miR-301b對山羊肌內脂肪細胞分化的調控作用

張浩 何長晟 李艷艷 王永 朱江江 俄木曲者 林亞秋

（1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部/四川省重點實驗室，成都 610041；2.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041；3.四川省畜牧科學研究院 動物遺傳育種重點實驗室，成都 610066）

脂肪組織是體內重要的能量存儲場所，但過多的脂肪會破壞人體的能量平衡，增加患II型糖尿病、高血脂、脂肪肝以及其他代謝疾病的風險。畜禽養殖過程中脂質代謝的調節可增加胴體的瘦肉率并改善肉的嫩度和風味。山羊作為家養動物是肉類的主要來源之一，與牛肉、豬肉相比，羊肉具有獨特的風味，受到消費者的廣泛推崇。羊肉的脂肪含量不僅影響羊肉的肉質，還直接關系到經濟價值，因此闡明脂肪沉積的分子機制是進行分子育種的關鍵環節之一。研究表明，動物脂肪細胞分化不僅受功能基因的調控，還受非編碼基因如miRNAs的調控［1-3］。microRNAs（miRNAs）于1993年首次在秀麗新小桿線蟲中被發現［4］，是物種間保守的內源性表達的非編碼小分子RNA，長度一般在22 nt左右。miRNA通常與靶標基因的3′ UTR互補區結合，抑制靶基因的表達，在動物的生長發育、細胞增殖、細胞分化及細胞凋亡等過程中發揮重要調控作用［5-6］。

基于miRNA在轉錄調控中的重要作用，在動物脂肪沉積中的功能也被廣泛關注。研究人員通過微陣列芯片在肉牛的肌內脂肪和皮下脂肪中發現了88個差異表達的 miRNA［7］。miR-130a靶向 PPARγ抑制脂質沉積［8］，miR-130b通過抑制CYP2U1的表達抑制脂滴形成，miR-1271通過抑制ATF3的表達，提高PPARγ和C/EBPα的表達水平來促進脂質沉積［9］。另有研究對牛脂肪細胞分化前后的miRNA的表達進行分析，發現260個差異表達的miRNA，并且其靶基因與脂質代謝密切相關［10］。在產蛋后期母雞和幼年母雞的肌內脂肪細胞中也通過RNA-seq鑒定了104個差異表達miRNA［11］。對雞腹脂衍生脂肪細胞測序也發現了33種差異表達的miRNA［12］，在組織水平上通過對6、14、22、30 周齡的雞腹脂測序，篩選到507種已知miRNA和53種新的miRNA，并發現miR-215-5p通過NCOA3抑制雞腹脂形成［13］。在家兔的研究中發現，miR-130b可以抑制兔前體脂肪細胞的分化［14］。miR-301b是本實驗室前期利用高通量測序篩選得到的調控山羊肌內脂肪細胞分化前后的差異miRNA，目前對其研究多集中于炎癥反應［15］、癌癥［16］、糖尿病心臟病［17］、細胞增殖［18］以及間充質干細胞的異常成脂分化［19］，尚未見其在山羊脂肪細胞分化方面的報道。

根據本實驗室前期對山羊肌內脂肪細胞油酸誘導分化前后測序結果，在分化0 d和2 d中差異表達的miRNA，篩選出表達水平差異上調的miR-301b作為研究對象。為了闡明miR-301b對山羊肌內脂肪細胞分化的調控作用，本實驗以山羊肌內脂肪細胞為研究對象，通過過表達和干擾miR-301b明確其對脂肪細胞分化的影響，通過qPCR技術結合生物信息學分析來探究其發揮作用的可能調控機制，為山羊脂肪細胞分化的調控網絡構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗以7 日齡簡州大耳羊為試驗對象，購買自四川省簡陽大哥大牧業有限公司。取羔羊背最長肌分離原代前體脂肪細胞后液氮凍存。

Trizol 和 TB Green? Premix Ex TaqTMII購自 Ta-KaRa 公司，RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit、TurboFect Transfection Reagent和 Bodipy 購自 Thermo公司，油酸購自 Sigma 公司，DMEM/F12、胰酶、Opti-MEM、胎牛血清（FBS）和雙抗購自Gibco，油紅O 購自Solarbio 公司，甘油三酯（TG）測定試劑盒購自普利萊，引物由生工生物有限公司（成都）合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取實驗室前期凍存的山羊原代肌內脂肪細胞，37℃水浴迅速融化后轉移至10 mL離心管中，加入7 mL含10% FBS的DMEM-F12完全培養基，1 000 r/min離心3 min棄去上清液，加入3 mL完全培養基重懸，并轉移至10 cm培養皿中，補齊10 mL完全培養基，24 h貼壁后換液，后續每48 h換液。細胞生長至融合度約80%-90%傳代，傳代使用胰酶消化細胞。

1.2.2 細胞轉染 根據miR-301b序列，由GenePharma公司合成miR-301b的mimics和inhibitor（表1），并按照TurboFect Transfection Reagent試劑說明書將mimics和inhibitor轉染至約80%密度的F3代山羊原代肌內脂肪細胞中，轉染12 h后更換為50 μmol/L 油酸誘導液，誘導分化48 h 后收集細胞樣品。每個處理設置3個重復。

表1 miRNA mimic和 inhibitor序列Table 1 Sequences of miRNA mimic and inhibitor

1.2.3 甘油三酯測定 利用甘油三酯（TG）試劑盒測定甘油三酯合成情況，實驗操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 Bodipy和油紅O染色 接種于24孔板的細胞轉染后經誘導分化48 h后棄培養基，用PBS清洗3遍，并利用4%多聚甲醛固定30 min，棄去甲醛，PBS清洗3遍，油紅O染色30 min，PBS清洗3遍，每孔保留約200 μL PBS，顯微鏡下觀察脂滴分布并拍照。Bodipy避光染色后熒光顯微鏡下觀察脂滴分布并拍照，染色步驟同油紅O染色。

1.2.5 qPCR及數據分析 12孔板按照TRIzol的說明裂解細胞樣品提取RNA，利用RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit將RNA樣品反轉錄cDNA，5倍稀釋后-20℃儲存，分別以U6和UXT為內參基因，qPCR檢測miR-301b和基因相對表達量，qPCR總 體 系 20 μL，TB Green?Premix Ex TaqTMII 10 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，引物信息如表2，用2-ΔΔCt法處理數據。

表2 特異性引物序列信息Table 2 Sequences information of specific primers

2 結果

2.1 過表達miR-301b對山羊肌內脂肪細胞分化的影響

利用qPCR 技術檢測山羊肌內脂肪細胞轉染miR-301b-mimics 的效率，結果（圖1-A）顯示，相比對照組，miR-301b-mimics組中miR-301b的相對表達水平升高29 290倍（P＜0.01）。

2.1.1 細胞形態學觀察及甘油三酯含量測定 通過油紅O和Bodipy染色法觀察細胞形態學變化，發現過表達miR-301b后山羊肌內脂肪細胞內脂滴積累減少（圖1-B）。油紅O染色量化結果（圖1-C）顯示，miR-301b-mimics 組OD490值顯著低于NC組（P＜0.01），此外TG測定結果（圖1-D）顯示miR-301b-mimics 組的甘油三酯含量極顯著低于NC 組（P＜0.01）。

圖1 過表達miR-301b對山羊肌內脂肪細胞形態學影響Fig.1 Effect of overexpressing miR-301b on the morphology of goat intramuscular adipocytes

2.1.2 qPCR檢測脂肪細胞分化標志基因mRNA表達水平 結果（圖2）顯示，過表達miR-301b后，與 NC 組比較 CEBPα、PPARγ、SREBP1、LPL極顯著降低（P＜0.01），與細胞形態學觀察得到的結果相一致，然而CEBPβ極顯著上調（P＜0.01），相對表達量上升了4倍，AP2的相對表達水平未發生顯著性變化（P＞0.05）。

圖2 miR-301b 山羊對肌內脂肪細胞分化標志基因表達的影響Fig.2 Effects of miR-301b goat on the expressions of differentiation marker genes of intramuscular adipocytes

2.2 干擾miR-301b表達對山羊肌內脂肪細胞分化的影響

成功在山羊肌內脂肪細胞中干擾miR-301b的表達，并且干擾效率達到60%，極顯著低于對照組（圖3-A）（P＜0.01）。

2.2.1 細胞形態學觀察及甘油三酯含量測定 油紅O 和Bodipy染色結果（圖3-B）均表明，干擾miR-301b表達促進脂質在細胞內積聚。油紅O染色結果量化數據顯示，與NC 組對比，in-miR-301b組（干擾miR-301b組）的OD490值顯著上調（P＜0.01）（圖3-C），甘油三酯含量也增長了1.31倍（圖3-D）（P＜0.01）。

圖3 干擾miR-301b 對山羊肌內脂肪細胞形態學影響Fig.3 Effect of interfering miR-301b on the morphology of goat intramuscular adipocytes

2.2.2 qPCR檢測脂肪細胞分化標志基因mRNA表達水平 為進一步解釋山羊肌內脂肪細胞中干擾miR-301b表達對分化影響的機制，檢測脂肪細胞分化相關基因mRNA的表達水平。結果（圖4）顯示，干擾 miR-301b 表達后 AP2、CEBPα、CEBPβ、SREBP1和LPL的表達水平極顯著上調（P＜0.01），PPARγ顯著上調（P＜0.05）。

圖4 干擾miR-301b 山羊對肌內脂肪細胞分化標志基因表達的影響Fig.4 Effect of interferring mir-301b goat on the expression of differentiation marker genes of intramuscular adipocytes

2.3 miR-301b靶基因預測及初步研究

利用Targetscan和miRDB并結合實驗室前期轉錄組測序結果對miR-301b下游靶基因進行預測，使用Venny 2.1繪制韋恩圖（圖5-A），3種方法取交集得到392個潛在靶基因，其中包括CLIP1、GJA1、ACVR1、RPS6KA5、MDM4、PPARγ、KLF3和C/EBPα等。結合實驗室前期研究結果，發現KLF家族對山羊脂肪細胞分化有重要的調控作用，KLF3可促進山羊脂肪細胞分化［20］，通過TargetScan預測KLF3 3′UTR的miRNA結合位點，得到2個miR-301b的潛在結合位點（圖5-B）。因此，本實驗選定KLF3作為miR-301b的潛在靶基因，分別在過表達miR-301b和干擾miR-301b表達的樣品中檢測KLF3的表達，發現過表達miR-301b后顯著抑制KLF3的mRNA表達水平（圖5-C），而干擾miR-301b后，KLF3的mRNA水平得到了顯著提升（圖5-D）。

圖5 miR-301b靶基因預測及表達水平檢測Fig.5 Prediction and expression level detection of miR-301b target gene

3 討論

脂肪細胞的分化是脂肪組織脂質積累的重要過程，在機體的能量穩態中發揮重要功能，同時在畜牧方面，脂肪含量對于胴體性狀和肉質及其經濟價值有著極大的影響。脂肪細胞分化過程是極復雜的生理進程，受多種轉錄因子和非編碼RNA的嚴格調控［21-23］，動物體內的miRNAs可以通過與不完全互補的靶mRNA結合來切割或抑制翻譯，從而發揮重要的調節作用［24］。pre-miRNA通過裂解、轉運和切割等方式修飾以產生成熟的miRNA［25］，后者通過補充靶基因的3′UTR堿基來引導RNA誘導沉默復合物（RISC）切割靶mRNA結構域，從而降低靶mRNA的表達或抑制其翻譯［26］。

本研究通過利用化學合成的mimics和inhibitor在體外培養的山羊肌內脂肪細胞中分別過表達和干擾miR-301b，探究miR-301b的調控作用。本研究發現，過表達miR-301b后，山羊肌內脂肪細胞的脂滴顯著減少，成脂相關基因CEBPα、PPARγ、SREBP1、LPL的表達水平極顯著降低，CEBPβ極顯著升高。干擾miR-301b的表達后，山羊肌內脂肪細胞的脂滴顯著增加成脂相關基因AP2、CEBPα、CEBPβ、SREBP1和LPL的表達水平極顯著上升，PPARγ表達水平顯著上升。PPARγ和CEBPα作為經典的成脂分化標志基因，在成脂分化過程中起著關鍵作用［27-29］。CEBPβ可以激活 CEBPα和 PPARγ并產生級聯反應，快速激活成脂相關基因的表達［30］。結合本研究中，過表達和干擾miR-301b后，PPARγ與CEBPα的表達水平都發生了顯著變化，因此推測miR301b可能是通過調控PPARγ與CEBPα的表達，從而抑制肌內脂肪細胞分化。而CEBPβ在過表達和干擾miR-301b的實驗中，出現了一致的上升趨勢，可能是由于CEBPβ在成脂分化過程中對PPARγ和CEBPα的調控作用，過表達miR-301b時，PPARγ和CEBPα的表達極顯著下調，使得二者的調控因子CEBPβ期望對下調的趨勢予以挽救，表達量極顯著上升，因此在過表達miR-301b的標志基因中，CEBPβ呈現了與PPARγ和CEBPα相反的表達趨勢。研究發現與miR-301b同家族的miR-301b-3p可以通過靶向CPEB3/EGFR軸，加速高級別卵巢漿液性腫瘤的遷移和侵襲［31］。在家兔前體脂肪細胞中的研究發現，過表達和干擾miR-130b抑制/促進分化和細胞內甘油三酯的積累，分別顯著下調和上調PPARγ和CEBPα的表達［14］，發現miR-130b通過抑制其靶基因PPARγ來減少豬脂肪沉積［32］，而miR-301b與miR-130b屬同一家族，具有相同的種子序列，其表達模式和生物學功能可能存在類似的地方。

miRNA作為生物發生過程中基因調控的關鍵調控因子，主要通過與靶基因的相互作用來調控脂肪細胞的分化，例如，miR-27b靶向LPL并抑制人脂肪干細胞（human adipose tissue-derived stem cell，hASC）分化［19］。miR-130a靶向 PPARγ抑制牛脂肪細胞的脂滴積聚［8］，在肉牛脂肪細胞中，過表達miR-378表達，通過下調靶基因的表達水平，致使PPARγ和SREBP1的表達水平上升，從而促進脂肪細胞的成脂分化。在固始雞的皮下脂肪細胞中，miR-215-5p靶向NCOA3抑制脂肪細胞的增殖和分化［13］，miR-206靶向KLF4抑制豬脂肪細胞的分化［33］，miR-106b-5p靶向KLF4負向調控山羊脂肪細胞分化［34］。以上研究表明miRNA在不同物種中主要通過靶向基因發揮調控作用，因此本實驗通過Targetscan、miRDB預測并結合實驗室前期轉錄組測序結果對miR-301b下游靶基因進行預測，發現miR-301b靶標基因包括KLF3。此前已有報道miR-324-5p靶向KLF3促進豬的脂肪細胞分化和脂肪沉積［35］。本實驗室致力于探究KLF家族基因在山羊脂質沉積中的作用，且前期研究發現KLF3是山羊皮下脂肪細胞分化的正向調控因子［20］，因此我們選擇KLF3作為研究對象。過表達miR-301b可以極顯著降低KLF3的mRNA表達水平，同時干擾miR-301b可以極顯著提高KLF3的表達水平，推測miR-301b與KLF3之間的表達存在著調控關系。本研究從實驗水平推測KLF3可能為miR-301b的靶標基因，但二者之間具體的結合關系是本實驗下一步研究的重點，擬利用雙熒光素酶報告實驗明確其靶標關系。

4 結論

本研究以實驗室前期通過RNA-Seq篩選得到的山羊肌內脂肪細胞分化差異miR-301b為研究切入點。miR-301b是一個山羊肌內脂肪沉積的負調節因子。推測miR-301b可能通過靶向KLF3抑制山羊肌內脂肪細胞分化。