到1 種二鵝掌菜酚的多酚化合物能抑制SARS-CoV 3CLpro的活性，并發揮抗SARS-CoV 功效。由此可見，褐藻苷苔多酚具有較為廣泛的抗冠狀病毒活性，具有進一步開發和應用潛力。

5 微生物代謝物

微生物的代謝產物具有豐富的生物活性，在抗氧化、抗病毒、抗細菌、免疫調節和腸道菌群調節等方面發揮重要的生物學功能。表面活性素（surfactin）是枯草芽孢桿菌產生的一種由七肽和脂肪酸組成的環狀脂肽表面活性劑，其在抑制PEDV感染中發揮重要作用。Yuan 等［47］利用從枯草芽孢桿菌的發酵液中提取的surfactin 處理PEDV 感染的Vero 細胞發現，surfactin 可直接作用于病毒粒子，以較低的劑量（15 μg/mL）即可完全抑制病毒的復制。作為一種脂肽分子，surfactin 能直接插入到PEDV囊膜中，在入侵時阻礙病毒囊膜與細胞膜融合，從而阻斷囊膜病毒的感染［47］。另外，利用該物質預先灌服仔豬后，可保護仔豬免受PEDV 的感染［47］，提示表面活性素具有較大的臨床應用前景。來源于嗜鹽性放線菌類鏈霉菌（Streptomycessp.）產生的吲哚倍半萜類化合物xiamycins 也具有抗PEDV 活性。Kim 等［48］從鹽田源鏈霉菌的代謝物種鑒定出3 種xiamycins（C-E），其中xiamycin D 通過抑制病毒結構蛋白的表達發揮抗病毒活性。此外，由白色鏈霉菌產生的鹽霉素也可通過抑制病毒的入侵和復制發揮抗病毒活性，同時該物質可改善PEDV 感染誘導的ERK1/2 和p38MAPK 信號通路激活反應，但不影響ROS 產生，暗示鹽霉素可能通過調控ERK1/2 和p38MAPK 通路發揮抗病毒活性［49］。除了細菌之外，由真菌、地衣產生的麥角甾醇過氧化物（ergosterol peroxide，EP）也表現出抗PEDV 活性，其不但能夠直接滅活PEDV 病毒粒子，而且在病毒內化、復制和釋放階段發揮抗病毒活性［50］。PEDV 感染時可通過線粒體途徑引發細胞凋亡，以促進病毒增殖和細胞病變的產生，而EP 則可通過降低PEDV 感染時引起的線粒體膜電位差，從而抑制p53 蛋白的激活和ROS 生成，緩解PEDV 誘導的細胞凋亡反應。

6 動物來源的活性物質

月桂酸甘油酯是一種主要存在于母乳中的中鏈脂肪酸，具有良好的乳化和抗菌效果，被廣泛用于食品、日用品或化妝品中。Zhang 等［12］證實月桂酸甘油酯具有抗PEDV 的功能，可改善患病仔豬的臨床癥狀、腸絨毛損傷，提高機體IFNs 及其他免疫相關因子的表達，暗示月桂酸甘油酯可能通過調控機體免疫應答并維持體內穩態發揮抗PEDV 功能。因此，基于月桂酸甘油酯良好的乳化性、適口性和廉價易得等特點，具有開發成飼料添加劑的潛力。褪黑素是松果腺分泌的吲哚類物質，起到調節機體生物節律的功能。研究發現其具有抑制PEDV 增殖的功能，盡管不能直接殺滅病毒粒子，但在病毒侵入細胞以及病毒復制早期表現抗病毒效應［51］。同時，褪黑素對TGEV 和PDCoV 也具有抑制活性，表明褪黑素具有廣泛的抗冠狀病毒活性［51］。此外，來自甲殼類動物的殼聚糖具有直接殺滅PEDV 的活性，可作為PEDV 甚至其他冠狀病毒潛在的消毒劑［52］。不同天然產物抗PEDV 的功效及作用機制見表1。

表1 抗PEDV 感染的天然產物Table 1 Natural products against porcine epidemic diarrhea virus

7 小結與展望

PED 的防控是困擾當前養豬業的大難題之一，現有的疫苗難以預防多種PEDV 變異株的感染。天然產物以其豐富多樣的活性成分和多靶點、多途徑的抗病毒活性為PED 的防治提供了可能。近年來，越來越多的研究發現并證實了中草藥單體、單味中藥提取物、中藥復方制劑、微生物代謝物、藻類和動物來源的天然產物具有抗PEDV 的活性，其抑制PEDV 的方式主要有：（1）直接殺滅病毒；（2）作用于病毒蛋白抑制病毒吸附、入侵、復制和合成；（3）調節宿主免疫反應增強機體抗病毒效應；（4）修復并改善機體消化道功能，降低ROS 對細胞損傷和炎癥反應（圖1）。

圖1 不同抗病毒天然產物靶向PEDV 的復制周期Fig.1 Different natural antiviral products target for the replication cycle of PEDV

盡管目前發現多種天然產物在抗PEDV 方面具有較大的應用價值，但都停留在實驗室研究階段，缺乏動物試驗和臨床藥物安全評價。同時，天然產物種類繁多，提取工藝相對復雜，分離后的穩定性也難以保證。因此，針對天然產物的抗PEDV 應用還有許多亟待解決的問題，如中草藥抗PEDV 主要活性成分和作用機制，天然產物的分離提取工藝和活性評價，抗PEDV 活性物質動物試驗和安全性評估，中草藥提取物與疫苗聯合使用等。針對這些問題，采用分子虛擬對接以及蛋白質組學、代謝組學和化學物質組等多組學的技術挖掘并解析中草藥的活性成分和抗病毒機制，對抗冠狀病毒藥物的創制和疾病防控具有重要的指導意義。