基于CRSIPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建凝血因子8基因敲除小鼠模型及表型驗(yàn)證

王海杰 王成稷 郭洋 王云 陳艷娟 梁敏 王玨 龔慧 沈如凌

（上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203）

血友病A（hemophilia A，HA）又稱凝血因子Ⅷ（coagulation factor Ⅷ，Ⅷ）缺乏癥，也稱抗血友病因子（antihemophilic factor，AHF）缺乏癥，是一種X染色體連鎖的隱性遺傳出血性疾病，其特點(diǎn)是凝血活酶生成障礙，并導(dǎo)致凝血時(shí)間延長(zhǎng)［1］。HA臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)的自發(fā)性關(guān)節(jié)、肌肉出血，也可以影響內(nèi)臟器官，嚴(yán)重的可因中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血死亡［2］。血友病A在男性群體中發(fā)病率為10-20/10萬(wàn)，女性發(fā)病極為罕見(jiàn)，其中血友病A占血友病患者數(shù)總體的 80%-85%［3］。

F8基因位于X染色體長(zhǎng)臂末端（Xq28），長(zhǎng)度約為209.60 kb，由26 個(gè)外顯子和25 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。F8因子主要在肝臟合成，也在腎臟、內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴組織中表達(dá)，是最大的凝血因子之一。F8基因龐大，從大量的血友病A臨床資料來(lái)看，導(dǎo)致發(fā)病的基因缺陷的形式具有多樣性，其中包括突變、內(nèi)含子倒位、插入、缺失等［4］。

作為凝血因子9的輔助因子，F(xiàn)8基因參與F9包括基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及其后修飾等在內(nèi)的凝血過(guò)程各環(huán)節(jié)［2］。F8基因突變幾乎完全發(fā)生在雄性生殖細(xì)胞中，使凝血因子9的蛋白質(zhì)構(gòu)成、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致凝血激活過(guò)程各環(huán)節(jié)發(fā)生異常，繼而導(dǎo)致凝血活性、抗原活性發(fā)生不同程度改變，從而表現(xiàn)為包括先天性出血障礙在內(nèi)不同嚴(yán)重程度的臨床癥狀。目前臨床HA患者治療中最常用的是替代療法，即通過(guò)給患者輸入血漿來(lái)源或者重組的F8蛋白進(jìn)行控制［5-8］。但由于F8蛋白的半衰期短，藥物價(jià)格昂貴，同時(shí)5%-7%的患者會(huì)產(chǎn)生相關(guān)抑制效應(yīng)，限制了替代療法的有效性。HA單基因突變的特點(diǎn)使基因治療成為重點(diǎn)治療方向，并且已成為遺傳發(fā)病機(jī)理、基因診斷、基因治療的主要研究對(duì)象［9-10］。

目前為止，已有多家實(shí)驗(yàn)室和公司制備了F8基因敲除小鼠，其中以杰克遜實(shí)驗(yàn)室提供的HA小鼠（B6；129S-F8tm1Kaz/J）最為常見(jiàn)，其構(gòu)建策略是利用小鼠胚胎干細(xì)胞基因打靶技術(shù)通過(guò)同源重組破壞F8基因表達(dá)，從而產(chǎn)生血友病A的臨床癥狀；新的基因編輯工具，如CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)后國(guó)內(nèi)多家基因編輯公司構(gòu)建了F8基因敲除品系。由于構(gòu)建中需要用到不同背景的動(dòng)物，使得HA模型在遺傳背景上比較復(fù)雜［11］。本文利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源重組（non-homologous end joining，NHEJ）基因敲除技術(shù)，在C57BL/6背景小鼠上成功構(gòu)建F8基因敲除小鼠模型，將整個(gè)F8基因的編碼區(qū)進(jìn)行了敲除。該方法省去了ES細(xì)胞打靶步驟，比傳統(tǒng)基因打靶方法更為便捷，效率更高，敲除策略更為徹底，該模型的制備成功將為血友病的治療研究提供又一選擇工具［12-13］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 感受態(tài)細(xì)胞、各種限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、PCR相關(guān)試劑和T4 DNA連接酶購(gòu)自 TaKaRa公司；Cas9表達(dá)載體、pX-T7-sgRNA質(zhì)粒由上海南方模式生物科技股份有限公司提供；GeneRluer 1kb DNA Ladder、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit 試劑盒購(gòu)自Thermofisher公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒和瓊脂糖膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit 試劑盒購(gòu)自NEB公司；Trizol試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄和qPCR熒光預(yù)混液由Transgen公司提供 ；Mouse Factor Ⅷ ELISA Kit（Colorimetric）購(gòu)自Novus公司；纖維蛋白原（Fibrinogen，F(xiàn)IB）測(cè)定試劑盒、活化部分凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑盒（APTT試劑盒）購(gòu)自北京美創(chuàng)公司；人凝血因子Ⅷ（human coagulation factor Ⅷ）試劑盒購(gòu)自山東泰邦生物制品有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6背景F8基因敲除小鼠（F8-/-小鼠）及野生型小鼠（WT小鼠）均由上海南方模式生物科技股份有限公司繁育提供［SCXK（滬）2019-0002］。本實(shí)驗(yàn)所涉及小鼠均按照SPF級(jí)動(dòng)物要求，飼養(yǎng)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房［SYXK（滬）2019-0003］。所有實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)上海南方模式生物科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)（IACUC）審批通過(guò)（IACUC號(hào)2017-0003）。

1.2 方法

1.2.1 sgRNAs設(shè)計(jì)和表達(dá)載體構(gòu)建 小鼠F8基因定位于小鼠X染色體的 X A7.3區(qū)段（Chromosome X：74 216 321-74 425 922，ENSMUST00000033539.12），全長(zhǎng)約209.60 kb，轉(zhuǎn)錄本F8-201，有26 個(gè)外顯子，表達(dá)蛋白全長(zhǎng)2 319 aa。根據(jù)小鼠F8基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)，通過(guò)在線sgRNA設(shè)計(jì)軟件（http://crispr.mit.edu /），選擇敲除區(qū)域?yàn)橥怙@子1（exon1）編碼區(qū)到外顯子26（exon26），在exon1非編碼區(qū)和exon26下游序列中分別選擇sgRNA靶位點(diǎn)，sgRNA靶序列信息見(jiàn)表1。根據(jù)sgRNA靶位點(diǎn)，寡聚核苷酸序列，合成相應(yīng)的oligoDNA用于構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體，序列信息見(jiàn)表2。

表1 sgRNA序列信息Table 1 sgRNA sequence information

表2 寡核苷酸鏈序列信息Table 2 Oligonucleotide chain sequence information

將每對(duì)寡核苷酸單鏈以程序降溫的方式退火成雙鏈。pX-T7-sgRNA質(zhì)粒經(jīng)BbsI 酶切后使其線性化，回收后分別與2對(duì)寡核苷酸雙鏈進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；挑選帶有抗性的單克隆大腸桿菌感受態(tài)菌落提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行測(cè)序鑒定，保存正確的陽(yáng)性克隆。

1.2.2 sgRNA和Cas9表達(dá)載體的體外轉(zhuǎn)錄 sgRNA的表達(dá)載體pX-T7-sgRNA 經(jīng)酶切線性化后，按照HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；Cas9表達(dá)載體經(jīng)XbaI酶切線性化后，按照mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Transcription Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 陽(yáng)性小鼠品系獲得及鑒定 將Cas9 mRNA和sgRNA混合物通過(guò)顯微注射到C57BL/6野生型小鼠（WT小鼠）的受精卵中，并將注射后受精卵移植到假孕雌鼠子宮中，獲得F0代小鼠，PCR方法鑒定F0代小鼠的基因型。F8基因敲除F1代雜合子小鼠（F8-/+）由F0代陽(yáng)性小鼠與C57BL/6小鼠交配獲得，鑒定引物對(duì)P1/P2序列信息見(jiàn)表3，PCR條件為 ：94℃/3 min ；35 個(gè)循環(huán)的 98℃/15 s，60℃/15 s，68℃/1 min；68℃/5 min。F2代F8基因敲除純合子小鼠F8-/-由F1代雜合子小鼠自交獲得，基因型鑒定策略同F(xiàn)1代小鼠。

表3 引物序列信息Table 3 Primer sequence information

1.2.4 F8-/-小鼠表型檢測(cè)

1.2.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 隨機(jī)選擇5 只8周齡F8-/-雄鼠及其同窩野生型（WT）雄鼠，異氟烷麻醉后心臟采血，用3.8%檸檬酸鈉作為抗凝劑，按9 份血和1 份抗凝劑的比例立即充分混勻，離心取血漿用于后續(xù)APTT、FIB及ELISA實(shí)驗(yàn)，然后分別取心、肝、脾、肺和腎用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè) 按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)，分離組織心、肝、脾、肺、腎并抽提總RNA，按照2 μg總量進(jìn)行定量，隨后使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，以β-Actin作為內(nèi)參，采用RT-PCR對(duì)F8基因在F8-/-小鼠及WT小鼠中各組織的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)條件為：95℃/5 min；32個(gè)循環(huán)的 95℃/30 s，60℃/35 s，72℃/30 s；72℃/5 min。引物信息見(jiàn)表4

表4 逆轉(zhuǎn)錄PCR引物序列Table 4 Reverse transcription PCR primer sequences

1.2.4.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 按照 Mouse Factor Ⅷ ELISAKit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，檢測(cè)小鼠血漿中F8的含量。簡(jiǎn)述如下：ELISA檢測(cè)板室溫平衡；用樣品稀釋液梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣品；隨后每個(gè)孔依次加入等體積標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣品，37℃孵育90 min；不清洗，每個(gè)孔立即加入生物素標(biāo)記抗體檢測(cè)工作液，37℃孵育60 min；洗滌液清洗后每個(gè)孔加入辣根過(guò)氧化物酶（horseadish peroxidase，HRP）偶聯(lián)工作液，37℃孵育30 min；洗滌液清洗后每個(gè)孔加入底物測(cè)試液后至加樣孔變?yōu)樗{(lán)色，加入終止液終止，30 min內(nèi)于450 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值，記錄數(shù)據(jù)并分析。

1.2.4.4 小鼠凝血功能檢測(cè) 對(duì)F8-/-小鼠與WT小鼠進(jìn)行眼內(nèi)靜脈竇采血取血漿，24 h后按照人凝血因子Ⅷ說(shuō)明書(shū)所需因子Ⅷ（IU）=0.5×小鼠體重（kg）×60%（所需提升的因子Ⅷ活性水平的百分比，按正常值的%計(jì)）計(jì)算給藥劑量，對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈注射，30 min后采血取血漿，按照1.2.4.5-1.2.4.7方法進(jìn)行后續(xù)凝血功能檢測(cè)。

1.2.4.5 活化部分凝血活酶時(shí)間檢測(cè)（activated partial thromboplastin time，APTT） 按照活化部分凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血漿中的APTT。簡(jiǎn)述如下：APTT試劑和0.025 mol/L氯化鈣，分別預(yù)溫37℃并充分混勻；在37℃預(yù)熱待測(cè)血漿2 min，加入等體積APTT試劑到血漿中，開(kāi)始計(jì)時(shí)；37℃預(yù)熱5 min；加入等體積0.025 mol/L氯化鈣，記錄凝固形成時(shí)間（s）并分析。

1.2.4.6 纖維蛋白原含量檢測(cè)（fibrinogen，F(xiàn)IB） 按照纖維蛋白原測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血漿中的FIB含量。簡(jiǎn)述如下：梯度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后預(yù)溫2 min，加入室溫下的凝血酶試劑到37℃預(yù)溫的樣本中并記錄測(cè)定的凝固時(shí)間，繪制雙對(duì)數(shù)定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線；用咪唑鹽緩沖液（imidazole buffer solution，IBS）按1/10 倍稀釋小鼠血漿，加入凝血酶試劑記錄凝固時(shí)間，從上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到相應(yīng)纖維蛋白原的含量。

1.2.4.7 滴血實(shí)驗(yàn) 將小鼠尾巴固定，剪下尾巴末端處2 mm，血液滴于濾紙上，記錄60 s內(nèi)形成的血斑大小，采用Image J軟件分析血斑灰度值。

1.2.4.8 統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)均以Mean ± SEM表示。數(shù)據(jù)分析和繪圖使用Graphpad8.0軟件，數(shù)據(jù)組間比較采用t值檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 F8 -/-小鼠的制備

圖1所示為F8-/-小鼠構(gòu)建策略。將體外轉(zhuǎn)錄的方式獲得Cas9 mRNA和sgRNA通過(guò)顯微注射到C57BL/6小鼠的受精卵中，共注射了150 枚受精卵。將注射后的受精卵移植到5只假孕母鼠中，出生20只小鼠（出生率為13.3%），即為F0代小鼠。F0代小鼠基因型鑒定策略圖如圖2-a所示。經(jīng)PCR鑒定及PCR產(chǎn)物測(cè)序確認(rèn)，共獲得16只F0代陽(yáng)性小鼠（陽(yáng)性率為80%），其中雄鼠6只，雌鼠10只。F0代陽(yáng)性小鼠與野生型C57BL/6小鼠交配獲得F1代敲除雜合子小鼠；F1代敲除雜合子小鼠自交獲得F2代敲除小鼠，經(jīng)PCR鑒定加產(chǎn)物測(cè)序確定獲得純合子小鼠（F8-/-小鼠）。經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，獲得的F8基因敲除小鼠缺失207 293個(gè)堿基對(duì)。敲除后的具體序列信息如表5所示。基因型鑒定代表圖如圖2-b和2-c所示。

表5 WT小鼠和F8-/-敲除小鼠的序列信息Table 5 Sequence information of wild type and F8-/-mice genotype

圖1 F8 -/-小鼠基因敲除策略Fig.1 Knockout strategy of F8 -/- mice

圖2 F8-/-基因敲除小鼠基因型鑒定結(jié)果Fig.2 Genotype results of F8-/- gene knockout mice

2.2 F8 -/-小鼠mRNA水平驗(yàn)證

RT-PCR實(shí)驗(yàn)在RNA水平上檢測(cè)F8-/-小鼠各個(gè)主要組織中F8基因的敲除效果。RT-PCR結(jié)果如圖3所示：WT小鼠F8在心、肝、脾、肺、腎中均有不同水平表達(dá)（圖3-a）；F8-/-小鼠的心、肝、脾、肺和腎組織中均未能檢測(cè)到F8 mRNA 的信號(hào)，F(xiàn)8基因在F8-/-小鼠中表達(dá)水平顯著低于WT小鼠（****P＜0.000 1）（圖3-b）；對(duì)肝組織RT-PCR結(jié)果進(jìn)核酸電泳鑒定分析，與WT小鼠相比，F(xiàn)8-/-小鼠在核酸電泳中無(wú)明顯電泳條帶（圖3-c）。

圖3 F8 -/-小鼠F8 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Analysis of relative mRNA expression in F8-/- mice

2.3 F8 -/-小鼠蛋白水平驗(yàn)證

ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠血漿中的F8蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示：5 只WT小鼠血漿中F8蛋白平均表達(dá)量為（3.10±1.62）ng/mL，5 只F8-/-小鼠中有4 只已檢測(cè)不到F8蛋白表達(dá)值，另外1 只F8-/-小鼠F8蛋白表達(dá)值為0.072 2 ng/mL，F(xiàn)8-/-小鼠F8蛋白表達(dá)均值顯著低于WT小鼠（**P＜0.01）。

圖4 F8-/-小鼠F8蛋白相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression of F8 protein in F8-/- mice

2.4 F8 -/-小鼠凝血功能測(cè)定

FIB實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠血漿中纖維蛋白原的濃度。F8-/-小鼠的FIB結(jié)果如圖5-B所示：F8-/-小鼠FIB均值為（126±23）mg/dL，WT小鼠FIB均 值為（220±80）mg/dL，F(xiàn)8-/-小鼠的FIB濃度比WT小鼠顯著降低（*P ＜0.05）。

APTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠血漿的凝固時(shí)間。如圖5-A所示，按照F8恢復(fù)到正常值的60%人凝血因子FⅧ計(jì)算給藥劑量并對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈注射，30 min后眼內(nèi)靜脈竇采血進(jìn)行凝血檢測(cè)。F8-/-小鼠的APTT結(jié)果如圖5-C所示：尾靜脈注射給予人凝血因子Ⅷ治療前，F(xiàn)8-/-小鼠APTT均值為（63.0±8.5）s，WT小鼠APTT均值為（25.3±2.5）s，F(xiàn)8-/-小鼠血漿凝固時(shí)間比WT小鼠顯著延長(zhǎng)（****P＜0.000 1），說(shuō)明F8-/-小鼠的凝血功能存在嚴(yán)重障礙；給予人凝血因子Ⅷ治療后，F(xiàn)8-/-小鼠的APTT值恢復(fù)到WT小鼠水平。

圖5 F8 -/-小鼠的APTTFig.5 APTT results of F8-/- mice

滴血實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠注射凝血因子Ⅷ后的出血情況。血斑圖結(jié)果見(jiàn)圖6，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖7所示：F8-/-小鼠注射生理鹽水灰度均值為26 309±1 333，注射凝血因子Ⅷ后均值為40 713±9 005，F(xiàn)8-/-小鼠注射凝血因子Ⅷ后出血量顯著降低（**P＜0.01）。

圖6 F8-/-小鼠滴血實(shí)驗(yàn)Fig.6 F8 -/- mice blood drop test

圖7 F8 -/-小鼠的血斑灰度值Fig.7 Gray value of blood spot of F8-/- mice

3 討論

1992年Martin Hooper等［12］通過(guò)小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES）基因打靶技術(shù)，成功獲得了血友病A小鼠模型；1997年研究人員采用基因敲除方法將小鼠F9（coagulation factor Ⅸ，F(xiàn)Ⅸ）基因敲除，成功建立了血友病B小鼠模型［13］。血友病小鼠模型的成功構(gòu)建在對(duì)于血友病的研究和藥物研發(fā)發(fā)揮了重要作用。

以往構(gòu)建基因缺陷小鼠模型的方法是在小鼠的受精卵中顯微注射F8大片段敲除的質(zhì)粒，通過(guò)同源重組的方式來(lái)獲得基因敲除小鼠，從而獲得血友病模型［14-16］。但該方法耗時(shí)周期長(zhǎng)，敲除效率不高。本文采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源重組（nonhomologous end joining，NHEJ）基因敲除技術(shù)［17-18］，其效率比傳統(tǒng)同源重組系統(tǒng)高4-6倍以上［19］，能夠高效的將特異性靶位點(diǎn)的DNA雙鏈打斷，通過(guò)NHEJ修復(fù)方式，在斷裂處隨機(jī)引入堿基的缺失或插入，基因產(chǎn)生移碼突變［20］。

我們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將F8基因1-26號(hào)外顯子（exon1-26）區(qū)域進(jìn)行有效敲除，使該編碼區(qū)域207 293 bp的基因序列缺失，造成F8基因蛋白讀碼框移碼，功能缺失，成功構(gòu)建了F8基因全身性敲除小鼠模型，并省略了傳統(tǒng)基因敲除方法中胚胎干細(xì)胞打靶的步驟［15］，同時(shí)該品系后續(xù)繁育保種過(guò)程中具有遺傳穩(wěn)定性的特點(diǎn)，證明我們的設(shè)計(jì)方案是一個(gè)高效快速獲得 F8基因敲除小鼠的方法。

對(duì)小鼠進(jìn)行F8基因表達(dá)水平檢測(cè)，其結(jié)果表明：RT-PCR檢測(cè)證實(shí)F8-/-小鼠心、肝、脾、肺和腎中幾乎檢測(cè)不到F8 mRNA表達(dá)，證明F8基因在mRNA 水平實(shí)現(xiàn)了敲除；ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)，F(xiàn)8-/-小鼠血漿中僅能檢測(cè)到試劑本底水平F8蛋白的表達(dá)，證實(shí)F8基因在蛋白水平實(shí)現(xiàn)敲除；對(duì)小鼠F8基因進(jìn)行表型驗(yàn)證，APTT實(shí)驗(yàn)中F8-/-小鼠血漿凝固時(shí)間顯著高于WT小鼠，給予人凝血因子Ⅷ后，F(xiàn)8-/-小鼠血漿凝固時(shí)間可恢復(fù)到正常水平，斷尾后形成的血斑灰度均值顯著低于給藥前，同時(shí)F8-/-小鼠血漿中FIB的含量顯著低于WT小鼠，F(xiàn)8-/-小鼠出現(xiàn)明顯凝血功能障礙表型。這些數(shù)據(jù)表明我們已成功構(gòu)建F8基因敲除小鼠品系。

綜上所述，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立了F8基因敲除小鼠品系，在mRNA和蛋白水平以及凝血功能表型檢測(cè)方面對(duì)該基因的敲除效果進(jìn)行了驗(yàn)證，為F8基因功能研究提供了新的研究模型，也為血友病A的治療提供了新型藥物測(cè)試疾病動(dòng)物模型。

4 結(jié)論

本研究基于CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立了F8基因敲除小鼠模型，并進(jìn)行了初步的表型研究，為血友病A的研究提供了新的小鼠模型。