藥品微生物限度檢查方法適用性中存在的問題及改進建議

任穎慧 曹魯娜 趙蕊蕊 武 玲

藥品微生物限度檢查是保證用藥的有效性、保障藥品安全性的重要措施[1]。我國開展藥品微生物污染檢查工作始于1972年[2]，《中華人民共和國藥典》2005年版初次提出微生物限度檢查方法驗證，2015年版將方法驗證修訂為方法適用性，形成了較為完善的藥品微生物控制標準體系，基本與美國藥典（USP）等國際人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）方案接軌，實現了微生物限度檢查由最終產品檢驗向過程控制的改變。方法適用性將試驗條件、供試品等因素作為一個整體系統來評價，更具科學性[3-5]。由于我國方法適用性工作開展時間較短，加之在前版藥典規定的方法驗證基礎上有大幅度修訂，有些實驗室在開展該項工作時對新版藥典要求理解不夠透徹、檢驗能力不足、建立的微生物限度檢查方法不夠規范，與標準要求還存在一定的差距。本文以筆者所在實驗室2020年1月至2021年10月收集的541份藥品生產企業提供的方法適用性資料為樣本，對照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1105、1106和1107有關非無菌產品微生物限度檢查方法的要求[6]，逐份審核企業提供的方法適用性資料，針對審核資料時發現的問題進行分類整理，結合筆者實際工作，分析其問題來源并針對性提出正確的解決方案，為推動企業規范開展方法適用性試驗提供參考。

1 存在的問題及分析探討

1.1 微生物計數法存在的問題

微生物計數法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數[6]。方法適用性資料中出現問題較多的是稀釋液的使用、試驗菌的使用、試驗菌株的回收試驗、抑菌活性去除等方面。

1.1.1 稀釋液的使用 供試品的處理是獲得良好檢驗結果的基礎[7]。對于水溶性供試品，供試液制備時藥典規定可以選用的稀釋液有pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、pH7.2磷酸鹽緩沖液或胰酪大豆胨液體培養基3種，有的企業試驗記錄中照抄照搬藥典內容，將3種稀釋液羅列。正確的操作建議：每次試驗應據實寫明具體使用的是哪種稀釋液，同時應明確標注取用量，而不能用“取適量”描述。

1.1.2 試驗菌的使用 《中華人民共和國藥典》2020年版四部對試驗菌共有3個要求：1）試驗菌株傳代次數不能超過5代，且應使用新鮮培養物（黑曲霉除外）；2）所加菌液的體積應不超過供試液體積的1%；3）加入試驗菌液后使每毫升供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100 cfu[6]。要同時滿足這3個要求，在制備菌液時應充分考慮。有的企業將試驗菌液制成每毫升含菌量不大于100 cfu的菌懸液，采用平皿法制備試驗菌液時取1∶10供試液10 ml，加入1 ml上述菌懸液。這樣以來，所加菌液體積超過了供試液體積的1%，相當于試驗菌液對供試液進行了稀釋，增加了計數結果誤差，降低了檢測的準確度。有的企業取供試品10 g，加入稀釋劑至100 ml，制成1∶10供試液，試驗組直接取上述100 ml供試液加入不大于100 cfu的菌懸液1 ml，滿足了所加菌液的體積應不超過供試液體積的1%，但每毫升供試液含菌量不大于1 cfu，以上兩種操作菌懸液含菌量過低易引入操作誤差，同時菌落數分布的不均勻可能會導致試驗菌無法順利回收。第2種方法更是造成了培養基的大量浪費，因為制備的試驗組混勻后僅需分注2個平皿（1 ml/皿）進行微生物培養計數。

正確的操作建議：取不超過5代的藥典規定的5種試驗菌株，制備成含菌量為103～104cfu/ml的菌懸液或孢子懸液，以平皿法為例，應取供試液9.9 ml，加入0.1 ml試驗菌懸液[8]，同時滿足了規定的3個條件，而且這種操作簡單便捷，避免了培養基和試驗菌懸液的浪費。采用薄膜過濾法時，每張濾膜每次沖洗量一般為100 ml，在最后一次沖洗液中加入1 ml含菌量不大于100 cfu的菌懸液，即可滿足藥典要求。

1.1.3 試驗菌的回收試驗 微生物計數方法適用性試驗菌株有5種，包括金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，其中白色念珠菌和黑曲霉既用于需氧菌總數計數，同時用于霉菌和酵母菌總數計數，只是所用的培養基不同。資料審核中，有一家企業未對黑曲霉進行回收試驗。如果操作不當，黑曲霉容易對試驗環境造成污染；試驗人員防護不當，黑曲霉有可能對人員造成傷害[9-10]。但這些危險因素可以通過嚴格的標準操作規程防范，不能成為規避標準要求的借口。

微生物限度檢查是檢測活的微生物，其自身處于生長、繁殖和死亡的生物代謝狀態。與化學對照品含量穩定不同，試驗菌液的含菌量不是固定的，因此，每一次使用時都要進行預計數，在試驗時應進行同步準確計數。

1.1.4 抑菌活性的去除 方法適用性的目的是建立對樣品影響更小、操作效率更高的方法[11]，存在工作量大、重復勞動過多的問題[12]，抑菌活性的去除是微生物限度檢查工作的重點和難點[13]。541份方法適用性資料中，采用平皿傾注法（1∶10）的有301份；其他240份均采用了增加稀釋液或培養基體積、使用中和劑、薄膜過濾法，以及上述方法的聯合應用等去除抑菌活性。有的企業去除樣品抑菌活性時采用增加稀釋液體積（平皿傾注法1∶100供試液）進行方法適用性試驗，各試驗菌回收比值均在0.5～2范圍內，在滿足藥典要求的情況下，繼續采用薄膜過濾法進行試驗，結果薄膜過濾法的試驗結果與平皿法相差無幾，最后確定的方法是平皿傾注法（1∶100）。筆者認為這種雙重試驗不可取。通過科學嚴謹的試驗設計得出有效結論后，應及時予以確認，無須重新開展試驗，重復性試驗對人力物力都是極大的浪費。這在一定程度上表明檢驗人員對藥典要求理解不充分。

有的企業在重新進行方法適用性試驗時，直接選用高稀釋級供試液、薄膜過濾法或添加中和劑等方法進行抑菌活性的去除。筆者認為每一次方法適用性試驗都應該做到全面、完整，為了減少檢驗工作量，提高工作效率，可以借鑒以往工作經驗和按照前版藥典要求建立的方法適用性資料，選用回收比值低于0.5的菌株作為敏感菌株開展預試驗，當預試驗符合藥典要求后再進行正式試驗，而不宜直接略過。

正確的操作建議：設計試驗方案時應遵循由簡到繁，由單一到聯合的原則，采取循序漸進的方式逐步開展。一般選擇平皿法最低稀釋級進行初篩，當回收比值符合要求時，即可對方法進行確認。當任一回收比值不在0.5～2范圍時，表明樣品對試驗菌株有一定的抑菌活性，可采取適宜的方法去除樣品抑菌活性重新開展試驗。對于采取多種方法均無法去除抑菌活性的樣品，表明樣品不易被該類微生物污染，應結合風險評估采用回收比值最為接近的方法[11]。

1.1.5 對照試驗的開展 使用中和劑時，應確認其有效性和對微生物無毒性，中和劑對照組回收比值應在0.5～2范圍內[6]；在12份使用中和劑去除樣品抑菌活性資料中，僅有1份設計了中和劑對照組試驗。

開展方法適用性試驗時，應進行陰性空白對照試驗，用于監測試驗過程中是否引入二次污染、試驗條件是否滿足藥典要求，確保選定的方法具有良好的系統適用性，從而保證檢驗結果的準確性。一旦陰性空白對照試驗出現陽性結果，表明本次試驗結果無效，需要立刻啟動OOS調查找出污染環節并采取糾正措施后重新進行試驗。

1.2 控制菌檢查法存在的問題

控制菌檢查用于在規定的條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物[6]。出現問題較多是加菌方式以及耐膽鹽革蘭陰性菌檢查中的問題。

1.2.1 加菌方式的問題 控制菌檢查是將供試液和試驗菌液分別加入培養基，不需將試驗菌液加入供試液混勻后加入培養基。有的企業混淆了現行版藥典中的微生物計數和控制菌檢查加菌方式，直接將試驗菌液加入供試液混勻后再加入培養基。

1.2.2 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查中的問題

1.2.2.1 試驗菌的使用 耐膽鹽革蘭陰性菌泛指能夠在結晶紫中性紅膽鹽培養基中生長的微生物，腸桿菌科的細菌、產氣單胞菌屬和假單胞菌屬屬于這一類[14]。確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時，大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌，有的企業單獨使用大腸埃希菌或銅綠假單胞菌，不符合藥典要求。

1.2.2.2 不能準確區分定性或定量檢查 如某樣品為含藥材原粉的固體口服制劑，按照《中華人民共和國藥典》四部通則1107規定耐膽鹽革蘭陰性菌應進行定量檢查，標準要求是“小于102cfu/g”，但企業提供的資料進行了定性檢查。通則1107非無菌藥品微生物限度標準是根據藥品的給藥途徑及特性等制訂，凡規定“不得檢出”的應進行定性檢查，凡規定“小于……”的應進行定量檢查。

1.2.2.3 預培養用供試液體積過少 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查時，應首先對1∶10供試液進行預培養。藥典對預培養的供試液體積沒有明確要求，有的企業取1∶10供試液1 ml進行預培養。預培養的目的是使供試液中的微生物得以恢復，取樣量應對樣品具有一定代表性，供試液過少對供試品的代表性較差，可能出現假陰性結果。正確操作建議：在進行試驗準備時，要為該項目預留不少于10 ml的1∶10的供試液進行預培養，然后取預培養物1 ml進行后續試驗。

1.2.2.4 加入菌液進行預培養 該項檢查是為了使供試品的受損細菌充分恢復但不繁殖，需要對1∶10供試液進行預培養（約2 h）。此時，不能將試驗菌液加入1∶10供試液進行預培養，適宜的培養條件會導致試驗菌株快速繁殖，可能產生錯誤的試驗結果。

1.3 其他問題

1份資料中提出回收率應高于70%，為《中華人民共和國藥典》2010年版藥典要求，表明企業在進行方法適用性試驗時沒有對現行版藥典進行系統學習和理解，只是簡單抄寫上版方法適用性材料；有4家企業提供的方法適用性資料沒有單位公章，無從確認資料的有效性和可靠性；有2家企業提供的資料是企業所在地省級藥品檢驗機構的方法適用性資料，表明企業在委托檢驗完成后，沒有進行方法的轉移和確認；541份資料中，有109份使用“常規法”“稀釋法”等新版藥典未收載的方法術語進行描述。

2 改進建議

2.1 提高檢驗人員檢驗能力

綜上所述，可以看出大部分問題的出現源于對現行版藥典要求理解不透徹，主要問題源于檢驗人員專業能力不足。通過對轄區內藥品生產企業的調研，得知在小型藥品生產企業中很少單獨設置微生物檢驗人員崗位，大部分都是從事理化項目檢驗的人員兼崗開展工作。微生物常規檢驗主要靠人工操作，不涉及大型自動化精密儀器，基本操作容易掌握，在企業中普遍對其重視不夠，實際上該項目易學難精。企業提供的培訓機會少，同時檢驗人員自身對提升檢驗技術的主動性差，導致對微生物限度檢查積累經驗少，對標準理解不透徹、不充分。因此，企業應加強微生物檢驗人員的培養，組織集中培訓學習理論知識，不定期開展實際操作的考核。在條件允許的情況下，建議派遣技術骨干到本級或上級藥品檢驗機構進行系統學習，學成后在企業內部實施“傳幫帶”，切實掌握好微生物限度檢查操作技術，建立起一支過硬的微生物檢驗隊伍。

《中華人民共和國藥典》2020年版自2020年12月30日實施以來，至今已過一年，中藥制劑、化學藥品的微生物計數、控制菌檢查等基本沿用了2015年版的有關規定。微生物檢驗工作者要積極參加中國食品藥品檢定研究院組織的現行版藥典微生物限度檢查的線上線下培訓班，還應加強自學，提升自身檢驗技術，為保障藥品質量安全把好關。

2.2 增加檢驗工具書的配備

有些問題在《中國藥品標準操作規范》中描述較為詳細，比如微生物計數中的供試液制備有舉例說明，但企業尤其是小型藥品生產企業生產品種較少，涉及的檢驗項目少，對工具書的投入可能欠缺。企業可向當地藥檢機構借閱有關資料，各級藥檢機構也應主動為轄區內藥品生產企業提供技術支持和技術咨詢，共同致力于藥品質量的提高。

2.3 準確把握微生物限度標準

對于具體品種的微生物限度標準，應結合制劑通則項下和通則1107規定確定。如橡膠膏劑在通則1107中有需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數限度要求，但在通則橡膠膏劑項下則只有對控制菌的要求：不得檢出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。對于方法適用性資料中沒有明確標準要求但檢出結果超出標準規定的，在沒有公開處方來源及制法的前提下，藥品檢驗機構一定要和藥品生產企業聯系確認是否含有神曲等發酵原料、是否含有未經提取的動植物來源的成分及礦物質等特殊情況，防止漏檢項目、標準要求出現錯誤等檢驗差錯事故的發生。建議藥品生產企業在處方及制法保密的前提下，方法適用性資料中除了記錄試驗結果外，還應明確標注限度要求。

2.4 方法適用性試驗周期

企業一般將周期確定為5年，與藥典換版周期一致。541份資料中，中成藥517份，占95.6%。中藥制劑成分復雜，當處方來源中的藥材產地、炮制方法、貯藏環境等發生變化時，企業應重新開展方法適用性試驗[15]。541份資料中，均為藥典換版同步進行的方法適用性試驗，未見因其他因素重新開展方法適用性試驗的資料。

2.5 嚴格規范術語使用

自2015年版藥典起，僅收錄了平皿法、薄膜過濾法和MPN法，沒有常規法、稀釋法、中和法等描述，常規法一般指使用低稀釋級（1∶10供試液）進行檢驗，稀釋法指采用增加稀釋液或培養基體積的方法來去除樣品抑菌活性，但業內人士不會引起誤解。筆者建議使用現行版藥典收錄的方法術語進行描述，對這些不規范卻大家又耳熟能詳的“前術語”繼續使用是否合適，值得商榷。

3 小結

微生物計數法方法適用性中主要問題存在于稀釋液的使用、試驗菌液的使用、試驗菌株的回收試驗、抑菌活性的去除、對照試驗的開展等方面；控制菌檢查法方法適用性中主要問題存在于加菌方式以及耐膽鹽革蘭陰性菌檢查等方面。相關從業人員在開展方法適用性試驗時應讀懂學透《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1105、1106、1107的具體要求，結合所在實驗室實際情況，制定準確可行的操作規程，從“人、機、料、法、環、測”等6個方面達到有效控制各試驗環節，切實掌握科學完整準確的試驗方法，避免出現文中所述各類常見問題。

從資料審核中可以發現，大部分企業的方法適用性資料比較完整規范，有缺陷的資料占比較小。結合文中發現的問題，各藥品生產企業應不斷完善和提高開展方法適用性試驗的能力，保證試驗結果的準確性和可靠性，為人民群眾用藥安全有效提供保障。