熊果酸對大鼠海綿體神經損傷性勃起功能障礙的治療作用與機制探討

陳云臣 劉洋 楊勇 孫東翀

陰莖勃起功能障礙(erectile dysfunction,ED)是指在性刺激情況下成年男性的陰莖難以正常或維持勃起,且無法完成滿意的性交,病程＞6 個月［1］。原發性神經元組織損傷之后,一系列的代謝失調,包括缺血、興奮性毒素、鈣和線粒體失調,最終導致炎癥介導的繼發性神經元損傷。海綿體神經損傷后內皮細胞和海綿體平滑肌發生凋亡,一氧化氮合酶陽性神經細胞受到損傷,纖維增生性細胞因子上調,進而出現海綿體平滑肌纖維化［2］。由于對陰莖海綿體神經的損傷,根治性前列腺切除術(radical prostatectomy,RP)術后導致的ED 發生率較高［3］,雖然探索中各種治療方法較多,但目前療效明確的方法并不多。熊果酸(ursolic acid,UA)是一種具有多種藥用特性的中藥提取物,在植物界分布較廣泛,如山楂、梔子、山茱萸,車前等中藥中。研究發現,熊果酸具有鎮靜、抗炎、抗糖尿病、抗潰瘍、降低血糖,以及明顯的抗氧化功能等多種生物學效應［4,5］。熊果酸在腦、脊髓損傷及神經退化性疾病的治療方面有神經保護作用［6］,提示其有可能對RP 術后因海綿體神經損傷導致的ED 發揮潛在的治療作用。因此,本研究以神經損傷性ED 大鼠為研究對象,制備陰莖海綿體神經損傷模型,觀察熊果酸對大鼠勃起功能恢復的影響,初步探討其相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 18 只購于北京科宇有限公司［許可證號：SCXK(京)2018-0010］健康無病原體 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,8 周齡,體重250～300 g。所有大鼠適應性喂養1 周后,隨機分為假手術對照組、模型對照組(雙側海綿體神經損傷)和治療組(雙側海綿體神經損傷+熊果酸治療),每組6 只。

1.2 方法

1.2.1 主要實驗器材及試劑 熊果酸(上海愛必信生物科技有限公司)；MP150 多導電生理儀(美國Biopac公司)；穩壓穩流定時電泳儀(北京六一儀器廠)；Centrifuge 5417R 低溫離心機(美國Eppendorf 公司)；顯微手術器械(上海醫療器械廠)；α-SMA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和N-NOS 兔多克隆抗體(美國Abcam 公司)。全部實驗操作均在解放軍總醫院動物實驗室開展,參照解放軍總醫院動物使用指南執行。

1.2.2 神經損傷模型建立 參照王飛翔等［7］提供的方法建立大鼠神經性ED 模型。所有SD 大鼠使用3%戊巴比妥鈉溶液30 mg/kg 腹腔注射進行麻醉。在下腹部行正中切口,前列腺背外側找到兩側盆神經節,距盆神經節發出3～5 mm 處用小彎血管鉗分別鉗夾雙測海綿體神經,血管鉗扣合至最后一個咬齒,鉗夾海綿體神經各2 min。

1.2.3 治療方法 熊果酸溶于1% 二甲基亞砜(DMSO)-磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中,治療組大鼠給予熊果酸50 mg/kg 灌胃,1 次/d；假手術對照組和模型對照組則給予同樣體積的1% DMSO 在PBS 中作為載體對照,1 次/d。上述治療自海綿體神經損傷模型建立后第1 天開始,持續4 周。

1.2.4 大鼠陰莖海綿體壓力測定及頸動脈測壓 實驗開始4 周后,三組大鼠使用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg進行腹腔注射麻醉。打開大鼠腹腔,找到盆神經節和海綿體神經,放置刺激電極,測定海綿體內壓(intracavernous pressure,ICP),刺激持續時間設置為60 s,設置參數：電流強度為1.5 mA、刺激頻率為20 Hz。游離穿刺頸總動脈,測定平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)。通過比較ICPmax/MAP 評估陰莖勃起功能。測壓結束后深度麻醉處死SD 大鼠,留取陰莖組織,供后續研究使用。

1.2.5 Masson's 三色染色 應用4%多聚甲醛固定陰莖組織,石蠟包埋并制備4 μm 厚度切片。進行脫蠟、水化后遵照Masson's 試劑盒進行染色。在光鏡下觀察陰莖海綿體,膠原組織被染為綠色,平滑肌組織被染為紅色。使用Image-Pro plus 軟件對海綿體平滑肌/膠原比例進行分析。

1.2.6 免疫組織化學染色 海綿體測壓后深度麻醉處死大鼠,取陰莖中段組織,多聚甲醛固定陰莖組織,石蠟包埋,制備4 μm 厚度切片；進行脫蠟、水化；抗原修復及封閉后滴加一抗(α-SMA)37℃孵育1 h；滴加反應增強液,在室溫下孵育20 min,滴加酶標二抗,在室溫下孵育20 min；二氨基聯苯胺氧化氫(DAB-H2O2)顯色,自來水充分漂洗,復染、脫水、透明,封片；光鏡下觀察。

1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達 使用含有蛋白酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀試驗(RIPA)緩沖液進行裂解陰莖組織,行Western blot 分析。使用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度,然后將蛋白進行凝膠電泳和電轉,用5%脫脂奶粉封閉,并與α-SMA、GAPDH 和nNOS 的一抗孵育過夜。在室溫下與二抗孵育后顯影拍照,采用Image-Pro Plus 軟件進行分析條帶。

1.3 觀察指標 比較三組大鼠ICPmax、MAP、ICPmax/MAP、平滑肌/膠原比值、平滑肌含量及nNOS、α-SMA 表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差 ()表示,采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠ICPmax、MAP 及ICPmax/MAP比較假手術對照組和治療組ICPmax 和ICPmax/MAP 均明顯高于模型對照組,差異具有統計學意義(P＜0.05)；三組MAP 比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 三組大鼠ICPmax、MAP 及ICPmax/MAP 比較()

表1 三組大鼠ICPmax、MAP 及ICPmax/MAP 比較()

注：與模型對照組比較,aP＜0.05

2.2 三組大鼠Masson's 三色染色檢測平滑肌/膠原比值比較 陰莖海綿體組織石蠟切片行Masson's 三色染色(圖1A),利用平滑肌(紅色)/膠原(綠色)比值評估陰莖組織間質膠原沉積(圖1B)。假手術對照組和治療組平滑肌/膠原比值均高于模型對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖1A 陰莖海綿體組織石蠟切片Masson's 三色染色

圖1B 三組大鼠平滑肌/膠原比值比較

2.3 三組大鼠免疫組織化學染色平滑肌含量比較 陰莖海綿體組織石蠟切片行免疫組織化學染色(圖2A),免疫組織化學染色觀察海綿體平滑肌含量(圖2B)。假手術對照組和治療組平滑肌含量高于模型對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖2A 陰莖海綿體組織石蠟切片免疫組織化學染色

圖2B 三組大鼠平滑肌含量比較

2.4 三組大鼠Western blot 檢測α-SMA 表達比較假手術對照組和治療組α-SMA 表達高于模型對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 三組大鼠Western blot 檢測α-SMA 表達比較

2.5 三組大鼠Western blot 檢測nNOS 表達比較 假手術對照組和治療組nNOS 的表達均高于模型對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 三組大鼠Western blot 檢測nNOS 表達比較

3 討論

前列腺癌發病率在全球呈顯著上升趨勢［8］,而RP 是目前治療局部進展性前列腺癌最常見的方法。但即使在神經保留手術方式出現后,RP 術后ED 發生率仍然很高。根據一項前列腺癌預后研究,在為期5 年的隨訪中,60%的患者在RP 術后18 個月自我報告有ED［9］。RP 術后的ED 對許多患者及其性伴侶的生活有影響極大,尤其是對于性生活活躍的相對年輕的患者而言更是如此。臨床部分外科手術也會引起術后ED。陰莖海綿體神經是副交感神經,沿前列腺后外側走行并支配陰莖,通過控制流向陰莖海綿體組織的血液調節勃起功能。解剖學上,海綿體神經緊鄰前列腺包膜,在前列腺癌根治性切除過程中,極易受到機械性或電、熱等損傷,進而引起術后ED［10］。有關RP 術后ED 的實驗研究,需要建立可靠的動物模型。本研究通過利用鉗夾海綿體神經造成人為神經損傷,模擬RP 術后相關海綿體神經損傷過程［11］,高度類似于臨床實際手術操作,重復好,能夠滿足實驗的需求。海綿體神經損傷后對交感神經的拮抗作用減弱,引起陰莖海綿體平滑肌功能障礙,特別是舒張功能,這是海綿體神經損傷術后早期出現ED 的關鍵原因［12］。然而,在海綿體神經損傷后磷酸二酯酶5 型抑制劑的治療效果有限［13］,提示還存在著更深層次的原因。有研究結果表明,海綿體神經損傷誘導的ED 可因進行性海綿體纖維化和海綿體去神經支配而逐步進展［14］。

神經元組織損傷后出現一系列代謝失調,包括缺血、興奮性毒性、鈣和線粒體失調,最終導致炎癥介導的繼發性神經元損傷。因此,在神經保護方法中抗炎治療是合理的,可為新的神經元生長提供基礎。熊果酸具有抗氧化和抗炎作用,其具有改善神經損傷的獨特潛力。Zhang 等［15］采用大鼠蛛網膜下腔出血腦損傷模型,觀察熊果酸(25 或50 mg/kg)給藥48 h 后的作用效果,發現治療組細胞間粘附分子-1、Toll 樣受體4、核因子-κB、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、誘導型一氧化氮含量顯著降低。這一結果表明,抗炎及細胞凋亡抑制作用是熊果酸具有神經保護作用的重要機制。相關研究［16］評估熊果酸對小鼠腦損傷的影響,發現在腦損傷誘導后24 h 實驗后經熊果酸(50～150 mg/kg)干預,可以減少腦水腫和神經功能障礙,顯示出明顯的神經保護作用。相關研究［17］利用脊髓損傷小鼠模型研究了熊果酸對神經再生的影響,發現熊果酸100 或200 mg/kg,1 次/d,連續治療6 周后可以促進軸突再生和運動功能的恢復。此外,熊果酸還具有抑制損傷脊髓中IL-6 和TNF-α 等促炎細胞因子生成的作用。Li 等［18］通過小鼠腦缺血的大腦中動脈閉塞模型,研究了熊果酸的神經保護作用,發現熊果酸可使腦梗死面積顯著減少,同時使脂質過氧化標記物丙二醛維持在低水平。

海綿體神經損傷后海綿體組織內缺氧,平滑肌細胞凋亡增加,引起組織纖維化,收縮型標記物如α-SMA、肌動蛋白等表達下降［19］。本研究通過檢測大鼠ICP 和MAP 發現,模型對照組大鼠ICPmax/MAP明顯低于假手術對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。由此說明神經損傷性ED 大鼠模型構建成功。治療組ICP 高于模型對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。表明熊果酸對勃起功能具有改善作用。免疫組織化學及Masson's 三色染色發現治療組平滑肌/膠原比值高于模型對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。由此證明經過熊果酸干預后平滑肌細胞凋亡減少,組織纖維化得到改善。通過Western blot 檢測海綿體中α-SMA的表達水平,得到相似的結果,即假手術對照組和治療組α-SMA 表達高于模型對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。由此表明熊果酸使α-SMA 表達水平上升［20］。同時,對三組nNOS 表達水平檢測發現,經過熊果酸干預后,治療組nNOS 表達水平高于模型對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。

熊果酸保護陰莖海綿體組織的機制與其抗炎作用關系密切。核因子紅細胞系2 相關因子2(nuclear factor erythroid derived 2-like 2,Nrf2)能夠加強細胞抗氧化作用,是機體抗氧化防御系統中重要的調節因子。相關研究表明,熊果酸可使Nrf2 蛋白核易位增多、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)醌氧化還原酶及血紅素氧化酶表達增加,誘導Nrf2 和血紅素氧化酶在蛋白和mRNA 水平的核表達相結合,抑制細胞間粘附分子-1、Toll 樣受體4、核因子-κB、白細胞介素-1β、TNF-α 等的表達,提示Nrf2 信號通路是熊果酸發揮其潛在作用重要機制［15-17］。熊果酸可能是通過Nrf2信號通路作用影響海綿體神經,使勃起神經損傷后大鼠ICP 明顯改善,陰莖海綿體組織nNOS、α-SMA 的表達水平升高,平滑肌調亡減少,進而減輕海綿體纖維化,使大鼠勃起功能得到改善。因此,熊果酸能夠通過其抗炎、抗氧化作用改善海綿體神經損傷后大鼠陰莖海綿體平滑肌的氧化損傷和緩解組織纖維化,進而改善陰莖勃起功能,顯示熊果酸的潛在治療作用。

綜上所述,熊果酸能夠通過抑制陰莖海綿體纖維化有效改善神經性ED 大鼠的陰莖勃起功能,而神經保護作用及抗氧化損傷作用可能是熊果酸對神經損傷性ED 發揮治療作用的潛在機制。但在本次研究中,主要觀察陰莖海綿體組織及其勃起功能的變化,熊果酸對海綿體神經本身的影響尚未涉及,有待于進一步探討。