多花黃精產(chǎn)吲哚乙酸內(nèi)生菌的分離篩選及其對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響

杜佳慧 徐偉芳 楊曉冬 譚松 尹登科，2，3 劉園旭，2

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，合肥 230012；3.中藥研究與開發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012）

多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua.）為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）多年生草本藥用植物，是2015年版《中國(guó)藥典》收載的中藥黃精基原植物之一［1］。多花黃精以其干燥根莖入藥，有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾益腎等功效，多用于治療脾胃氣虛、肺虛燥咳、體倦乏力等癥，是傳統(tǒng)經(jīng)典的藥食同源植物之一［2-3］。目前，多花黃精的繁殖方式主要依靠無(wú)性繁殖和有性繁殖［4］。其中，根莖無(wú)性繁殖是黃精傳統(tǒng)繁殖方式，但這種方式繁殖系數(shù)低，不僅消耗大量藥材，而且存在著病蟲害嚴(yán)重及種性退化等問題［5］；而有性種苗繁育技術(shù)可提高繁育系數(shù)，但種子具有形態(tài)及生理休眠等特性，萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)且萌發(fā)率較低，在一定程度上導(dǎo)致種子繁殖困難等一系列問題［6-7］。此外，隨著多花黃精市場(chǎng)需求量的增加，加上人類長(zhǎng)期以來(lái)的過度采挖，以及多花黃精生長(zhǎng)受限，資源恢復(fù)困難等因素導(dǎo)致多花黃精資源十分匱乏［8］。因此，尋找一種綠色環(huán)保、安全有效的方法來(lái)解決多花黃精資源短缺的現(xiàn)狀具有重要意義。

植物內(nèi)生菌（endophyte）是指生活史中一定階段或全部階段在健康植物組織和器官內(nèi)部與植物共生，但不引起宿主植物發(fā)生明顯病害特征的一類微生物群體，包括內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌［9］。作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，內(nèi)生菌構(gòu)筑了宿主植物的健康屏障，且可通過垂直傳播使子代植物具有相似的內(nèi)生菌群［10］。內(nèi)生菌可通過產(chǎn)生植物激素，如吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）來(lái)直接促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)［11］。IAA 是一種調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的重要信號(hào)物質(zhì)，其在植物生長(zhǎng)過程中起到促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增加細(xì)胞體積和質(zhì)量、促進(jìn)細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)植物生根等方面的作用［12-14］。有關(guān)玉米［15］、花生［16］、馬鈴薯［17］、辣椒［18］等多種植物內(nèi)生菌的研究結(jié)果表明，產(chǎn)IAA 內(nèi)生菌因能促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)與增強(qiáng)植物抗逆性而被廣泛應(yīng)用，具有研制成微生物肥料的巨大潛力。然而，利用產(chǎn)IAA 內(nèi)生菌來(lái)促進(jìn)黃精植物種子萌發(fā)和改善其生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。

因此，本研究以多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua.）為植物材料，利用傳統(tǒng)的組織分離培養(yǎng)法從多花黃精根部分離純化內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌，從中篩選出可分泌IAA 的內(nèi)生菌分離株，并利用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化檢測(cè)、分子生物學(xué)方法詳細(xì)鑒定目標(biāo)功能菌株，進(jìn)一步利用溫室種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其促生功效，以期為利用內(nèi)生菌解決多花黃精繁殖難題并提高宿主多花黃精產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料 新鮮多花黃精樣品采自安徽中醫(yī)藥大學(xué)“沁馨園”藥園（31°56′19″N，117°23′20″E），該植物經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山老師鑒定為百合科黃精屬的多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua.）。黃精種子購(gòu)自中藥植物市場(chǎng)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 高氏I 號(hào)培養(yǎng)基（GA）：可溶性淀粉20.00 g，KNO31.00 g，NaCl 0.50 g，K2HPO40.50 g，MgSO40.50 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂15.00-20.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2-7.4；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10.00 g，牛肉膏3.00 g，NaCl 5.00 g，瓊脂15.00-20.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2-7.4；Luria-Bertani 固體培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，NaCl 10.00 g，瓊脂15.00-20.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2-7.4；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂15.00-20.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然；察氏培養(yǎng)基（CZA）：NaNO33.00 g，K2HPO41.00 g，KCl 0.50 g，MgSO40.50 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30.00 g，瓊脂15.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然。以上培養(yǎng)基不加瓊脂即為對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基，且均在121℃高壓滅菌20 min 備用。

1.1.3 主要試劑 基因組DNA 提取試劑盒PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent（ 美國(guó)ABI 公司，批號(hào)4318930）；革蘭氏染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G1060）；細(xì)菌生理生化檢測(cè)鑒定試劑盒（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)5110110）；99.8%吲哚乙酸（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B21810）；Taq PCR Mix 預(yù)混液、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker、DNA 引物等常規(guī)分子試劑（上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)分別為B639295-0005，B500350-0500）；可溶性淀粉、蔗糖（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為S11006、S11055），蛋白胨、牛肉膏（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為T8490、G8270），葡萄糖、NaCl 等（國(guó)產(chǎn)分析純，批號(hào)分別為10010518、10016318）。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 SW-CJ-1D 超凈工作臺(tái)（蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司），41317065 電熱恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo），THZ-82A 數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器（常州普天儀器制造有限公司），YM100 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司），427029 倒置顯微鏡（德國(guó)萊卡），3711293 PCR 儀（德國(guó)耶拿），DYY-8C 型水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司），D07745 凝膠成像儀（德國(guó)耶拿），UV-1000 型紫外可見分光光度計(jì)（上海翱藝儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多花黃精內(nèi)生菌的分離與保種 參考謝潔等［19］的方法進(jìn)行多花黃精根部的表面消毒和內(nèi)生菌的分離，并利用平板劃線法和菌絲頂端純化法純化內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌。純化后的內(nèi)生菌進(jìn)行甘油保種，并置于-80℃冰箱備用。

1.2.2 產(chǎn)IAA 菌株的篩選 采用Salkowski 比色法［20］對(duì)IAA 產(chǎn)生菌進(jìn)行篩選。將獲得的內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌活化后，分別接種于LB 液體培養(yǎng)基和PDB 培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，其中內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間為3 d，內(nèi)生真菌培養(yǎng)溫度為25℃，發(fā)酵時(shí)間為7 d。發(fā)酵結(jié)束后，在12 000 r/min 條件下離心30 min，取發(fā)酵上清液進(jìn)行IAA 檢測(cè)，具體檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［20］。在本實(shí)驗(yàn)中，以培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，以30 mg/L IAA 標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，若待測(cè)菌株發(fā)酵液與Salkowski 顯色試劑的混合液出現(xiàn)紅色反應(yīng)，則說明有IAA 的產(chǎn)生，且紅色越深說明IAA 產(chǎn)量越高。

1.2.3 產(chǎn)IAA 菌株的定量檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取蒸餾水和IAA 標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為5、10、15、20、30、40、50、100 mg/L，將配置好的標(biāo)準(zhǔn)液與Salkowski 顯色劑按體積比1∶1 混合后室溫避光放置30 min。以蒸餾水與Salkowski 顯色劑等體積混合作為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD530處各濃度的吸光度，以IAA 標(biāo)準(zhǔn)品各濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

IAA 含量測(cè)定：將新鮮的產(chǎn)IAA 菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，于28℃的搖床振蕩培養(yǎng)。發(fā)酵24、36、72、96 和120 h 后，按上述方法分別測(cè)定1 mL菌株發(fā)酵上清液與Salkowski 顯色劑反應(yīng)后的OD530的吸光值，再根據(jù)IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的IAA含量。

1.2.4 產(chǎn)IAA 菌株的菌種鑒定

1.2.4.1 產(chǎn)IAA 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 將上述產(chǎn)IAA活性明顯且穩(wěn)定的促生菌接種于新鮮的LB 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24 h，觀察單菌落的大小、形狀、顏色、透明度等特征。同時(shí)，將培養(yǎng)24 h 和48 h 的細(xì)菌分別進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，具體操作方法見參考文獻(xiàn)［21］。

1.2.4.2 產(chǎn)IAA 菌株的生理生化鑒定 參照文獻(xiàn)［22］的方法進(jìn)行糖或醇（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇）的發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)及乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（MR-VP）等生理生化特性的測(cè)定。

1.2.4.3 產(chǎn)IAA 菌株的分子生物學(xué)鑒定 利用基因組試劑盒Prepman Ultra Sample Preparation Reagent（Applied Biosystems，USA）說明書中的方法提取各菌株的總DNA，并以其為模板，參照文獻(xiàn)［23］中的細(xì)菌通用引物27F 與1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（總體積25.00 μL）與PCR 反應(yīng)條件分別參照文獻(xiàn)［24-25］。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將獲得的基因序列與National Center for Biotechnology Information（NCBI）的網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)，并下載同源性較高序列，使用MEGA 7.0 軟件，以鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。以上測(cè)序結(jié)果均提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，以獲得序列登錄號(hào)。

1.2.5 目標(biāo)菌株對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響 種子萌芽實(shí)驗(yàn)參照周新華［26］的方法并稍作修改，本研究共設(shè)4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組：（1）HNC2 菌株菌懸液；（2）HNC2 菌株發(fā)酵上清液；（3）HPB1 菌株菌懸液；（4）HPB1菌株發(fā)酵上清液。其中，菌懸液是由目標(biāo)菌株經(jīng)LB培養(yǎng)基發(fā)酵24 h 離心后，菌體沉淀用無(wú)菌水重懸并調(diào)節(jié)濃度為1.0×108CFU/mL，發(fā)酵上清液是由目標(biāo)菌株經(jīng)LB 培養(yǎng)基發(fā)酵24 h 離心后直接取上清獲得。另設(shè)3 個(gè)對(duì)照組：（1）無(wú)菌水；（2）LB 培養(yǎng)基；（3）IAA 標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg/L）。按上述分組進(jìn)行24 h 浸種處理，浸種結(jié)束后，取各組種子置于鋪有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的玻璃平皿（直徑=9 cm）中，每皿20 粒種子，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，于25℃、12 h/12 h 光照黑暗交替、濕度為90%的人工氣候培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每天加無(wú)菌水維持濕度，連續(xù)保濕培養(yǎng)22 d，并于第12 天調(diào)查種子發(fā)芽勢(shì)，第22 天統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)幼苗的胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)以及子葉寬度等指標(biāo)，觀察目標(biāo)菌株菌懸液與發(fā)酵上清液對(duì)黃精種子發(fā)芽的影響［27］。

種子發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率計(jì)算方式：發(fā)芽勢(shì)（%）=處理后第12 天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽率（%）=處理后第22 天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析與處理 IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線和含量測(cè)定采用Origin 2018 軟件作圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，多組間差異比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，均數(shù)多重比較采用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃精內(nèi)生菌的分離

利用LB、PDA、NA、GA 和CZA 培養(yǎng)基，現(xiàn)從多花黃精根部中分離培養(yǎng)并純化出內(nèi)生菌34 株，包括內(nèi)生細(xì)菌25 株，內(nèi)生真菌9 株（表1）。純化后的菌落形態(tài)如圖1和2 所示。

表1 多花黃精內(nèi)生菌分離情況統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of endophytes isolated from Polygonatum cyrtonema Hua.

圖1 部分多花黃精內(nèi)生細(xì)菌在LB 培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.1 Morphology of some endophytic bacteria isolated from Polygonatum cyrtonema Hua.on LB medium

圖2 多花黃精內(nèi)生真菌在PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)圖Fig.2 Morphology of endophytic fungi isolated from Polygonatum cyrtonema Hua.on PDA medium

2.2 產(chǎn)IAA菌株的篩選

以分離獲得的多花黃精內(nèi)生菌為基礎(chǔ)，從中初步篩選出7 株具有產(chǎn)IAA 功能的內(nèi)生細(xì)菌，具體初篩情況如表2所示。在本研究中，并未篩選到產(chǎn)IAA 能力的內(nèi)生真菌。經(jīng)多次IAA 活性檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，編號(hào)為HNC2、HPB1、HPB3 的內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液能穩(wěn)定與Salkowski 試劑反應(yīng)呈紅色（圖3）。

圖3 多花黃精內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)IAA 能力的定性檢測(cè)Fig.3 Qualitative detection of IAA-production ability of endophytic bacteria isolated from Polygonatum cyrtonema Hua.

表2 產(chǎn)IAA 能力的多花黃精內(nèi)生菌初篩統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of IAA-producing ability of endophytic bacteria isolated from Polygonatum cyrtonema Hua.

配制不同濃度IAA 溶液制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4-A所示，標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=0.015 3x+0.055 2，R2=0.992 9。促生菌株的IAA 定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株分泌IAA 的能力均呈現(xiàn)先上升的趨勢(shì)，達(dá)96 h 后，HNC2 菌株和HPB1 菌株分泌IAA的能力呈下降趨勢(shì)，HPB3 菌株微呈上升趨勢(shì)。其中HNC2 和HPB1 菌株分泌IAA 的含量在第96 小時(shí)達(dá)到最高值，分別可達(dá)4.833 mg/L、4.608 mg/L，均明顯高于HPB3 菌株在發(fā)酵第120 小時(shí)分泌IAA 的峰值（4.524 mg/L）（圖4-B）；同時(shí)HPB3 菌株在每個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)分泌IAA 的能力均明顯弱于HNC2 和HPB1 菌株。因此，將兩株分泌IAA 能力穩(wěn)定且含量較高的內(nèi)生細(xì)菌HNC2 和HPB1 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。

圖4 IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線（A）與多花黃精內(nèi)生菌分泌IAA 的含量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)（B）Fig.4 IAA standard curve（A）and trends of the content of IAA secreted by endophytic bacteria of Polygonatum cyrtonema Hua.over time（B）

2.3 產(chǎn)IAA菌株HNC2和HPB1的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征觀察 HNC2 菌株在LB 培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24 h，菌落呈白色、圓形，表面光滑不透明（圖5-A），該菌株顯微形態(tài)觀察為長(zhǎng)桿狀，革蘭氏染色呈藍(lán)紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌（圖5-B），芽孢染色結(jié)果表明該菌株能產(chǎn)芽孢（圖5-C）；HPB1 菌落形態(tài)則為表面光滑的圓形，乳白色，且為透明狀（圖5-D），顯微形態(tài)觀察為圓球形，革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其為革蘭氏陽(yáng)性菌（圖5-E），不能產(chǎn)生芽孢。

圖5 HNC2 和HPB1 菌株的菌落及菌體形態(tài)特征Fig.5 Colony and morphological characteristics of HNC2 strain and HPB1 strain

2.3.2 生理生化檢測(cè) 生理生化檢測(cè)顯示：HNC2菌株可利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖；MR 試驗(yàn)陽(yáng)性；尿素試驗(yàn)為陰性。HPB1 菌株尿素試驗(yàn)為陽(yáng)性；不可利用糖類物質(zhì)如葡萄糖、乳糖等；MR 試驗(yàn)陰性。二者VP 試驗(yàn)均為陽(yáng)性；均可分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚；均可利用西蒙氏檸檬酸鹽；均可在半固體瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散生長(zhǎng)，表明其具有運(yùn)動(dòng)性；均不可利用乳糖、甘露醇；均不可分解培養(yǎng)基中含硫化合物（表3）。

表3 HNC2 和HPB1 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of HNC2 strain and HPB1 strain

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 以多花黃精產(chǎn)IAA 菌株HNC2 和HPB1 的DNA 為模板，經(jīng)PCR 反應(yīng)擴(kuò)增后，成功獲得長(zhǎng)度分別為1 454 bp、1 457 bp 的16S rDNA 基因序列。進(jìn)一步將序列提交至GenBank中，得到菌株登錄號(hào)分別為MZ298557、MZ315031。基于16S rDNA 的序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，HNC2 與登錄號(hào)為MT516449 的菌株Bacillussp.的相似性高達(dá)99.93%，并與其處于同一最小分支（圖6-A），而HPB1 菌株與登錄號(hào)為KY264989的菌株Staphylococcussp.同源性很高，且與其處于同一最小分支（圖6-B）。

圖6 HNC2 菌株（A）與HPB1 菌株（B）基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of HNC2 strain（A）and HPB1 strain（B）based on 16S rDNA sequence

結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征，及基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，故將HNC2 鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillussp.），命名為Bacilussp.HNC2，將HPB1 鑒定為葡萄球菌屬（Staphylococcussp.），命名為Staphylococcussp.HPB1。

2.4 產(chǎn)IAA菌株HNC2和HPB1對(duì)黃精種子萌芽的影響

將黃精種子進(jìn)行紙床培養(yǎng)，不同處理組的種子萌芽時(shí)間、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率以及萌發(fā)幼苗生長(zhǎng)狀況均有所差別。（1）從萌芽時(shí)間上看，HNC2 和HPB1發(fā)酵液處理組中的黃精種子分別在第4 天和第8 天開始發(fā)芽，而LB 培養(yǎng)基對(duì)照組則在第9 天開始發(fā)芽；HNC2 和HPB1 菌懸液處理組中的種子均在第6天開始發(fā)芽，而無(wú)菌水對(duì)照組則第11 天開始發(fā)芽，且IAA 陽(yáng)性對(duì)照組在第7 天開始發(fā)芽；（2）從發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率上看，無(wú)論是菌懸液處理組還是發(fā)酵液處理組，HNC2 菌株和HPB1 菌株均能明顯提高黃精種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，尤其是在發(fā)芽勢(shì)指標(biāo)上表現(xiàn)更為明顯：與LB 培養(yǎng)基對(duì)照相比，HNC2 發(fā)酵液處理組和HPB1 發(fā)酵液處理組的發(fā)芽勢(shì)分別提高了366.60%和133.40%；與無(wú)菌水對(duì)照相比，HNC2菌懸液處理組和HPB1 菌懸液處理組的發(fā)芽勢(shì)分別提高了173.58%和223.43%（表4）；（3）從幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)上看，盡管胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)及葉寬在各菌株間未出現(xiàn)顯著性差異，但仍可以看出，經(jīng)HNC2 菌懸液處理的種子胚芽長(zhǎng)（20.10 mm）優(yōu)于無(wú)菌水對(duì)照組（19.47 mm）；兩株菌懸液處理組種子胚根長(zhǎng)（HNC2 14.60 mm；HPB1 12.23 mm）及葉寬（HNC2 2.73 mm；HPB1 2.53 mm）優(yōu)于無(wú)菌水對(duì)照組（胚根長(zhǎng)6.83 mm；葉寬1.73 mm），這種促生效果亦體現(xiàn)在菌株發(fā)酵液處理組（表4）。

表4 內(nèi)生細(xì)菌HNC2 和HPB1 對(duì)黃精種子發(fā)芽的影響Table 4 Effects of endophytic bacteria HNC2 and HPB1 on the germination of Polygonatum seeds

3 討論

國(guó)內(nèi)外研究表明，植物內(nèi)生菌不僅可以有效提高宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育，且在增強(qiáng)植物對(duì)病蟲害抵抗能力方面亦發(fā)揮重要作用［28］。內(nèi)生菌可從溶磷、解鉀、固氮作用、產(chǎn)生鐵載體和分泌植物生長(zhǎng)激素［29］等方面直接促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)，也可通過產(chǎn)生抗菌化合物和分泌活性酶等提高宿主植物對(duì)各種病蟲害和病原菌的抵抗能力，從而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)［30］。Xu 等［31］從桑樹33 株拮抗菌中篩選出8 株能夠促進(jìn)桑苗生長(zhǎng)的內(nèi)生菌，其中芽孢桿菌屬Bacillussp.CW16-5 的促生能力最強(qiáng)；Swain 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，與未用細(xì)菌懸浮液處理的山藥相比，經(jīng)產(chǎn)IAA 的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌懸液處理后，山藥根和莖的生物量均有所提高；康慧穎等［33］從苜蓿組織內(nèi)分離得到能夠產(chǎn)生IAA 的短小芽孢桿菌B.pumilusALR33，且該菌株對(duì)紫花苜蓿的促生作用明顯；陽(yáng)湖榮等［34］從白術(shù)中分離得到能夠合成IAA的B.endophyticusAMR83，且該菌株能夠促進(jìn)白術(shù)組培苗根部生長(zhǎng)［34］；傅曉方等［35］從健康玉米植株根莖中分離篩選得到4 株均具有不同程度的固氮酶活性和產(chǎn)IAA 能力的菌株，其中L2A2 菌株被鑒定為巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri），其對(duì)小麥幼苗具有明顯的促生作用。綜合前人研究發(fā)現(xiàn)，以產(chǎn)IAA促生菌為生物肥料已廣泛應(yīng)用于中藥材等各類植物的生產(chǎn)研究上。

然而，截止目前，關(guān)于多花黃精內(nèi)生菌促生效果的報(bào)道較少。本研究從34 株多花黃精內(nèi)生菌中篩選出兩株高產(chǎn)IAA 的促生菌Bacillussp.HNC2 和Staphylococcussp.HPB1，其產(chǎn)IAA 能力分別可達(dá)4.833 mg/L、4.608 mg/L，明顯高于遲慧榮等［36］從多花黃精中分離得到的貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）產(chǎn)IAA 的含量0.008 29 mg/L。同時(shí)，黃精種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與無(wú)菌水和培養(yǎng)基對(duì)照相比，本研究篩選得到的兩株產(chǎn)IAA 菌株可顯著促進(jìn)宿主種子萌發(fā)及其幼苗生長(zhǎng)，這種經(jīng)內(nèi)生菌處理提高植株種子萌發(fā)的優(yōu)勢(shì)可能與其產(chǎn)生IAA，打破種子休眠，從而提高萌芽率有關(guān)。此外，HNC2 菌株促進(jìn)種子萌芽的能力優(yōu)于IAA 標(biāo)準(zhǔn)品，猜測(cè)該促生菌除了分泌IAA 外，還可能同時(shí)產(chǎn)生其他植物激素，或通過溶磷、解鉀和生物固氮等作用促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。本研究獲得的兩株多花黃精促生菌（Bacillussp.HNC2和Staphylococcussp.HPB1）在一定程度上可為制備微生物肥料提供新的菌種資源，但兩株菌株在多花黃精體內(nèi)的定植情況，及對(duì)野外條件下黃精植株生長(zhǎng)的影響不明確，有待進(jìn)一步研究與探索。

4 結(jié)論

本研究從多花黃精根部篩選出兩株具有穩(wěn)定高產(chǎn)IAA 的內(nèi)生細(xì)菌HNC2 和HPB1，經(jīng)鑒定分別為芽孢桿菌（Bacillussp.）和葡萄球菌（Staphylococcussp.）；黃精種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bacillussp.HNC2 和Staphylococcussp.HPB1 均對(duì)黃精種子萌發(fā)具有促生功效，具備開發(fā)作為微生物肥料的條件。