一株安全高效的好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri DZ11的生物安全性及脫氮性能研究

趙洋 孫慧明 林浩澎 羅娉婷 朱雅婷 陳瓊華 舒琥

（廣州大學生命科學學院，廣州 510006）

中國是世界上主要的水產養殖大國，在水產養殖業蓬勃發展的同時也帶來了大量的水污染。水產養殖廢水屬污染成分簡單的低濃度有機污水，主要污染物有氨氮、亞硝酸鹽、有機污染物等。根據2020年生態環境部發布的《第二次全國污染源普查公報》表明我國水產養殖業每年排放的養殖廢水中含有氨氮 22 300 t，總氮 99 100 t，總磷 16 100 t［1］。如何安全，高效的處理這些養殖廢水成為目前一大難題。

生物脫氮因其具有安全、經濟、高效等優點被視為目前最有發展前景的技術之一［2］。生物脫氮的反應類型主要有兩種，分別為硝化反應和反硝化反應。傳統的生物脫氮如SHARON 工藝（短程硝化反硝化工藝），ANAMMOX 工藝（厭氧氨氧化工藝）等都將好氧硝化和厭氧反硝化分為相對獨立的兩步，硝化反應速度慢，同時還要嚴格控制溫度、pH以及氮素含量的影響，增加了成本和管理難度。近年來，好氧反硝化菌因其同時具有異養硝化和好氧反硝化能力開始受到廣泛的關注。國內外研究者在海水沉積物，含水層介質，土壤，水庫沉積物，養殖廢水等樣品中都發現和篩選出來多種好氧反硝化菌［3-8］。其中李文甫等［6］在養殖廢水分離出的假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）亞硝態氮去除率為99.10%，氨氮去除率為93.92%，朱曉明等［5］在含水層介質分離出來的假單胞菌屬惡臭假單胞菌（Pseudomonas Putida）硝酸鹽去除率為95.3%，氨氮去除率為98.5%，證明這類菌株具有高效的脫氮作用。

目前的研究大多集中在分離鑒定和初步的脫氮性能方面，卻忽略菌株的安全性。陳軍昌等［9］發現僅注射1.0×106CFU/mL腐敗假單胞菌懸液5 μL便可使稚蟹3 h內死亡。假單胞菌屬中常見的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種重要的革蘭氏陰性條件致病菌，可引發人體呼吸道、泌尿道、皮膚軟組織及手術創面等多部位的急性或慢性感染［10］。菌株的生物安全性評估是把一個微生物菌株引入到另外一個環境中的非常重要環節［11］。病原微生物的引入不僅有可能破壞自然環境中原有菌群的平衡而且對人類的健康生存存在重大的安全隱患，所以對實驗菌株進行生物毒性和生物安全性探究至關重要。

本實驗對從養殖廢水和底泥中篩選出來的好氧反硝化菌進行研究，對該菌開展形態學觀察、生理生化特性和16S rDNA基因序列分析，通過藥敏性實驗和生物安全性分析，探究不同反應條件對其脫氮性能的影響，以期獲得更有利于實際應用養殖尾水處理的安全高效菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 中山市民眾鎮水產養殖場底泥及污水中篩選出來的菌株。用甘油冷凍法保存在實驗室，使用前富集培養。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基（g/L）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，KNO31 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，pH 7.2-7.4；DM發酵培養基（g/L）KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，檸檬酸鈉5.66 g，微量元素溶液 2 mL，NH4Cl 0.026 75 g（或NaNO30.04 g或 NaNO20.345 g），pH 7.2。微量元素溶液（g/L）：EDTA 50.0 g，ZnSO4·7H2O 2.2 g，CaCl25.5 g，MnCl2·4H2O 5.06 g，FeSO45.0 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.60 g。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 將菌株DZ11于牛肉膏蛋白胨培養基28℃培養24 h，觀察菌落形態。通過掃描電鏡觀察分離菌株的個體形態。生理生化特性依據《伯杰細菌鑒定手冊》 進行鑒定。

1.2.2 16 S rDNA測序及系統發育樹構建 使用上海生工有限公司購買的DNA提取試劑盒提取DZ11的DNA并以其為模板，采用細菌通用性正向引物（27F）和反向引物（1492R）進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果。擴增產物送上海生工有限公司進行測序。獲得的序列在NCBI的 GenBank 數據庫進行Blast同源性對比，并使用 MEGA 7.0 軟件采用 N-J法構建系統發育樹。

1.2.3 菌株的藥敏試驗 取在營養肉湯中培養了18 h的菌液200 mL，均勻涂布在營養瓊脂表面。平板放置15-20 min后，用無菌鑷子取藥敏紙片，貼于平板表面，并輕壓紙片，設置2個平行，置于28℃培養18 h。使用游標卡尺測量抑菌圈大小，并做好記錄。結果判斷參照SN/T 1944-2016 《動物及其制品中細菌耐藥性的測定—紙片擴散法》［12-13］。

1.2.4 生物安全性檢測 選取健康并且活力好的斑馬魚（體長4±1 cm）在水中馴養7 d，待穩定后將斑馬魚隨機分配到裝有15 L淡水的玻璃缸中，每個缸10尾斑馬魚，每組3個重復。實驗組加入菌株DZ11 并控制菌量在1×106CFU/mL。對照組僅加入淡水。將菌株DZ11在營養肉湯中培養至對數期，在超凈工作臺內取出3 000 r/min離心5 min，用生理鹽水洗滌2次，去除培養基成分，用無菌淡水懸浮，通過測定的OD600根據標準曲線得到懸濁液的濃度，通過調節加入水中的懸濁液的量控制養殖水體中假單胞菌的濃度，使水體中菌量約為1×106CFU/mL。試驗期間，斑馬魚正常飼養并且每3 d對缸內水體進行更換，換水后按上述方法重新加入菌株，持續12 d并記錄斑馬魚存活數量［11］。

1.2.5 環境因素對DZ11菌株生長和脫氮性能的影響 分別研究不同C/N，pH，溫度及碳源條件下DZ11菌株對氨氮，亞硝態氮和硝態氮的轉化情況。C/N比分別為10、20、30、40（控制氮濃度不變，氨氮濃度為26.75 mg/L、亞硝態氮濃度為34.5 mg/L、硝態氮濃度為 40 mg/L）；pH 分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；溫度分別為15.0℃、20.0℃、25.0℃、30.0℃；碳源的種類分別為檸檬酸鈉，草酸鈉，丁二酸鈉和乙酸鈉，反應過程中控制單一變量，其他反應條件均不變，分別為C/N=10、pH=7、溫度30℃、碳源為檸檬酸鈉，轉速為200 r/min。將已經培養了18-24 h的菌液按1%的接種量接種到裝有100 mL已經高溫滅菌過的300 mL的錐形瓶中，培養48 h，每隔8 h取一次樣，檢測OD600后，以3 000 r/min，5 min離心處理，取上清液檢測氨氮，硝態氮和亞硝態氮的含量。

1.2.6 氮素檢測方法及轉化率計算 硝態氮采用紫外分光光度法（GBHJ/T346-200）檢測，亞硝態氮采用N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法（GB 7493-87）測定，氨氮使用N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法（GB 7493-87）檢測。去除率的計算公式如下：

C0表示 0 h 相應氮源濃度（mg/L），C1表示發酵培養后某時間相應氮源濃度（mg/L）。采用 Excel 對實驗結果進行統計分析與繪圖。

2 結果

2.1 菌株的形態及生理生化

DZ11在營養瓊脂上形成偏米黃色菌落，透明，形狀不規則，表面光滑濕潤（圖1）。如圖2所示，菌株DZ11是長約1.4 μm，寬約0.4 μm左右的桿菌，革蘭氏陰性菌，生理生化結果見表1。根據《常見細菌系統鑒定手冊》，菌株DZ11的形態特征和生理生化結果和假單胞菌屬較符合。

表1 菌株DZ11生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical identification of strain DZ11

圖1 DZ11菌落形態圖Fig.1 Colony morphology of DZ11

圖2 菌株DZ11掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrograph of strain DZ11

2.2 16S rDNA測序及系統發育樹構建

提取DZ11的基因組DNA并對其核糖體的16S rDNA保守型序列進行PCR擴增，凝膠成像系統觀察，產物切膠回收，測序。獲得的序列提交至GenBank獲得的登錄號為 MW578872.1，結果與GenBank數據庫中近緣種進行同源性分析，經過Blast對比構建繪制系統發育樹，結果如圖3所示。菌株DZ11與假單胞菌屬施氏假單胞菌比對有超過98%的同源性，再結合生理生化結果和形態學可判斷菌株DZ11是施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）并將該菌命名為Pseudomonas stutzeri DZ11。

2.3 菌株的藥敏試驗

菌株的藥敏試驗如表2所示，菌株DZ11對諾氟沙星、氯霉素、硫酸慶大霉素等常見藥品都表現為敏感，因此可判斷菌株DZ11無明顯的耐藥性。

表2 菌株DZ11對不同藥品的耐藥性結果表Table 2 Resistance results of strain DZ11 to different drugs

2.4 生物安全性檢測

在菌株DZ11的生物安全性實驗中，正常飼養條件下，第12天時，菌株DZ11實驗組斑馬魚存活率為100%，空白對照組存活率為100%（圖4）。本實驗菌株的加入量約為1×106CFU/mL，高于病原微生物的致病劑量（1×104CFU/mL），因此可以初步判斷菌株DZ11具有較高的生物安全性。

圖4 菌株DZ11浸泡處理后斑馬魚存活率Fig.4 Survival rate of zebrafish soaked with strain DZ11

2.5 環境因素對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響

2.5.1 C/N對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響C/N對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響如圖5所示，隨著C/N的增加菌株的生長情況開始逐步下降，當硝態氮為唯一氮源時，這種下降趨勢最為明顯，且硝態氮的轉化率也隨之降低，但C/N的改變對氨氮和亞硝態氮的轉化率影響較小，氨氮的轉化率穩定在80%左右，亞硝態氮的轉化率穩定在85%以上。當C/N為10時，菌株的生長情況和脫氮性能最好。48 h后，菌株在C/N為10的培養基中對氨氮，硝態氮和亞硝態氮的轉化率分別為82.05%，79.07%和94.30%。

圖5 C/N比對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響Fig.5 Effects of C/N ratio on the growth and denitrification performance of strain DZ11

2.5.2 pH對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響 pH對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響如圖6所示，pH對菌株DZ11的生長量影響顯著，酸性或堿性條件都有明顯的抑制作用。當pH為7時，菌株DZ11在以氨氮，硝態氮和亞硝態氮為唯一氮源的培養基中的OD600分別為0.254 8，0.201 4，0.162 5，菌株生長最好。對氨氮、硝態氮和亞硝態氮的轉化率趨勢和生長趨勢大致相同。在pH為5時菌株的脫氮性能處于較低的水平，隨著pH的升高，脫氮效率逐漸上升，當pH到7時降解效率達到最高，氨氮，硝態氮和亞硝態氮的轉化率分別84.00%，79.93%和95.23%。隨著pH的繼續升高，生長情況和轉化率開始降低，所以菌株DZ11在pH為7時的生長和脫氮性能最優。

圖6 pH對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響Fig.6 Effects of pH on the growth and denitrification performance of strain DZ11

2.5.3 溫度對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響 溫度對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響如圖7所示，當溫度為15℃，菌株幾乎不生長，并且脫氮性能很低，說明低溫對菌株DZ11的生長和脫氮性能有著明顯的抑制作用。隨著溫度的逐漸升高，菌株的生長量也逐漸增加。當溫度上升到25℃時，菌株的生長量趨于穩定。菌株的脫氮性能隨著溫度的上升一直在逐漸的增加，當溫度為35℃時，菌株的脫氮性能最優，對氨氮、硝態氮和亞硝態氮的轉化率分別84.39%，79.93%和94.30%。

圖7 溫度對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響Fig.7 Effect of temperature on the growth and denitrification performance of strain DZ11

2.5.4 碳源對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響 碳源對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響如圖8所示，菌株在不同碳源培養基中的生長量的變化趨勢和脫氮情況變化趨勢較為一致且從高到底依次是檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、醋酸鈉和草酸鈉。當以檸檬酸鈉為唯一碳源時的氨氮，硝態氮和亞硝態氮的轉化率分別75.56%，99.00%和97.65%。

圖8 C源對菌株DZ11生長和脫氮性能的影響Fig.8 Effects of source C on the growth and denitrification performance of strain DZ11

3 討論

在進行細菌鑒定時，單一的方法準確性較差，多種方法相結合可以使鑒定方法更加科學。不同的細菌具有不同的代謝類型，從而與各種試劑表現出不同的反應，為此利用生物化學的方法測定細菌在新陳代謝過程中所產生的代謝產物以鑒定細菌的種類。本實驗結合形態學、生理生化指標和16S rDNA 基因測序分析確定了菌株DZ11為假單胞菌屬施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）并命名為Pseudomonas stutzeri DZ11。

用于生態環境保護和污染防治為目的而使用的微生物菌劑需要先進行環境安全評價［13］。本實驗進行了藥敏試驗和生物安全性試驗，菌株DZ11對于常見藥品無明顯耐藥性，并在斑馬魚的生物安全性試驗中斑馬魚的存活率為100%，可以初步判斷出菌株DZ11有較高的生物安全性，為菌株在使用環節中的防范和應急措施提供指導。

好氧反硝化細菌的脫氮性能受環境因素的影響較大，并且降解不同種類的氮源最佳的因素也不相同［14-20］。碳源不僅是菌體生長必須的營養源，而且也是反硝化過程中重要的能量來源和電子受體，對細菌的生長和脫氮效率具有重要影響。好氧反硝化細菌的碳源種類有很多，包括檸檬酸鈉、葡萄糖、草酸鈉、琥珀酸鈉等。菌株DZ11在檸檬酸鈉為碳源時，有最高生長量且綜合脫氮性能最佳，這與Achromobacter sp.L16［21］和 Zobellella sp.［17］結果一致。在其他實驗中也有發現以葡萄糖［22］、乙酸鈉［23］和琥珀酸鈉［8］為唯一碳源時脫氮效率最高。不同的碳源具有不同的分子量和化學結構式，會影響到菌株體內一系列的酶促反應，檸檬酸鈉是一種小分子碳源，可以作為三羧酸循環的中間代謝產物，能直接被細菌所利用，被廣泛的用做反硝化細菌的碳源［21］。

雖然有很多研究探究脫氮過程中的最佳C/N比，但是因為菌株種類不同探究的方向不同，得出的結果也各不相同。本實驗發現，菌株DZ11在C/N為10-20之間綜合脫氮性能最優，隨著C/N的增加，硝態氮的降解效率直線下降，當C/N為40時，硝態氮的降解效率僅為 12.05%。這和 SQ2［8］和 L16［21］結果較為一致。Huang等［24］對菌株C.diversus進行實驗得出好氧反硝化的最優C/N為4-5，Yang等［25］發現在一定范圍C/N比越高，好氧反硝化過程中亞硝態氮的積累量越少，當C/N比為30時亞硝態氮的積累量最少為2.70±0.15。Zheng等［26］發現體系中C/N較低時，會有大量的亞硝態氮積累并且導致細菌生長緩慢甚至不生長。當有機碳濃度增加時，積累的亞硝態氮濃度逐漸減少，細菌生長也得以恢復。他們從總氮去除率著手，得到最佳的C/N比為15。李靜等［27］對菌株HAD-2的研究中發現，當C/N比為25時，異養硝化效率最高。因此，不同菌株的最佳C/N是不一樣的，具有明顯的種屬差異性和個體區別。

溫度是影響菌株活性的重要環境因素之一，溫度變化直接影響微生物的酶活，生長速度，因此只有在最佳的溫度條件下，好氧反硝化細菌才能擁有最佳的脫氮性能［18］。菌株DZ11在30.0-35.0℃時的綜合脫氮效率最高，在大部分的好氧反硝化菌的最佳溫度范圍內［28-30］，該溫度適合在廣東沿海地區的養殖尾水的脫氮工程中使用。何騰霞等［31］發現的耐冷型菌株Y-9的最佳溫度為15℃，李譽琦等［32］發現的耐熱菌株Y7在50℃高溫不影響其降解亞硝酸鹽的效率。這些菌株的發現擴大在極端環境下菌株的可選擇范圍。pH值可以影響細胞內酶的活性，而且還會影響溶液中營養物質或抑制物質的濃度，從而直接或間接影響好氧反硝化菌株的活性［33］，菌株DZ11在pH為7時脫氮性能最優，這與目前大部分好氧反硝化細菌的研究結果相似。

養殖廢水中的無機氮主要為氨氮，亞硝酸鹽，硝酸鹽這三類。本研究發現菌株DZ11可以同時對這三類氮素都有很高的轉化率，并且具有較高的生物安全性，為后續實際應用到養殖尾水脫氮工藝提供理論指導。

4 結論

從廣東中山市民眾鎮水產養殖場底泥及污水中分離篩選出來的菌株DZ11，鑒定為假單胞菌屬施氏假單胞菌并命名為Pseudomonas stutzeri DZ11；通過生物安全性實驗發現，菌株DZ11無明顯耐藥性并且具有較高的生物安全性；菌株DZ11的最佳脫氮環境因素分別為：最優的C源為檸檬酸鈉，最佳C/N比為10，最適溫度為35.0℃，最適pH為7.0；菌株DZ11在以NH4-N為唯一底物時，轉化率可達84.39%；在以NO3-N為唯一底物時轉化率可高達99.0%；在以NO2-N為唯一底物時，轉化率可高達97.65%。