孕婦外周血微小RNA異常表達(dá)譜的鑒定及對(duì)妊娠期糖尿病的診斷價(jià)值研究

鐘新麗，何秋，朱紅霞

在過去的20年里，妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）在中國(guó)人口中的發(fā)病率已經(jīng)上升至17.5%～18.9%，成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題［1］。GDM會(huì)對(duì)胎兒及其母親造成長(zhǎng)期的健康損傷［2］，據(jù)報(bào)道，患有GDM的孕婦易患先兆子癇，高達(dá)70%的GDM婦女會(huì)在分娩后發(fā)生2型糖尿病和心血管疾病［3］。GDM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且未完全闡明［4］。最近的研究表明，孕婦外周血中miRNAs的異常表達(dá)與GDM的發(fā)生有關(guān)，但關(guān)于特異性miRNAs種類尚未達(dá)成一致［5］。miRNAs既存在于細(xì)胞質(zhì)中，也存在于細(xì)胞外基質(zhì)中［6］。雖然外周血miRNAs的確切效應(yīng)尚不清楚，但有研究者發(fā)現(xiàn)，胎盤分泌miRNAs前體進(jìn)入外周血液，由于miRNAs在體液中高度穩(wěn)定，因此，外周血miRNAs可作為多種疾病的候選生物標(biāo)志物［7］。目前，GDM的診斷依賴于口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），但此項(xiàng)檢查流程較多，需要禁食和多次抽血，惡心和嘔吐等不良反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致病人依從性下降［8］。因此，尋找新的GDM生物標(biāo)志物，可能為GDM的早期診斷和輔助診斷提供線索［9］。在本研究中，我們鑒定了GDM病人外周血中差異表達(dá)的miRNAs，評(píng)估驗(yàn)證了miRNAs的靶基因與代謝途徑和生物學(xué)過程之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年1月至2020年2月成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院收治的62例妊娠晚期（妊娠26～40周）糖尿病病人為研究對(duì)象（GDM組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡范圍24～40歲。（2）單胎妊娠。（3）均經(jīng)OGTT試驗(yàn)確診為GDM。（4）首次妊娠。（5）孕婦及其近親屬對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕前糖尿病、高血壓病人。（2）多胎妊娠。（3）合并先兆早產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限、前置胎盤和其他妊娠相關(guān)并發(fā)癥。（4）臨床資料不完全。同時(shí)，選擇同期我院收治的年齡匹配、糖耐量正常的62例孕婦為糖耐量正常（NGT）組。GDM組給予飲食和運(yùn)動(dòng)療法，血糖高于目標(biāo)值者，皮下注射胰島素，直至血糖恢復(fù)正常，血糖控制目標(biāo)為空腹血糖＜5.3 mmol∕L，餐后1 h血糖＜7.8 mmol∕L，餐后2 h血糖＜6.7 mmol∕L。所有孕婦均抽取靜脈血5 mL，輕輕將全血滴入潔凈的EP管，4℃下靜置4 h。在4 000 g、4℃條件下離心10 min，上層為淡黃色血清，吸出上清后再在1 500 g、4℃條件下離心10 min，以最大程度保證血清質(zhì)量，分裝血清，凍存于-80℃冰箱。所有收獲的血液樣品均在-80℃下超低溫保存。本研究使用的臨床資料來自門診和住院病歷。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書。

1.2 最新高通量測(cè)序檢測(cè)使用NanoPhotometer?分光光度計(jì)、Qubit?2.0熒光光度計(jì)和Agilent 2100 RNA Nano 6000分析試劑盒從 等GDM組 和NGT組孕婦外周血中提取總RNA。使用NextSeq測(cè)序平臺(tái)上的SE50測(cè)序程序?qū)细竦腄NA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，以獲得高質(zhì)量的序列讀數(shù)。通過Bowtie對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行清理并與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，并使用miRDeep2軟件鑒定miRNAs。DESeq分析得到差異表達(dá)的miRNAs，篩選標(biāo)準(zhǔn)為Q＜0.05，|log2foldYchange|＞1。

1.3 RNA提取及RT-PCR檢測(cè)根據(jù)制造商的說明，提取總外周血RNA。互補(bǔ)脫氧核糖核酸是用MMul V逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 在 凸 環(huán)miRNA-144∕125b∕543∕15b∕451∕U6 miRNA RT引物（中國(guó)廣東廣州RiboBio）的作用下合成的。定量聚合酶鏈反應(yīng)（QPCR）使用SYBR試劑在CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行，PCR反應(yīng)重復(fù)三次。PCR反應(yīng)條件為95℃變性20 s，然后95℃變性10 s，60℃變性20 s，70℃變性10 s，共40個(gè)循環(huán)。用U6對(duì)qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0軟件包和Weka 3.6數(shù)據(jù)挖掘軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用單樣本Kolmogorov-Smirnov法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)性，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用逐步logistic回歸多因素分析篩選孕期血糖水平升高的因素。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠期糖尿病病人外周血中miRNAs的差異表達(dá)與NGT組相比，GDM組孕婦外周血共檢測(cè)到157個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中114個(gè)上調(diào)，43個(gè)下調(diào)（圖1a）。層級(jí)聚類（圖1b）顯示GDM組與NGT組的miRNA圖譜明顯不同，其中8個(gè)miRNAs顯著上調(diào)，6個(gè)miRNAs下調(diào)（P＜0.05）。

2.2 妊娠期糖尿病和非妊娠期糖尿病病人外周血中差異表達(dá)miRNAs的驗(yàn)證利用qPCR驗(yàn)證在外周血中高表達(dá)且最可能與能量代謝相關(guān)的差異表達(dá)的miRNAs。選取5個(gè)miRNAs，即miRNA125b、miRNA-543、miRNA-144、miRNA-15b和miRNA-451在GDM組和NGT組孕婦外周血組織中進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。qPCR結(jié)果顯 示，NGT組、GDM組miRNA-125b的相對(duì)表達(dá)水平分別為5.83±1.31、1.34±0.30（t=26.31，P＜0.001），miRNA-543的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.93±0.21、0.22±0.06（t=25.60，P＜0.001），miRNA-144的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.42±0.19、1.32±0.28（t=20.94，P＜0.001），miRNA-125b、miRNA-543和miRNA-144的表達(dá)水平與最新高通量測(cè)序結(jié)果一致（P＜0.05）。兩組間miRNA-15b和miRNA-451的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 miRNA-125b和miRNA-144在外周血中的表達(dá)應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測(cè)GDM組和NGT組孕婦血漿中miRNA-144和miRNA-125b的表達(dá)水平。糖化血紅蛋白（HbA1c）和血糖水平，在所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，GDM組均顯著高于NGT組（P=0.499）。與NGT組相比，GDM組孕前體質(zhì)量明顯增加，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、分娩前舒張壓、血小板水平明顯升高。與非妊娠期糖尿病孕婦相比，妊娠期糖尿病孕婦外周血中miRNA-125b表達(dá)下調(diào)（P＜0.001），miRNA-144表達(dá)上調(diào)（P＜0.001）。表1。

表1 兩組孕婦臨床特征比較

表1 兩組孕婦臨床特征比較

注：OGTT為口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，HbA1c為糖化血紅蛋白，BMI為體質(zhì)量指數(shù)。

指標(biāo)OGTT 0 h∕（mmol∕L）OGTT 1 h∕（mmol∕L）OGTT 2 h∕（mmol∕L）HbA1C∕%年齡∕歲分娩時(shí)的妊娠時(shí)間∕d體質(zhì)量∕kg孕期體質(zhì)量增加∕kg孕前BMI∕（kg∕m2）孕期BMI增加∕（kg∕m2）收縮壓∕mmHg舒張壓∕mmHg白細(xì)胞計(jì)數(shù)∕（×109∕L）淋巴細(xì)胞百分比∕%中性粒細(xì)胞∕淋巴細(xì)胞比血紅蛋白∕（g∕L）血小板計(jì)數(shù)∕（×109∕L）腹圍∕cm新生兒體質(zhì)量∕g miRNA-125b miRNA-144 NGT組（n=62）4.46±0.40 6.76±2.54 5.79±1.12 5.13±0.36 30.54±5.74 277.98±9.63 58.76±11.25 16.52±4.43 22.32±3.84 6.28±1.83 125.36±9.25 77.52±5.63 9.46±2.33 20.65±5.24 4.35±3.56 115.63±12.84 242.64±53.14 104.65±8.36 3 418.99±436.25 2.38±1.26 0.73±0.46 GDM組（n=62）5.23±0.59 11.20±1.42 9.23±1.84 5.69±0.53 32.54±4.78 279.65±10.52 65.87±11.02 14.23±5.11 25.14±4.23 5.95±1.76 128.65±10.32 84.32±8.93 8.94±2.24 19.65±5.00 4.49±3.02 114.88±13.04 213.52±48.79 105.68±7.74 3 769.36±536.22 0.54±0.79 2.98±1.35 t值-8.51-12.01-12.57-6.88-2.11-0.92-3.55 2.67-3.89 1.02-1.87-5.07 1.27 1.09-0.24 0.32 3.18-0.71 30.18 9.74-12.42 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.037 0.358 0.001 0.009＜0.001 0.308 0.064＜0.001 0.208 0.279 0.814 0.747 0.002 0.478＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 miRNA-144、miRNA-125b與臨床參數(shù)的相關(guān)性在妊娠期間（r=-0.33，P=0.018）和分娩前（r=-0.29，P=0.039），miRNA144的表達(dá)與BMI呈負(fù)相關(guān)，而與血小板數(shù)量（r=0.31，P=0.028）和餐后1 h血糖水平呈正相關(guān)（r=0.28、P=0.044）。miRNA-125b與妊娠期糖尿病呈負(fù)相關(guān)（r=-0.91，P＜0.001），而miRNA-144和孕前BMI與妊娠期糖尿病呈正相關(guān)（r=0.89、0.30，P＜0.001，P=0.033）。圖2。

圖2 miRNA-144、miRNA-125b與妊娠期糖尿病臨床參數(shù)的相關(guān)性

2.5 影響GDM發(fā)病的危險(xiǎn)因素分析多因素分析結(jié)果顯示，miRNA-125b、miRNA-144和孕前BMI是影 響GDM發(fā) 病 的 獨(dú) 立 性 危 險(xiǎn) 因 素（P＜0.05）。見表2。

表2 影響妊娠期糖尿病發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-125b和miRNA-144在外周血大量表達(dá)，且二者是影響GDM發(fā)病的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。GDM孕婦外周血中miRNA-125b和miRNA-144明顯改變，可作為妊娠期糖尿病的潛在生物標(biāo)志物。此外，與研究報(bào)告一致的是，BMI高的肥胖女性患妊娠期糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)明顯更高，孕前BMI是一個(gè)容易測(cè)量的臨床因素，與妊娠期糖尿病的發(fā)病率呈正相關(guān)［10］。

miRNA-125b是miRNA-125家族的成員。miRNA-125不是孕婦外周血特異性miRNA，胰腺和中樞神經(jīng)細(xì)胞中的β細(xì)胞也分泌miRNA-125［11］。有研究表明，妊娠期miRNA-125水平明顯升高。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)miRNA-125b在外周血中高表達(dá)。然而，研究發(fā)現(xiàn)妊娠晚期GDM病人血清miRNA-125水平無明顯差異，這與本研究結(jié)果不一致。這可能是由于病人特征、實(shí)驗(yàn)方法和組織的不同造成的。有研究者發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，2型糖尿病病人和肥胖男性病人外周血中miRNA-125b的水平顯著降低，這與本研究的結(jié)果一致，其中，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-125b的表達(dá)下降與GDM發(fā)病顯著相關(guān)［12］。最近的研究表明，miRNA-125b的低表達(dá)可能通過增加c-maf轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)而促進(jìn)高血糖［13］，并抑制人去乙酰化酶Sirtuin-7的表達(dá)。研究結(jié)果提示，miRNA-125b的低水平表達(dá)與糖代謝異常有關(guān)。本研究的靶基因功能富集分析結(jié)果表明，miRNA-125b可能通過能量代謝途徑影響血糖代謝。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-144在糖尿病病人血液中表達(dá)上調(diào)，并且在1型、2型糖尿病和妊娠期糖尿病病人中表達(dá)失調(diào)［14］。我們的研究還表明，在妊娠晚期，妊娠期糖尿病病人血漿外切體中miRNA-144的表達(dá)顯著增加。miRNA-144直接靶向胰島素受體底物1（insulin receptor substrate，IRS1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（glucose Transporters，GLUT）［15］。IRS1高度參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，GLUT也可能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝［16］。然而，基于同一隊(duì)列的兩項(xiàng)研究表明miRNA-144與血糖水平呈負(fù)相關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿病病人胎盤絨毛分泌的外體miRNA-144表達(dá)降低［17］。此外，盡管妊娠期糖尿病組孕婦在懷孕前和分娩前表現(xiàn)出更高的miRNA-144和BMI水平，但在本研究中，這兩個(gè)參數(shù)與妊娠期糖尿病的發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)。miRNA-144的異常表達(dá)與糖脂代謝密切相關(guān)，但從現(xiàn)有文獻(xiàn)中得出的結(jié)論是相互矛盾的，可能是由于種族、性別、實(shí)驗(yàn)方法和樣本量的差異［18］。能量代謝與年齡、性別、BMI和不同的身體組織有關(guān)，因此其作用機(jī)制往往非常復(fù)雜［19］。miRNA-144在妊娠期糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了新的妊娠期糖尿病生物標(biāo)志物，為妊娠期糖尿病的診斷方法和發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的思路。但也存在一定的缺陷：（1）缺少隨訪研究來證實(shí)miRNA-125b和miRNA-144對(duì)妊娠早期和中期妊娠期糖尿病發(fā)病率的預(yù)測(cè)價(jià)值；（2）本研究采用病例對(duì)照研究方法，但由于妊娠期糖尿病的影響，兩組孕婦在體質(zhì)量、BMI等基線資料方面不可避免地存在一定的差異；（3）樣本量較少，且來自于單中心，可能存在一定的樣本偏倚。

（本文圖1見插圖1-4）