血清miR-30c-2-3p與卵巢癌組織內質網應激相關蛋白表達及患者預后的相關性

張紀妍，曾賽田，奚杰

(滄州市中心醫院 婦科，河北 滄州 061000)

卵巢癌(OC)是婦科惡性腫瘤死亡的主要原因，盡管臨床在改進治療方式方面付出了巨大努力，但因OC發病隱匿，且惡性程度高、易于轉移和復發，多數患者預后不良[1-2]。因此，早期檢測仍然被視為成功治療和優化OC患者生存率的重要標準。然而常用腫瘤生物標志物缺乏敏感性或特異性，不足以作為預后指標。微小RNA(miRNA)是一類短非編碼RNA[3]，可調節癌癥相關基因的表達，從而表現出潛在的臨床相關性，并用于靶向治療[4]。內質網應激(ERS)后未折疊蛋白反應(UPR)的激活和相關蛋白表達變化可促進腫瘤細胞的生長、存活和侵襲，最終影響腫瘤特征及預后[5]。而OC作為一種惡性實體瘤，一直受到ERS的挑戰。最近，有研究提出miR-30c-2-3p可能通過降低內質網的折疊能力導致ERS增強，從而促進OVCAR3和SKOV3細胞凋亡[6]。因此，本研究旨在分析OC患者血清miR-30c-2-3p與ERS相關蛋白的關系，評估其對OC患者預后的預測效能，為臨床提供可靠的預后生物標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究為一項前瞻性單中心研究，經倫理委員會批準后，向所有患者解釋了本研究的目的。2018年1月至2020年12月，本研究共招募了70例于我院接受手術治療的OC患者(OC組)，術前3 d采集血清樣本。收集新鮮的OC組織并立即在液氮中速凍，并在RNA分離前儲存在-80 ℃環境下。所有組織均由2名病理學專家根據蘇木精-伊紅和免疫組織化學染色確診。納入標準：(1) 經術后病理檢查確診為OC；(2) 年齡≥18歲；(3) 初診，在手術前未接受過任何抗腫瘤治療。排除標準：(1) 合并其他部位原發惡性腫瘤者；(2) 合并嚴重心、肝、腎等重要臟器障礙，自身免疫性疾病，全身性感染性疾病者；(3) 樣本或臨床數據不足、失訪者。根據2014年婦產科聯合會(FIGO)分類進行腫瘤分期。所有患者均有完整的臨床病理資料，并簽署了知情同意書。此外，招募了100例既往無良性疾病或惡性腫瘤病史的女性健康個體作為對照組。抽取每個參與者靜脈血，3 000 r·min-1離心10 min，然后收集上清液并儲存在-80 ℃直到使用。兩組年齡、體重指數具有可比性(P>0.05)。

1.2 腫瘤裂解物的制備和抗C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖調節蛋白78(GRP78，又稱為BIP)蛋白質印跡法分析

將OC組織樣品在含有蛋白酶及磷酸酯酶抑制劑混合物(美國Sigma)的RIPA緩沖液(200～400 μl)中裂解，進行短超聲處理以形成均質組織裂解物。用BCA測定法(美國Thermo Fisher)定量蛋白濃度。使用10%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(30～40 μg蛋白)，并將其轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用CHOP抗體(1∶20 000，英國Abcam)或BIP抗體(1∶15 000，英國Abcam)結合膜蛋白，使用辣根過氧化物酶(HRP)結合的山羊抗兔IgG抗體(1∶1 000，中國北京TransGen Biotech)二次孵育。使用ECL試劑觀察蛋白表達情況。

1.3 定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測血清miR-30c-2-3p表達

術前3 d及術后3 d早上8點采集患者肘靜脈血5 ml，對照組早上8點采集肘靜脈血5 ml，置于含有乙二胺四乙酸二鉀的抗凝管中，850 r·min-1離心15 min。吸取上層血清(2 ml)轉移至離心管，并以16 000 g離心10 min，沉淀細胞碎片。將上清液保存在新離心管中并儲存在-80 ℃環境下。嚴格按照mirVanaTMmiRNA分離試劑盒(美國Ambion)的說明書進行總RNA提取。使用逆轉錄試劑盒(美國Ambion)將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板用miRNA RT-qPCR試劑盒(美國Ambion)進行PCR擴增。PCR條件如下：90 ℃ 5 min，1個循環；90 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 s，共40個循環。所有樣品重復檢測3次。使用2-ΔΔCt法計算miR-30c-2-3p相對表達量，其中Δ周期閾值(Ct)=CtmiR-30c-2-3p-Ct內參U6。

1.4 隨訪觀察

所有患者以電話或復診方式隨訪，隨訪統計患者3年期間生存情況。隨訪包括全身及盆腔檢查、盆腹腔超聲檢查，術后2年內2～3個月隨訪1次，之后每3～6個月進行1次隨訪。本研究主要觀察終點為無病生存期(DFS)，定義為患者手術后組織學診斷確診的日期到復發、死亡或最后1次隨訪的日期。所有患者均完成隨訪，無失訪病例。

1.5 生物信息學分析

為了解CHOP、BIP在OC中的表達，我們使用了從基因表達譜交互分析(GEPIA)(http:∥gepia.cancer-pku.cn/)數據庫獲得的RNA序列數據分析OC標本和正常卵巢組織標本中CHOP、BIP轉錄本數據差異。使用Kaplan-Meier繪圖儀網站(http:∥kmplot.com/analysis/)評估這兩種因子的預后價值，該數據庫可用于評估54 000種基因對21種癌癥類型生存率的影響，最大的數據集包括2 190例OC病例。

1.6 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理，血清miR-30c-2-3p表達符合正態分布，通過t檢驗檢測2組的差異。采用卡方檢驗或Fisher精確概率分析方法分析血清miR-30c-2-3p表達水平與臨床和病理參數之間的相關性。使用XLSTAT軟件構建受試者工作特征(ROC)曲線，并計算曲線下面積(AUC)。生存分析采用Kaplan-Meier圖和Log Rankχ2檢驗，并進行COX回歸模型分析。相關分析采用Pearson相關系數法。以P<0.05差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組受試者血清miR-30c-2-3p表達比較

經qRT-PCR分析，OC組患者基線血清miR-30c-2-3p表達水平顯著低于對照組受試者(0.77±0.25vs.1.15±0.39，t=7.869，P<0.001)。經ROC曲線分析，基線血清miR-30c-2-3p表達診斷OC的AUC為0.785(95%CI0.718～0.852)，cut-off值為0.703，見圖1。

圖1 血清miR-30c-2-3p表達診斷OC的ROC曲線Fig 1 ROC curve of serum miR-30c-2-3p expression in diagnosis of OC

2.2 基線血清miR-30c-2-3p表達與OC患者臨床病理特征的關系

根據OC患者基線血清miR-30c-2-3p表達均值(0.77)，將基線血清miR-30c-2-3p表達≤0.77的OC患者納入低表達組(n=34)，>0.77的患者納入高表達組(n=36)。經分析低表達組中FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期的患者例數更多，且腫瘤直徑更大(P<0.05)，見表1。

2.3 基線血清miR-30c-2-3p與組織ERS相關蛋白表達的相關性

經Pearson相關系數分析，基線血清miR-30c-2-3p表達水平與OC組織CHOP表達水平呈正相關(r=0.483，P<0.001)，與BIP表達水平呈顯著負相關(r=-0.240，P=0.045，圖2)。進一步校正年齡、組織學類型、分化程度和血清腫瘤標志物后，經多元線性回歸分析，OC組織中CHOP(t=4.080，非標準化系數=0.884，標準化系數=0.448，95%CI0.451～0.967，P<0.001)、BIP(t=-2.048，非標準化系數=-0.477，標準化系數=-0.245，95%CI為-0.943～-0.012，P=0.045)都是影響基線血清miR-30c-2-3p表達水平的獨立因子。

2.4 基線血清miR-30c-2-3p表達與OC患者術后復發的相關性

繪制Kaplan-Meier生存曲線并進行Log-rank檢驗，基線血清miR-30c-2-3p低表達OC患者中位DFS顯著短于高表達者(34個月vs. 43個月，χ2=7.515，P=0.006，圖3)。進一步經單因素和多因素COX回歸分析，結果顯示基線血清miR-30c-2-3p低表達為OC患者術后復發的獨立臨床因素(OR=0.399，95%CI0.201～0.791，P=0.009)。

2.5 基于數據庫分析CHOP和BIP在OC組織中的表達及其與預后的關系

我們使用GEPIA數據庫中426個OC和88個正常卵巢組織的基因表達數據進行分析，OC組織中CHOP mRNA表達顯著低于正常卵巢組織，而BIP mRNA表達則高于正常卵巢組織(P<0.05)。根據癌癥基因組圖譜(TCGA)數據繪制Kaplan-Meier生存曲線，CHOP低表達隊列的中位生存期為20個月，而CHOP低表達隊列的中位生存期為16個月，CHOP高表達組的總生存率(OS)較低表達組高(P<0.05)。見圖4。

圖4 在數據庫中CHOP 和BIP mRNA的表達和預后Fig 4 Expressions and prognosis of CHOP and BIP mRNA in the database

3 討 論

目前，OC患者的預后仍然很差，這可能是因為缺乏用于早期診斷、預后評估和精準治療的有價值的生物標志物。因此，了解與OC發生和發展相關的作用機制對于挑選新的分子標志物用于早期診斷和評估預后至關重要[7]。本研究分析發現基線血清miR-30c-2-3p表達水平在OC患者中普遍降低，而且在區分OC組與對照組方面表現良好，這說明miR-30c-2-3p可能參與OC的發生、發展。

miRNA是一類長度為21～23個堿基的非編碼單鏈小分子RNA，在轉錄后調節生物體內源基因表達，參與調控機體正常發育和疾病發生發展等過程[8]。血液中循環的miRNA被認為可作為各種疾病的生物標志物，并在細胞-細胞通信中發揮重要作用。這些miRNA不僅在受體細胞中具有活性功能，而且許多miRNA可以與細胞表面的受體相互作用[9]。目前已有多種miRNA被發現與OC預后相關，如miR-1231表達上調可抑制細胞增殖和細胞周期進程，miR-1231表達較低預示著OC患者預后較差[10]；OC患者miR-196b的高表達也與較差的預后相關，miR-196b可以通過調節與細胞活力和有絲分裂有關的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B表達促進OC細胞增殖[11]；miR-182也在OC組織中上調，對OC的生物學進展至關重要[12]。

有研究[13]發現，miR-30家族對OC患者也具有預后價值，其較高表達顯著改善了OC患者的OS及無進展生存率。Zhang等[14]證實，與正常卵巢上皮細胞相比，所有OC細胞系中均為低miR-30表達，同時過表達miR-30的卵巢SKOV3和A2780癌細胞系均表現出較低的增殖率，表明miR-30家族在卵巢癌中具有一定的抑癌基因活性。miR-30a/c-5p也可直接抑制DNA甲基轉移酶1(DNMT1)以及Snail。強制表達miR-30a/c-5p或敲除DNMT1和Snail可促進CP70細胞的順鉑敏感性并部分逆轉上皮間質轉化(EMT)。同時，抑制miR-30a/c-5p或DNMT1和Snail的異位表達在順鉑敏感的OC細胞系A2780細胞中誘導順鉑耐藥和部分EMT[15-16]。此外，與正常卵巢細胞組織相比，miR-30c在OC中低表達與轉移相關基因 1(MTA1)表達上調有關，這可能是OC細胞轉移的機制之一[17]。而在卵巢SKOV3和OVCAR3癌細胞系中，濃度為1 nmol·L-1～20 μmol·L-1的溶血磷脂酸刺激30～60 min增強細胞增殖，會代償性增加miR-30c-2-3p表達。這表明生長因子誘導的OC細胞增殖通過顯著增加miR-30c-2-3p介導中和反應，從而降低SKOV3和OVCAR3細胞中B-細胞淋巴瘤因子9的表達和細胞增殖，可能是一種調節下游信號轉導的機制[18]。本研究在OC患者基線血清中發現miR-30c-2-3p低表達，此外基線血清miR-30c-2-3p低表達與FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑更大相關。

基線血清miR-30c-2-3p低表達還與術后高復發率相關，Rezghi等[6]認為miR-30c-2-3p在OC中的作用機制與ERS相關，ERS凋亡相關的CHOP和BIM適度上調，而BIP下調。ERS后，由于錯誤折疊/未折疊蛋白質的積累，細胞應激會激活UPR，從而停止蛋白質的翻譯并刺激未折疊和聚集蛋白質的降解。最終，除非蛋白質穩態恢復，否則細胞會發生凋亡。UPR信號通路在癌癥中具有潛在的臨床相關性，因為它們影響腫瘤特征，是臨床結果的預后因素。上皮性OC中ERS相關蛋白的表達增加表明了上皮性OC中ERS和UPR的作用[19]。本研究中術前血清miR-30c-2-3p與組織ERS相關蛋白CHOP及BIP的相關性說明miR-30c-2-3p可放大ERS的嚴重性，促進細胞凋亡，即miR-30c-2-3p對ERS誘導的OC細胞凋亡具有調節作用。此外，我們使用GEPIA數據庫基因表達數據進行分析發現，CHOP高表達組OC患者的OS較低表達組高。

綜上所述，根據我們的初步研究結果，OC患者基線血清miR-30c-2-3p表達多呈差異性降低，而這可能是OC惡性轉化和進展的一個重要特征。此外，血清miR-30c-2-3p低表達可能與腫瘤細胞中CHOP表達降低和BIP表達上調有關，這也預示著OC患者生存預后不良。盡管這種可能性必須在涉及大量患者的研究中得到證實，但miR-30c-2-3p很可能成為與OC相關的潛在生物標志物。