荒漠植物檸條根際土壤nifH基因熒光定量及固氮菌多樣性分析

劉爽 姚佳妮 沈聰 代金霞

（寧夏大學生命科學學院，銀川 750021）

荒漠生態系統是陸地生態系統中最為脆弱的系統之一，其物種組成和分布格局具有獨特性，且隨著生物土壤結皮、植被的不斷演變，微生物的群落結構和群落功能也會隨之發生變化［1］。荒漠植物根系與土壤微生物關系密切，植物根系及其分泌物為土壤微生物在荒漠化土壤中的定殖提供了源源不斷的植物源有機基質，而根際微生物為植物富集生長所必需的元素［2］，在荒漠植物的生長和抗逆方面起到了重要的作用。生物固氮是荒漠生態系統中氮素補充的重要途徑［3］。固氮微生物作為驅動氮循環的媒介，正受到越來越廣泛的關注［4］。固氮菌通過體內固氮酶催化生物固氮過程，編碼固氮酶的基因（包括nifH，nifK，nifD）在不同固氮生物中高度保守［5］，其中nifH 基因是最保守的，并且在系統發育分析中所產生的拓撲結構與16S rRNA 基因非常相似［6-7］，故被選為研究固氮微生物系統發育、多樣性和豐度的首選標記基因，以nifH 基因為靶基因的分子技術在生態學中的應用也為研究氮循環微生物群落提供了新的途徑。

目前對荒漠土壤中固氮菌多樣性、豐度和群落組成的了解仍然有限，已有的研究主要采用克隆和PCR-DGGE 等方法，無法反映荒漠區不同地域固氮微生物群落的全貌。因此開展荒漠生境中土壤固氮微生物的群落組成和多樣性研究，不僅有助于發掘新的功能類群或功能潛力，以從微觀的角度理解生態環境的變化，而且對了解荒漠土壤中氮素循環調節具有重要意義。檸條（Caraganaspp.）是我國西北地區荒漠、半荒漠及干旱草原地帶防風固沙的先鋒植物之一［8］，具備極強的抗旱性、抗寒性和耐鹽堿性，在維護干旱荒漠區的生態平衡和改善沙區環境中發揮著十分重要的生態學作用。本研究以寧夏荒漠區5 個檸條群落根際土壤為研究材料，以nifH基因為靶基因，采用熒光定量PCR 和高通量測序技術，分析荒漠生境下檸條根際土壤中nifH 基因豐度信息和固氮菌群落結構組成，結合分離培養方法對檸條根際固氮菌進行分離篩選和多樣性研究，旨在為進一步挖掘固氮菌資源、豐富荒漠區微生物資源庫提供基礎資料，也為深入探索荒漠化生境中植物根際微生物群落結構與功能之間的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 選取寧夏同心羅山（LS）、紅寺堡石炭溝（HSP）、沙坡頭固沙林場（SPT）、靈武棗泉煤礦（ZQ）和白芨灘甜水河林場（TSH）5 個荒漠檸條群落進行土壤樣品采集，采樣信息見圖1。采用五點取樣法，將檸條根周圍的土挖開，待根暴露出來后，將根部附著的土壤用毛刷輕輕刷取到滅菌離心管中，混勻后編號放于冰盒中。每個樣地采集3 份，共采集15 份土樣，一部分用于土壤理化性質測定，另一部分用于DNA 的提取。

圖1 檸條根際土壤采集地示意圖（審圖號：GS（2019）1822）Fig.1 Sampling sites of rhizosphere soil of Caragana spp.（Map inspection number：GS（2019）1822）

1.1.2 培養基 采用YMA 培養基（KH2PO40.25 g、K2HPO40.25 g、NaCl 0.1 g、酵母提取物3 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、甘露醇10.0 g、Rh 微量元素液4 mL（Rh微量元素液：H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L、蒸餾水加至1 000 mL）、聯合固氮類培養基（KH2PO40.4 g、K2HPO40.1 g、D-葡萄糖酸鈉5.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.1 g、CaCl20.02 g、FeCl30.01 g、酵母提取物 0.8 g、鉬酸鈉0.002 g、蒸餾水1 000 mL）、固氮類芽孢桿菌培養基（蔗糖10.0 g、蛋白胨1.0 g、酵母提取物0.8 g、NaCl 0.1 g、CaCO35.0 g、KH2PO40.2 g、K2HPO40.08 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蒸餾水1 000 mL）和無氮培養基（甘露醇10.0 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO4·2H2O 0.2 g、CaCO35.0 g、蒸餾水1 000 mL）進行固氮菌的分離。采用LB 培養基進行菌株的發酵。

1.2 方法

1.2.1nifH 基因實時熒光定量PCR

1.2.1.1 土壤樣品總DNA 提取 使用試劑盒提取根際土壤基因組總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 的抽提效果和完整性。

1.2.1.2 標準品制備 以提取的土壤DNA 為模板進行PCR 擴增，擴增引物采用nifH-F（5′-AAAGGYGG WATCGGYAARTCCACCAC-3′）和nifH-R（5′-TTGTTS GCSGCRTACATSGCCATCAT-3′），獲得約458 bp 的基因片段。PCR 產物純化后連接到 T 載體，篩選陽性克隆體提取質粒，10 倍梯度稀釋構建好的質粒樣本，選取標準品的10-3-10-8濃度梯度的標準質粒為模板進行熒光定量 PCR 擴增，用于制備標準曲線。

1.2.1.3nifH 基因熒光定量PCR 采用ABI7300 實時定量PCR 系統進行檢測，通過SYBR Green I 染料法測定固氮菌nifH 基因的拷貝數。每個樣品設3 次重復，以不加模板的反應管為陰性對照。擴增條件為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，擴增35 個循環，最后于72℃延伸10 min。以熒光強度達閾值時的循環數（Ct 值）與濃度梯度構建標準曲線。將得到的樣品 Ct 值代入標準曲線中，計算樣品中nifH 基因的拷貝數。

1.2.2nifH 基因的高通量測序 將回收的nifH 基因PCR 產物委托上海美吉生物技術有限公司進行Illumina 高通量測序。將得到的序列根據PE reads 之間的overlap 關系，成對的reads 拼接成一條序列，同時對reads 的質量和拼接的效果進行質控過濾，根據序列首尾兩端的barcode 和引物序列區分樣品得到有效序列，并校正序列方向，即為優化數據。再將樣本中的有效序列在97%水平上進行OTU 聚類，根據OTU 聚類結果，進行多樣性指數分析及測序深度檢測；根據分類學信息，在各個分類水平上對樣本的群落組成進行統計分析。

1.2.3 可培養固氮菌的分離及鑒定

1.2.3.1 固氮菌富集和初步篩選 取土壤10 g 加入裝有90 mL 分離培養基的三角瓶中，28℃、180 r/min振蕩富集培養24 h，然后按照1%接種量轉接到新的分離培養基中進一步富集培養，重復轉接3-4 次，然后用無菌水進行梯度稀釋（10-4-10-7），分別取200 μL 不同濃度梯度的土壤懸液涂布于對應的分離培養基中，28℃培養至菌落長出后，挑取單菌落分別在分離平板上劃線純化3-4 次，對菌落進行形態觀察與記錄，并在LB 培養基上對菌株進行去重復和保存。

1.2.3.2nifH 基因復篩 采用引物nifH-F/nifH-R 對菌株的nifH 基因進行PCR 擴增，陰性對照使用ddH2O 作為模板。挑選能夠擴增出目的片段為458 bp 左右的陽性菌株，經測序驗證后確定為固氮菌。

1.2.3.3 生理生化特性分析 對菌株進行革蘭氏染色、淀粉水解、接觸酶和硝酸鹽還原等生理生化，參照《常見細菌系統鑒定手冊》［9］和《伯杰細菌鑒定手冊》（第8 版）對菌株進行鑒定［10］。

1.2.3.4 菌株16S rRNA 基因序列擴增和測序 使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對菌株基因組DNA 的16S rRNA 基因全長序列進行PCR 擴增，產物經回收驗證后送上海生工生物工程有限公司測序，將得到的序列在NCBI 網站比對，選取相似度高的菌株作為參考菌株，應用MEGA 11.0 軟件構建系統發育樹。

1.2.4 數據處理 采用Excel 2017 進行數據處理，SPSS 23.0 進行單因素方差分析和Pearson 相關性分析。

2 結果

2.1 不同樣地檸條根際土壤固氮菌nifH基因的豐度分析

通過RT-qPCR 反應對5 個檸條群落根際土壤樣品中的nifH 基因含量進行檢測，結果表明（表1），各樣地中nifH 的拷貝數表現為LS＞TSH＞ZQ＞HSP＞SPT，其中LS 樣地的nifH 基因拷貝數顯著高于其它4 個樣地，而其它樣地間nifH 的拷貝數沒有顯著差異，SPT 樣地nifH 基因拷貝數最低，說明LS 樣地檸條根際土壤固氮菌含量顯著高于其他樣地，而SPT 樣地檸條根際土壤固氮菌含量最低。

表1 nifH 基因Ct 值和定量結果Table 1 Ct values and quantitative results of nifH gene

2.2 檸條根際土壤固氮菌多樣性和群落結構分析

2.2.1 檸條根際土壤固氮菌群落OTU 聚類及Alpha多樣性分析 本研究通過對5 個檸條樣地根際土樣固氮菌菌群進行Illumina Miseq 高通量測序，共獲得264 763 條有效序列，將序列相似性大于97%的有效序列進行聚類，共獲得5 871 個OTUs，各樣地nifH 基因測序深度指數范圍為98.39%-98.86%，說明測序深度能夠反映檸條根際真實的固氮菌群落組成及多樣性信息。不同樣地檸條根際土壤中固氮菌群落豐富度和多樣性存在差異，由表2中群落多樣性指數結果可知，表征群落豐富度的Sobs、Chao1 和Ace 指數在各樣地間的表現均為LS＜TSH＜HSP＜SPT＜ZQ，說明LS 樣地檸條根際土壤固氮菌的豐富度最低，而ZQ 樣地中固氮菌的豐富度最高；表征群落多樣性的Shannon 指數在各樣地中的表現為LS＜TSH＜HSP＜ZQ＜SPT，Simpson 指數為LS ＞HSP ＞ZQ ＞TSH ＞SPT，說明固氮菌菌群的多樣性為LS 樣地中最低，SPT 樣地則高于其他樣地。

表2 不同樣地固氮菌OTUs 數目及 Alpha 多樣性指數Table 2 Number of OTUs and Alpha diversity index of nitrogen-fixing bacteria at different sample sites

2.2.2 檸條根際土壤固氮菌的群落結構組成分析 測序結果通過物種注釋，5 份檸條根際土壤共獲得7 門12 綱26 科30 屬固氮菌。從科水平的Venn 圖可以看出（圖2-A），5 個樣地共有固氮菌11 個科，LS、SPT 各有1 個特有科，TSH 有4 個特有科。圖2-B 顯示，未分類的固氮菌在檸條根際占有較大比重，相對豐度為14.57%-56.51%。在可定義的科中，除SPT 樣地外，其余4 個樣地均以紅螺菌科（Rhodospirillaceae）為優勢菌群，相對豐度為23.71%-73.45%，在LS 樣地豐度最高；產堿菌科（Alcaligenaceae）為次優勢科，相對豐度在3.84%-13.68%之間。而SPT 的固氮菌群落與其它樣地差別較大，以葉桿菌科（Phyllobacteriaceae）為優勢科，相對豐度為22.77%，遠高于其它樣地，紅螺菌科為次優勢科，占17.43%；假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）和類芽孢桿菌科（Paenibacillaceae）也是5 個樣地的共有類群，它們的相對豐度在不同的樣地中差別較大。

圖2 檸條根際土壤固氮菌在科水平的Venn 圖（A）及群落組成柱形圖（B）Fig.2 Venn diagram（A）and column diagram（B）of community composition of nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere soil of Caragana spp.at family level

在屬水平上，5 個樣地共有屬12 個，SPT、LS和TSH 分別有特有屬1、2 和6 個。TSH 樣地分布有27 個屬，屬水平的多樣性顯著高于其他樣地（圖3-A）。群落組成結果顯示（圖3-B），5 個樣地中未分類的固氮菌相對豐度為16.89%-57.03%。在可定義的屬中，斯科曼氏球菌屬（Skermanella）是SPT以外4 個樣地共有的優勢屬，相對豐度為23.19%-71.14%，在LS 樣地中占絕對優勢，相對豐度高達71.14%；廣泛固氮氫自養單胞菌屬（Azohydromonas）是次優勢屬，相對豐度3.84%-13.68%。SPT 樣地中以中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）為優勢屬，相對豐度為22.77%，顯著高于其它4 個樣地（0.26%-5.83%），斯科曼氏球菌屬為次優勢屬，占17.09%。固氮菌屬（Azotobacter）雖是共有屬，但其相對豐度在各樣地間有較大差異，占0.41%-5.89%，在TSH中豐度最高。

圖3 檸條根際土壤固氮菌在屬水平的Venn 圖（A）及群落組成柱形圖（B）Fig.3 Venn diagram（A）and column diagram（B）of community composition of nitrogen-fixing bacteria in rhizosphere soil of Caragana spp.at genus level

2.3 環境因子相關性分析

將檸條根際土壤nifH 基因拷貝數與土壤理化性質進行Pearson 相關性分析，結果表明（表3），nifH基因拷貝數與土壤速效磷、有機質和總氮（P＜0.005）呈顯著正相關，且相關性較強，相關系數分別為0.924、0.965 和0.977。

表3 nifH 基因拷貝數與土壤理化性質的Pearson 相關分析Table 3 Pearson correlation analysis between nifH gene copy number and soil physicochemical properties

相關性Heatmap 圖通過相關性數值可視化展示樣本中不同的物種與環境變量之間的關系，評估微生物分類與環境變量之間的相關性。將30 個固氮菌類群和土壤理化性質進行Spearman 相關性分析，結果如圖4所示，土壤總氮（total nitrogen，TN）、速效氮（availliable nitrogen，AN）、總磷（total phosphorus，TP）和有機質（soil organic matter，SOM）顯著影響固氮菌群落組成。一些未分類的固氮菌如Unclassified_o__Rhizobiales和Unclassified_p__Proteobacteria等與SOM 和TN 極顯著負相關，而Unclassified_o_Burkholderiales與速效磷（availliable phosphorus，AP）、速效鉀（availliable kalium，AK）、SOM 和TN 極顯著正相關。慢生根瘤菌屬和弗蘭克氏菌屬（Frankia）受多種土壤因子影響，與AN 和pH 極顯著正相關，與SOM 和TN 顯著正相關；類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）與AK 和TK 顯著負相關，與AN 極顯著正相關。固氮菌屬與TN 和TP 顯著正相關。

2.4 檸條根際土壤可培養固氮菌的多樣性分析

2.4.1 固氮菌的生理生化特征測定結果 采用4 種分離培養基從5 個檸條群落根際土壤中分離出固氮菌株53 株，通過nifH 基因的擴增與測序，其中有26個菌株擴增出了450 bp 左右的目的片段（GenBank序列登錄號為OL799110-OL799133）。菌株的生理生化特征測定結果表明，有19 株為革蘭氏陰性菌，僅有7 株為革蘭氏陽性菌。大部分菌株H2O2酶反應呈陽性，而只有一株菌株淀粉水解為陽性，且V.P、甲基紅和吲哚反應中呈陽性的菌株也較少，分別為4 株、5 株和4 株，具體結果見表4。

2.4.2 菌株分子鑒定結果 對26 個菌株進行16S rRNA 基因序列分析，并與NCBI 數據庫進行比對，同源性在 99%-100%之間，結合重建的系統發育樹信息（圖5），結果表明，這些菌株隸屬于15 個屬，在屬水平上多樣性豐富，有常見的假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）和腸桿菌屬（Enterobacter）等，分離的假單胞菌屬占代表菌株的23.08%，是根際優勢菌屬。還包括一些不常見報道的固氮類群如微桿菌屬（Microbacterium）、貪噬菌屬（Variovorax）和短波單胞菌屬（Brevundimonas）等。將所測菌株的16S rDNA 序列提交至GenBank，獲得序列登陸號為OL757766-OL757791。

圖5 基于 16S rRNA 基因序列構建的檸條根際固氮菌的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere soil of Caragana spp.based on the 16S rRNA gene sequences

3 討論

實時熒光定量技術是檢測環境樣品中特定基因的有效手段，通常采用絕對定量對環境中的基因豐度進行測定［11-12］。nifH 基因作為衡量土壤氮循環的有效指標，其豐度的變化受到多個環境因子的調控［13］。已有研究表明，nifH 基因豐度與土壤磷和速效鉀等土壤理化性質密切相關［14］。張萌等［4］的研究結果表明，在內蒙古3 種草原類型土壤中nifH 基因的豐度與土壤氨態氮和總氮含量顯著正相關；類似地，Chen 等［15］分析了秸稈覆蓋和施氮處理后固氮菌群落組成與環境因子的關系，結果顯示nifH 基因豐度與SOM、AK、AP 和AN 含量呈正相關。在本研究中，5 個檸條群落根際土壤固氮基因nifH 的拷貝數與AP、SOM 和TN 呈顯著正相關，與前人的結果一致，表明固氮菌豐度和分布受到不同生境中非生物和生物因素共同影響，其通過強大的適應能力來順應環境的變化并發揮固氮功能。

基于nifH 擴增子測序對寧夏荒漠區5 個檸條群落根際土壤中固氮細菌的群落結構與多樣性進行分析，結果表明：屬水平上的斯科曼氏球菌屬和未分類的Proteobacteria 是5 個樣地的優勢菌群，這與唐凱等［16］對渾善達克沙地下層土壤固氮細菌群落優勢菌屬的研究結果類似，同樣鄭超等［17］的研究結果表明戈壁荒漠土壤固氮菌優勢類群也與本文一致。也有研究通過nifH 高通量測序發現斯科曼氏菌屬是黃瓜間作所有樣品中的優勢菌屬［18］。類似地，Zou等［19］的研究結果表明隨著黑土中連續種植玉米的年數增加，斯科曼氏菌屬的相對豐度增加，但土壤氮素并沒有累積，因為該屬含有nifH 基因但不能固定N2［20］，有關斯科曼氏菌屬的生態功能有待進一步驗證。此外，還檢測到中慢生根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、念珠藻屬和弗蘭克氏菌屬等共生固氮菌類群，以及固氮菌屬和類芽孢桿菌屬等聯合固氮菌，這些固氮菌多樣性豐富具有多種促生及抗逆的生態功能，能與荒漠植物在逆境脅迫下相互選擇、共同進化，形成了獨特的抗逆抗旱系統，有效保障了物種生態系統功能的正常發揮［21］。已有的研究表明，pH、總氮、總碳、總鉀和速效氮都會顯著影響固氮微生物群落的多樣性與結構［5，22］。本研究中，土壤總氮、速效氮、總磷和有機質顯著影響固氮微生物群落，與劉璐等［23］的研究結果一致。蔡樹美等［24］對灘涂土壤固氮菌群落的研究同樣表明影響較大的主要環境因子為有機質和速效磷等，說明土壤理化性質是影響固氮微生物群落的重要因素之一。

從寧夏5 個不同荒漠區檸條群落根際土壤中分離出15 個固氮菌屬，在屬水平上多樣性豐富，包括共生固氮菌如根瘤菌屬和中華根瘤菌屬，聯合固氮菌如假單胞菌屬和腸桿菌屬。其中假單胞菌屬為優勢菌屬，占代表菌株的23.08%，與楊鴻儒［25］和雷海英［26］的研究結果一致。基于假單胞菌繁殖快、定殖能力強、營養要求簡單，且能夠抑制多種植物病害和促進植物生長的特點，因而在環境中分布范圍廣且對環境的適應性強［27］。5 個荒漠土壤生境還分離出一些不常見的固氮類群如不動桿菌屬（Acinetobacter）、勒克氏菌屬（Leclercia）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、微桿菌屬、貪噬菌屬和短波單胞菌屬。已有研究發現，這些菌屬都具有固氮和溶磷能力，有些還具有多種PGP（plant growth promoting）功能和拮抗病原菌活性［28-32］。此外還分離出布丘氏菌屬和Pseudescherichia，目前還未見有這兩個類群固氮功能的報道，但兩者都能在篩選培養基上轉接正常生長，也能擴增出nifH 基因并得到測序驗證。由于環境、植物以及根系分泌物的不同會招募不同的固氮類群，而本研究樣地也分離出了一些特異的固氮類群，充分反映了寧夏荒漠區檸條根際可培養固氮菌的多樣性。

高通量測序結果分析表明5 個樣地中并沒有檢測到可培養固氮菌如假單胞菌屬、勒克氏菌屬和根瘤菌屬等，可能是由于引物對nifH-F/nifH-R 有一定的偏好性，無法全面覆蓋nifH 基因的多樣性［33］；此外基于特征性分子標靶基因片段擴增子得到的OTU 不足以代表含有該特征片段的所有微生物，特別是稀有物種，其標靶基因序列可能與已知菌株具有較大差異而無法被現有方法檢測［34］。而高通量測序中的一些優勢菌屬如斯科曼氏菌屬沒有被分離出來，可能由于培養基等培養條件的限制，缺少一些固氮菌需要的營養物質，如鈷胺素、生物素等［35-37］，而導致其無法生存。但本研究將高通量測序和純培養的方法相結合，更全面地分析了檸條根際土壤固氮菌的結構組成和多樣性特征，為深入了解荒漠生境中固氮微生物群落構成及固氮菌資源的開發利用奠定基礎。

4 結論

寧夏荒漠檸條林地土壤固氮菌群落結構存在差異，其中LS 固氮菌含量高但多樣性最低，而SPT固氮菌含量最低但多樣性高。紅螺菌科、產堿菌科、葉桿菌科等為主要固氮類群。土壤總氮、速效氮和有機質等顯著影響固氮微生物的群落組成。檸條根際土壤中可培養固氮菌多樣性十分豐富，對于荒漠生態系統的保護和恢復具有重要意義。