藜麥NHX基因家族鑒定及鹽脅迫下表達分析

張業猛 朱麗麗 陳志國

（1.中國科學院大學，北京 100049；2.中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室 中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001；3.青海省作物分子育種重點實驗室，西寧 810001）

土壤鹽堿化是影響植物生長發育的主要非生物脅迫因素之一，土壤中高濃度的Na+、Cl-不僅造成生理干旱，過量積累也會引起離子毒害，破環植物的正常生理代謝［1-2］。長期的進化過程中植物各自形成了獨特的代謝和調控機制來響應鹽脅迫［3］。其中NHX 家族蛋白為Na+/H+逆向轉運蛋白，含有Na+/H+exchange（PF00999）蛋白結構域，屬于CPA1基因家族（cation：proton antiporter-1 family），廣泛存在于細菌、酵母、植物和動物中，主要參與調控細胞內的離子重建和pH 平衡［4-5］。對NHX基因家族基于全基因組水平進行鑒定、分類和分析，不僅可以為NHXs基因應答鹽脅迫機制提供重要信息，而且為作物改良提供候選基因。

自1976年，Ratner 等［6］在大麥中發現NHX基因之后，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［7］、水稻（Oryza sativa）［8］、普通小麥（Triticum aestivumssp.aestivum）［9］和玉米（Zea mays）［10］等植物中都相繼發現了NHX基因。隨著對NHX基因的深入研究，發現其不僅調控植物的生長發育過程，也受到各種非生物脅迫和激素的誘導［11-13］。如鹽脅迫條件下，白菜（Brassica campestrisssp.chinensis）中BrNHX1-1和BrNHX1-2的轉錄水平在BrNHXs成員中上調最高［14］。聚乙二醇處理條件下，大豆（Glycine max）中GmNHX1的轉錄水平也顯著增加［15］。脫落酸處理條件下，葡萄（Vitis vinifera）中VvNHX1轉錄水平上調，而VvNHX5轉錄水平下調［16］。此外，過表達NHX基因可以顯著提升植物的耐鹽性，董麗君等［17］發現轉AlNHX1基因大豆系對鹽脅迫的耐受性顯著提升，Yarra 等［18］在茄子（Solanum melongenaL.）中過表達TaNHX2基因可以顯著提升其鹽堿條件下植物的耐鹽性表現，異源表達HtNHX1或HtNHX2可以增強水稻對鋁和土壤酸度的耐受性［19］。因此，NHX基因在植物中普遍存在，且在非生物脅迫應答過程中發揮著關鍵作用。

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）原產于南美洲安第斯地區，為莧科藜屬一年生葉草本植物，是喜冷涼的高海拔鹽生植物，具有較強耐旱、耐鹽堿和耐瘠薄等特征［20-22］。NHX基因雖然在多種植物中已有研究，但在藜麥中NHX基因家族的報道甚少。隨著藜麥基因組數據的公布［23］和生物信息學的不斷發展，有助于藜麥NHX基因家族在全基因組水平上進行鑒定與分析。對其理化性質、基因結構、系統發育等信息進行全面分析，研究藜麥NHX基因家族在鹽脅迫處理下的表達特性，為后續NHX基因功能研究和進一步利用該類基因進行藜麥的耐鹽性遺傳改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以青藜4 號為參試材料，品種認定編號：青認備2019001。

1.2 方法

1.2.1 藜麥NHX基因家族成員鑒定 藜麥、擬南芥、小麥、玉米基因組數據在Ensembl 數據庫（https://www.ensembl.org/index.html）下載，Na+/H+exchange 結構域的HMM 模型（PF00999）來自Pfam 數據庫（http://pfam.xfam.org/）。利用HMMER 3.0 進行序列比對，比對結果利用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）和Pfam 網站（http://pfam.xfam.org/）進行驗證，去除不含Na+/H+exchange 結構域的蛋白序列。

1.2.2 藜麥NHX 蛋白的理化性質分析 利用ExPASy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件對藜麥NHXs 蛋白序列長度、相對分子量、理論等電點、親水性、不穩定系數進行分析，采用Cell-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plantmulti/）在線軟件對NHXs 蛋白進行亞細胞定位預測。

1.2.3 藜麥NHX基因家族成員的基因結構和保守結構域分析 使用GSDS 2.0（http://gsds.gao-lab.org/index.php）在線軟件對NHXs基因結構進行可視化分析，采用MEME 4.12 進行NHXs 蛋白motif 分析，通過TBtools 進行可視化。

1.2.4 藜麥NHX基因家族成員系統發育樹構建 利用MRGA 7.0 中Neighbor-joining 法，設置Bootstrap值為1 000，對HMMER 搜索到的藜麥、擬南芥、小麥和玉米的NHXs基因進行系統發育進化樹的構建，采用iTOL（https://itol.embl.de/）在線軟件進行調整。

1.2.5 鹽脅迫處理 挑選籽粒飽滿、大小一致的種子，用75%的乙醇溶液消毒5 min 后，無菌水沖洗至干凈無味，用濾紙吸取種子表面水分，平整鋪放在放有2 層濾紙的種子萌發盒中，置于12 h（25℃）光照/12 h（20℃）黑暗條件的人工氣候培養箱中萌發。萌發1 d 后，選取生長狀態良好、一致的幼苗進行300 mmol/L NaCl 脅迫處理，分別于0、24、48和72 h 整株取樣，液氮迅速冷凍，-80℃保存備用。

1.2.6 藜麥鹽脅迫條件下表達模式分析 總RNA提取和cDNA 模板第一鏈的制備分別采用生工生物有限公司（上海）的植物總RNA 快速提取試劑盒和AMV 第一鏈cDNA 合成試劑盒。產物在-80℃保存，委托生工生物有限公司進行轉錄組測序。選取4 個具有不同表達模式的NHX基因（AUR62041754、AUR62027477、AUR62043892和AUR62017691） 進行RT-qPCR 驗證轉錄組數據。引物在生工生物有限公司合成（表1），反應體系為20 μL（cDNA 1 μL、上下游引物各0.8 μL、MIX 10.4 μL、ddH2O 7 μL）。反應程序為95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 34 s、95℃15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s，共35 個循環，3 次生物學重復。

表1 藜麥NHXs 基因實時熒光定量引物Table 1 RT-qPCR primers of NHXs in quinoa

1.2.7 數據分析 數據采用Excel 2010 進行統計處理，Graphpad 9.2 進行作圖。

2 結果

2.1 藜麥NHXs蛋白理化性質分析及亞細胞定位預測

在藜麥基因組中共鑒定出46 個NHXs 蛋白（表2），其蛋白序列差異較大，長度為109-1 820 aa，分子質量為11 472.74-204 381.58 Da。等電點為5.00-9.27，其中有19 個為堿性蛋白。親水性為-0.226-1.112，除AUR62009395編碼的蛋白以外，其他全為親水蛋白。不穩定指數在21.71-50.73 之間，有11個不穩定系數大于40，為不穩定蛋白，其余全為穩定蛋白。亞細胞定位預測顯示，僅有AUR62033334、AUR62004319和AUR62033325編碼的蛋白定位在細胞核，其余都定位在細胞膜或液泡。

表2 藜麥NHXs 蛋白的理化性質及亞細胞定位Table 2 Physicochemical properties and subcellular localizations of quinoa NHXs proteins

2.2 藜麥NHX基因家族基因結構分析

根據NHX基因家族的序列信息繪制每個基因的結構，結果（圖1）顯示，46 個NHXs基因外顯子數量為2-24 個，內含子為1-23 個，結構差異較大。通過系統發育進化樹得出藜麥NHXs基因分為5個亞組（Subgroup I-V），且在進化樹中位置相近的NHXs具有相似的基因結構。

圖1 藜麥NHXs 基因系統進化樹和基因結構Fig.1 Phylogenetic tree and gene structure of NHXs genes in quinoa

2.3 藜麥HNX基因家族motif分析

根據46 個NHXs 蛋白的全長序列預測到10個保守結構域（圖2），每個motif 的E 值都顯著。motif 的長度在21-50 個保守氨基酸，其中motif 1 最長，含有50 個保守氨基酸，具有33 個位點；motif 8-10 最短，含有21 個保守氨基酸，位點分別為28、30 和39。此外，在進化樹中位置相近的NHXs蛋白具有相似motif 結構（圖3），其中Subgroup I、II、III 和IV 中除AUR62008394 和AUR62021702 以外，41 個NHXs 蛋白N 端都含有motif 7，高度保守。Subgroup V 中的5 條NHXs 蛋白都包含motif 10，N端為motif 7 或motif 10。

圖3 藜麥NHXs 基因motif 分析Fig.3 Motif analysis of NHXs gene in quinoa

2.4 藜麥NHXs蛋白序列系統發育樹分析

為分析藜麥NHXs 蛋白的進化，將擬南芥（60個）、小麥（119 個）、玉米（66 個）和藜麥（46 個）共291 個含有Na+/H+exchange 保守結構域的蛋白序列進行系統進化分析（圖4）發現，291 個蛋白可分為4 類，分別命名為Group I、Group II、Group III 和Group IV。其中Group I 中含有63 個蛋白序列，擬南芥、小麥、玉米和藜麥分別含有10、27、18 和8個；Group II 含有86 個蛋白質序列，擬南芥、小麥、玉米和藜麥分別含有15、42、25 和4 個；Group III含有29 個蛋白質序列，擬南芥、小麥、玉米和藜麥分別含有3、11、10 和5 個；Group IV 含有113 個蛋白質序列，擬南芥、小麥、玉米和藜麥分別含有32、39、13 和29 個。

圖4 擬南芥、小麥、玉米和藜麥的NHXs 蛋白的系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of NHXs proteins in Arabidopsis，wheat，maize and quinoa

2.5 藜麥NHXs基因鹽脅迫下表達模式及GO注釋

NaCl 脅迫下轉錄組分析結果（圖5-A）顯示，隨脅迫時間增加，16 個NHXs 基因的表達模式為先上升后下降，10 個一直上升，9 個一直下降，11 個無明顯變化。通過GO 注釋到37 個具有基因注釋的NHXs 基因，其中分子功能4 個，生物學過程33 個。4 個分子功能基因編碼的蛋白為離子跨膜轉運蛋白活性基因，33 個生物學過程基因包含1 個金屬離子穩態、1 個鈉離子質膜導入、1 個正向調控代謝過程、21 個穩態過程、4 個蛋白質定位、4 個調節代謝過程和1 個鉀離子穩態基因（圖5-B）。選擇表達模式不同的4 個NHX基因進行RT-qPCR 驗證轉錄組準確性發現，AUR62017691隨脅迫時間的增加表達量上升，AUR62043892隨脅迫時間的增加表達量先上升后下降，而AUR62041754和AUR62027477隨脅迫時間的增加表達量均降低，與轉錄組結果基本一致（圖5-C）。

圖5 藜麥NHXs 基因表達模式與GO 注釋Fig.5 Gene expression patterns and GO annotations of NHXs in quinoa

3 討論

3.1 藜麥NHXs基因的結構與系統進化

NHXs 蛋白主要依靠液泡膜質子泵建立的質子濃度差提供能量進行Na+和H+跨膜反向運輸，將Na+區隔化，可以降低胞質中的滲透勢，也避免了過高的離子濃度對胞質中細胞器的損傷［25］。液泡膜NHXs 蛋白與質膜上的NHXs 蛋白協同調控整個植株的鹽分分配，構成了細胞內鹽分區隔化的基礎。前人對NHX基因家族已有大量研究，且多個物種的NHXs基因家族已經被鑒定出來，例如在葡萄中發現了8 個NHX基因家族成員［26］，在香蕉（Musa acuminata）中鑒定出了11 個NHX基因家族成員［27］。藜麥在我國是一種新型的小宗作物，具有較強的耐鹽性［20］，Na+在鹽囊泡中大量積累和液泡區隔化以維持細胞內離子穩態，是藜麥適應鹽脅迫的重要策略。因此本研究基于藜麥基因組數據，共鑒定了46個NHXs基因，編碼46 個NHXs 蛋白，在進化樹中位置相近的NHXs基因具有相近的結構，NHXs 蛋白具有相似motif 結構，并且在擬南芥、小麥和玉米中分別鑒定出含有Na+/H+exchange 結構域的NHXs 蛋白60、119 和66 個，對擬南芥、小麥、玉米和藜麥中鑒定的291 個NHXs 蛋白親緣關系進行分析發現，4 種植物在系統進化樹中分布均勻，并未出現同一植物的NHXs 蛋白成員聚在同一分支中，說明不同植物間NHXs 蛋白多為直系同源蛋白。推測Na+區隔化是藜麥應對鹽脅迫的重要機制之一，且與擬南芥、小麥和玉米的調控機制相似。

3.2 藜麥NHXs基因參與鹽脅迫條件下的離子穩態和鹽分分配

隨著高通量測序技術及現代分子克隆技術的發展，越來越多的NHX 蛋白在植物、動物和真菌中被發現，并將NHXs 蛋白家族分為Class-I 和Class-II 兩個亞組，Class-I 主要定位在液泡膜，Class-II 主要定位在小囊泡內，且二者具有20%-25%的同源性［28］。此外，Lu 等［29］也表示植物中的NHXs 蛋白主要分為兩類，一類主要定位在質膜上，另一類主要定位在液泡膜上。藜麥中鑒定出的46 個NHX蛋白通過亞細胞定位顯示多數蛋白定位在細胞膜和液泡中，推測該基因家族在藜麥中集中在質膜或內膜系統表達，這與多種植物中NHXs 蛋白的定位一致［27，30］。并且越來越多的研究結果表明，過表達NHXs 基因可以顯著提升植株對鹽脅迫的耐受性［17-18］。例如，郝東風等［31］將鹽角草（Salicornia）的NHX基因導入甘藍型油菜（B.napus）中可以提升植株對NaCl 脅迫的耐受性。趙云霞等［32］將無苞芥（Arabidopsis pumila）中OpNHX1基因導入到擬南芥中可以顯著提升轉基因植株在鹽脅迫下的存活率。而藜麥中鑒定出的46 個NHXs基因在NaCl 脅迫下，有26 個隨脅迫時間逐漸升高，9 個隨脅迫時間逐漸下降，但是響應時間和表達量存在較大差異，表明35 個NaCl 脅迫誘導表達的NHXs基因在藜麥鹽脅迫過程響應機制存在差異，與Ruiz 等［33］報道的藜麥在鹽脅迫條件下，響應基因的表達具有時間依賴性一致。此外，46 個NHXs基因通過GO 注釋到37 個，其中參與生物學過程的33 個，具有分子功能的4 個，2 級注釋多是參與離子、細胞穩態和離子跨膜運輸過程。因此，推測受到鹽脅迫誘導表達且GO 注釋到功能的35 個NHXs基因，參與調控藜麥鹽脅迫條件下的離子穩態和鹽分分配。

4 結論

共鑒定出46 個藜麥NHX基因家族成員，編碼46 個NHX 蛋白，同一亞組具有相似的基因結構和蛋白質motif，多數定位在細胞膜和液泡中，與小麥、玉米、擬南芥為直系同源蛋白。其中35 個參與藜麥鹽脅迫調控過程，為NHXs基因家族響應鹽脅迫的分子機制研究奠定理論基礎。