李艷艷,白繼超,徐中清
(北京市大興區生物醫藥基地中國獸藥藥品監察所 102699)
雞球蟲病是一種特殊的雞腸道寄生蟲。選擇合適的球蟲繁殖培養基及其添加成分是球蟲體外培養的關鍵,也是建立球蟲體外篩選模型不可或缺的一步[1]。本文報道了不同培養基的重復比較以及在培養基中添加的成分對E.tenella的影響。體外細胞培養在球蟲病的分子免疫學、生物化學、細胞培養及耐藥性研究中起著重要作用,還可以加強禽類球蟲病預防,促進球蟲疫苗的發展[2]。在體外培養過程中,影響球蟲生長的因素包括環境溫度、細胞系的選擇和培養基。本研究比較了不同基礎培養基及其添加成分對雞球蟲E.tenella細胞培養的影響。
影響球蟲病體外培養成功的因素很多,其中培養基及其組成是影響球蟲病體外培養成功的重要因素之一[3]。最初的實驗主要集中在培養基的選擇上,然后逐漸對其有效成分進行了研究。EAGLESMEM和EAG'LESBME是最早被認為是營養培養基的培養基,含有水解乳蛋白和培養基19的HBSS也被用來培養E.etenlla。此后,rpmi1640介質得到了廣泛的應用[4]。然而,經過反復比較,我們發現MEM-A培養的E.tenella能顯著增加第二代分裂體和卵囊的數量。通過對兩種培養基成分的比較,發現a-mem中含有核糖核苷和脫氧核糖核苷,因此它的含量是E.tenella體外培養的關鍵因素之一。
2.1 子孢子純化
2.1.1 卵囊破壁
卵囊計數后,3000r/min,離心10min去除上清液,將沉淀物加入組織研磨機,在冰水中研磨。連續顯微鏡觀察,直到90%左右的球蟲病卵囊破裂,3000r/min,離心10min,丟棄上清液,4°備用。
2.1.2 子孢子脫囊
將含孢子囊的溶液分別加入A、B、C、D四種不同劑型的解囊溶液中,40℃水浴,純化消毒后,在解囊過程中消化時進行顯微鏡檢查。在顯微鏡下連續觀察脫囊狀態,持續半小時后停止。
2.1.3 子孢子的純化
制備20%、30%、65%、70%、75%和80%蔗糖溶液。在不同的離心管中加入65%、70%、75%和80%的蔗糖,然后用滴管依次向離心管中加入20%、30%的蔗糖溶液并進行標記。并且與含有帶子孢子的脫囊液混合,1500r/min,離心十分鐘,在兩種濃度溶液之間會顯示出白色條帶,將其吸取。用3000r/min的pbs溶液離心洗滌蔗糖溶液15min,根據解凍后純化孢子數與孢子數的比值計算回收率。
2.1.4 子孢子活性檢測
用不同的脫囊液用相同的方法純化子孢子后,用PBS將純化的孢子定量至2mL,吸收1滴小孢子液,并向玻片中加入2滴伊紅染料。2min后顯微鏡下觀察,染色計數后算出未染色的子孢子數在總子孢子數的占比,并記錄存活率。
2.2 雞胚成纖維細胞的制備
2.2.1 取9~11日齡雞胚,取出雞胚體,置于滅菌板中,取出內臟、頭部和四肢,洗滌PBS兩次。
2.2.2 將胚胎轉移到小燒杯中,完全切割,沖洗PBS兩次,然后將PBS吸入。
2.2.3 加入2mL 0.25%胰蛋白酶,在37℃下消化約15min。
2.2.4 輕輕吸取胰蛋白酶,沖洗PBS兩次,吸取PBS。
2.2.5加入少量生長液,輕輕吹氣過濾上清液;吹開其余的組織,并用生長液過濾。
2.2.6 將濾過的細胞懸液稀釋10倍,計數,調整細胞密度至40~60萬/mL。
2.2.7 加50mL細胞培養瓶培養。37℃培養,24~28h形成單層致密層。
2.3 雞腎細胞原代培養
2.3.1 在無菌環境中采集10d齡左右的雛雞腎臟。
2.3.2 將腎臟轉移到一個小燒杯中,切成小塊,洗滌兩次,然后吸取PBS。
2.3.3 加入5倍體積的0.25%胰蛋白酶,在37℃條件下消化約半小時。
2.3.4 加入少量生長液,輕輕吹氣過濾上清液;其余的組織被吹走,并用生長液過濾。
2.3.5將濾過的細胞懸液稀釋10倍,計數,調整細胞密度至40~60萬/mL。
2.3.6加50mL細胞培養瓶培養。
2.3.7 37℃培養,24~28h形成單層致密層。
2.4 傳代細胞系的細胞培養
2.4.1冷凍保存細胞的復蘇:在液氮中冷凍保存的MDBK細胞在37℃的水浴中在1min內迅速溶解。加入細胞瓶,加入含有血清和雙抗體的培養基,37℃,5% CO2,12h,倒入培養基,用新的含有雙抗體的培養基代替。
2.4.2細胞傳代:細胞瓶底涂布80%后,倒入培養基,D-Hank洗滌3次,加入少量胰蛋白酶,37℃,5% CO2消化3min,顯微鏡下細胞呈圓形后,加入培養基,吹干均勻,然后放入37℃,5% CO2培養。
2.5用rp mL 64測定不同血清的培養效果比較了雞血清和胎牛血清中鋁的含量。實驗分為A組雞血清組;B組胎牛血清組:用10個培養細胞制備胎牛血清,用5%胎牛血清接種種子。重復測試三次。
2.6胰島素最佳濃度試驗
試驗分為3組0.05、0.05、0.5g/mL培養基,基礎培養基為rpml640,細胞培養過程中加入10%小牛血清和5%雞血清,觀察E.tenella培養的效果。觀察不同濃度胰島素對E.tenella的影響。
2.7 介質成分對比試驗
以rpml640和a-mem為基礎培養基,比較不同基礎培養基的效果。重復測試三次。
2.8 效果判定指標
2.8.1 細胞生長:接種前、接種后2、4、6d倒置顯微鏡觀察細胞覆蓋面積10次,每組30個視野。
2.8.2 第二代血吸蟲計數:接種后10x4.5d倒置顯微鏡下計算第二代血吸蟲計數,每組30個視野。
2.8.3 卵囊數:取種子8d后,用0.05%d ta和0.3%胰蛋白酶處理消化細胞層。收集卵囊,用mcmas和r型計算器計算卵囊數。
以a-mem和RPMl640為基本培養基,對雞腎原代細胞進行培養。它的細胞覆蓋率見表1。從表1可以看出,A-MEM組在接種前和接種后2、4和6d的細胞覆蓋率均高于RPML640 組。
表1 兩種培養基對雞腎原代細胞生長的影響
第2代淋巴細胞接種后4.5d計數,8d收集卵囊數。結果見表2。如表2所示,平均每場第二代淋巴瘤數為N和17.5,卵囊數為65和91個/孔,高于A-MEM。
表2 兩種培養基對第二代血吸蟲和卵囊形成的影響
入侵率(%) 肌苷 水解乳蛋白 葉酸 全培養基 空白PH=7 14.54 13.43 9.61 9.23 3.51 PH=7.6 13.51 11.21 9.65 9.45 2.41
在E.tenella艾美耳球菌的體外培養技術中,MDBK是一個很好的上皮細胞系[5],但布氏E.tenella在MDBK細胞中發育不好[6-7],微小隱孢子蟲在MDBK中不發育。BHK廣泛應用于AMEL培養,被認為優于雞腎和火雞腎細胞。楚德軍認為BHK、MDBK和RK-13適合球蟲的生長,更適合E.tenella艾美球蟲的體外培養[8]。有證據表明,mdbk和hep2細胞更適合弓形蟲、rk13、bhk、rdavero和cer的體外培養[9]。HCT-8細胞被認為是最適合體外培養微小隱孢子蟲的細胞,但有些人在微小隱孢子蟲侵入后比MDCK、MA-104、HEP-2和VERO細胞更容易受到感染,其中微小隱孢子蟲不能有性繁殖,VERO細胞侵入性最小,不能形成滋養層[10]。結果還表明,小隱孢子蟲體外培養的絨毛細胞獲得的卵囊更具感染性,更適合小隱孢子蟲體外培養[11]。溫度對球蟲的生長也有很大的影響。以LMH、BHK、MDBK、HCT-8、VERO、CRFK、PK-15、RK-13和IEC-6為載體時,41℃更適合球蟲生長,以CaCO-2和MDCK為載體時,37℃更適合球蟲生長。更適合球蟲生長。因為球蟲自然宿主的體溫是41℃。研究表明,弓形蟲在37℃和室溫下的體外培養對弓形蟲感染率有顯著影響,29℃的體外培養可產生較多的速殖子。但是溫度對葡萄孢菌體外培養的影響不大,在細胞類型中起著重要作用。然而,艾美耳球菌體外培養細胞毒的研究卻未見報道。實驗結果表明,37℃下強毒艾美球蟲的侵襲時間明顯長于41℃,這可能是由于體溫為41℃所致。雖然37℃更適合細胞生長,但如果需要進行毒力艾美耳球菌的體外培養試驗,則認為孢子侵染和隨后的培養過程中的溫度控制更接近自然狀態。
培養基也是影響球蟲生長的重要因素。結果表明,5%水解乳蛋白的MEM細胞培養基是一種適合E.tenella艾美耳球菌體外培養的培養體系。將腺苷或肌苷加入THP-1培養72h的微小隱孢子蟲培養基中,可以增加卵囊的產生,而在MDBK細胞中添加肌苷24h也可以增加卵囊的產生。在培養基中加入葉酸可提高球蟲的表達。此外,ph值也會影響球蟲的產量。一般認為pH7.4對球蟲生長最有利。血清含量對弓狀細胞增殖有明顯影響。實驗結果表明,肌苷能提高孢子的侵染率,且比其他組分更有效。
血清是球蟲培養不可缺少的成分。經過長時間的探索,我們發現雞血清在培養嫩鏈球菌中起著重要作用。與牛血清和豬血清相比,雞血清能促進雞腎細胞的生長和有絲分裂原的形成。實驗表明,雞血清有利于卵泡的形成,其作用機制可能與雞血清的同源性有關。
維生素曾經被認為是球蟲培養的重要成分。蘇丁澤陽, 高陽[12]證明,生物素、葉酸、肌醇、鹽酸硫胺素、維生素E、維生素K、對氨基苯甲酸、維生素BX和維生素E有利于E.tenella第二代分裂階段和卵泡形成。然而,王黎霞等[13]發現這些維生素不是E.tenella生長所必需的E.物質。氨基酸中的精氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸和色氨酸被認為是e培養物,E.tenella的有用物質由于缺乏在培養基中,對培養結果有很大的影響。蔣保余[14]證實了這一點。盡管以前對培養基的組成進行了大量的研究,但E.tenella的栽培工作未能突破,卵囊產量沒有提高,檢測結果不穩定,影響細胞培養的正常化。為了解決卵囊產生的問題,我們研究了胰島素對E.tenella細胞的影響。E.tenella細胞的培養表明,它不僅能促進雞原代腎細胞的生長,而且能促進第二代E.tenella淋巴細胞的生長和增加卵泡數量。以前的培養E.E.tenella的結果是每平方厘米只有200個卵囊。結果表明,在胰島素培養基中加入0.05μg/mL,培養基中卵泡數穩定且顯著增加。電流實驗結果達到700個單位。生理學研究表明,胰島素在調節糖、脂肪和蛋白質代謝中起著非常復雜的作用。胰島素調節的一般方向是促進合成代謝和抑制合成代謝。結果表明,胰島素對雞腎細胞和E.tenella芽孢桿菌的作用相似,但其作用機制有待進一步研究。
雞腎原代細胞和對蝦腎原代細胞的培養,細胞生長迅速,活力旺盛,第二代血吸蟲數量高于小牛血清。然而,細胞生長迅速,細胞團消失,如果繼續使用胎牛血清,最終培養的卵囊數量減少,這與小跑團的減少有關。在E.tenella細胞培養中,建議用小牛血清和雞血清提高卵囊產量。
整體而言,作者認為在體外培養過程中,當vero細胞在40℃條件下使用時,在培養基中加入葉酸更有利于實驗的準確性。