不同基礎培養基及其添加成分對雞球蟲E.tenella細胞培養的影響研究

李艷艷，白繼超，徐中清

（北京市大興區生物醫藥基地中國獸藥藥品監察所 102699）

1 概述

雞球蟲病是一種特殊的雞腸道寄生蟲。選擇合適的球蟲繁殖培養基及其添加成分是球蟲體外培養的關鍵，也是建立球蟲體外篩選模型不可或缺的一步[1]。本文報道了不同培養基的重復比較以及在培養基中添加的成分對E.tenella的影響。體外細胞培養在球蟲病的分子免疫學、生物化學、細胞培養及耐藥性研究中起著重要作用，還可以加強禽類球蟲病預防，促進球蟲疫苗的發展[2]。在體外培養過程中，影響球蟲生長的因素包括環境溫度、細胞系的選擇和培養基。本研究比較了不同基礎培養基及其添加成分對雞球蟲E.tenella細胞培養的影響。

影響球蟲病體外培養成功的因素很多，其中培養基及其組成是影響球蟲病體外培養成功的重要因素之一[3]。最初的實驗主要集中在培養基的選擇上，然后逐漸對其有效成分進行了研究。EAGLESMEM和EAG'LESBME是最早被認為是營養培養基的培養基，含有水解乳蛋白和培養基19的HBSS也被用來培養E.etenlla。此后，rpmi1640介質得到了廣泛的應用[4]。然而，經過反復比較，我們發現MEM-A培養的E.tenella能顯著增加第二代分裂體和卵囊的數量。通過對兩種培養基成分的比較，發現a-mem中含有核糖核苷和脫氧核糖核苷，因此它的含量是E.tenella體外培養的關鍵因素之一。

2 方法

2.1 子孢子純化

2.1.1 卵囊破壁

卵囊計數后，3000r/min，離心10min去除上清液，將沉淀物加入組織研磨機，在冰水中研磨。連續顯微鏡觀察，直到90%左右的球蟲病卵囊破裂，3000r/min，離心10min，丟棄上清液，4°備用。

2.1.2 子孢子脫囊

將含孢子囊的溶液分別加入A、B、C、D四種不同劑型的解囊溶液中，40℃水浴，純化消毒后，在解囊過程中消化時進行顯微鏡檢查。在顯微鏡下連續觀察脫囊狀態，持續半小時后停止。

2.1.3 子孢子的純化

制備20%、30%、65%、70%、75%和80%蔗糖溶液。在不同的離心管中加入65%、70%、75%和80%的蔗糖，然后用滴管依次向離心管中加入20%、30%的蔗糖溶液并進行標記。并且與含有帶子孢子的脫囊液混合，1500r/min，離心十分鐘，在兩種濃度溶液之間會顯示出白色條帶，將其吸取。用3000r/min的pbs溶液離心洗滌蔗糖溶液15min，根據解凍后純化孢子數與孢子數的比值計算回收率。

2.1.4 子孢子活性檢測

用不同的脫囊液用相同的方法純化子孢子后，用PBS將純化的孢子定量至2mL，吸收1滴小孢子液，并向玻片中加入2滴伊紅染料。2min后顯微鏡下觀察，染色計數后算出未染色的子孢子數在總子孢子數的占比，并記錄存活率。

2.2 雞胚成纖維細胞的制備

2.2.1 取9～11日齡雞胚，取出雞胚體，置于滅菌板中，取出內臟、頭部和四肢，洗滌PBS兩次。

2.2.2 將胚胎轉移到小燒杯中，完全切割，沖洗PBS兩次，然后將PBS吸入。

2.2.3 加入2mL 0.25%胰蛋白酶，在37℃下消化約15min。

2.2.4 輕輕吸取胰蛋白酶，沖洗PBS兩次，吸取PBS。

2.2.5加入少量生長液，輕輕吹氣過濾上清液；吹開其余的組織，并用生長液過濾。

2.2.6 將濾過的細胞懸液稀釋10倍，計數，調整細胞密度至40～60萬/mL。

2.2.7 加50mL細胞培養瓶培養。37℃培養，24～28h形成單層致密層。

2.3 雞腎細胞原代培養

2.3.1 在無菌環境中采集10d齡左右的雛雞腎臟。

2.3.2 將腎臟轉移到一個小燒杯中，切成小塊，洗滌兩次，然后吸取PBS。

2.3.3 加入5倍體積的0.25%胰蛋白酶，在37℃條件下消化約半小時。

2.3.4 加入少量生長液，輕輕吹氣過濾上清液；其余的組織被吹走，并用生長液過濾。

2.3.5將濾過的細胞懸液稀釋10倍，計數，調整細胞密度至40～60萬/mL。

2.3.6加50mL細胞培養瓶培養。

2.3.7 37℃培養，24～28h形成單層致密層。

2.4 傳代細胞系的細胞培養

2.4.1冷凍保存細胞的復蘇：在液氮中冷凍保存的MDBK細胞在37℃的水浴中在1min內迅速溶解。加入細胞瓶，加入含有血清和雙抗體的培養基，37℃，5% CO2，12h，倒入培養基，用新的含有雙抗體的培養基代替。

2.4.2細胞傳代：細胞瓶底涂布80%后，倒入培養基，D-Hank洗滌3次，加入少量胰蛋白酶，37℃，5% CO2消化3min，顯微鏡下細胞呈圓形后，加入培養基，吹干均勻，然后放入37℃，5% CO2培養。

2.5用rp mL 64測定不同血清的培養效果比較了雞血清和胎牛血清中鋁的含量。實驗分為A組雞血清組；B組胎牛血清組：用10個培養細胞制備胎牛血清，用5%胎牛血清接種種子。重復測試三次。

2.6胰島素最佳濃度試驗

試驗分為3組0.05、0.05、0.5g/mL培養基，基礎培養基為rpml640，細胞培養過程中加入10%小牛血清和5%雞血清，觀察E.tenella培養的效果。觀察不同濃度胰島素對E.tenella的影響。

2.7 介質成分對比試驗

以rpml640和a-mem為基礎培養基，比較不同基礎培養基的效果。重復測試三次。

2.8 效果判定指標

2.8.1 細胞生長：接種前、接種后2、4、6d倒置顯微鏡觀察細胞覆蓋面積10次，每組30個視野。

2.8.2 第二代血吸蟲計數：接種后10x4.5d倒置顯微鏡下計算第二代血吸蟲計數，每組30個視野。

2.8.3 卵囊數：取種子8d后，用0.05%d ta和0.3%胰蛋白酶處理消化細胞層。收集卵囊，用mcmas和r型計算器計算卵囊數。

3 結果

3.1 不同基質中細胞生長的比較

以a-mem和RPMl640為基本培養基，對雞腎原代細胞進行培養。它的細胞覆蓋率見表1。從表1可以看出，A-MEM組在接種前和接種后2、4和6d的細胞覆蓋率均高于RPML640 組。

表1 兩種培養基對雞腎原代細胞生長的影響

3.2 不同基礎培養基對Etenla卵囊數的影響

第2代淋巴細胞接種后4.5d計數，8d收集卵囊數。結果見表2。如表2所示，平均每場第二代淋巴瘤數為N和17.5，卵囊數為65和91個/孔，高于A-MEM。

表2 兩種培養基對第二代血吸蟲和卵囊形成的影響

3.3 培養基中添加不同成分的入侵率

入侵率（%） 肌苷 水解乳蛋白 葉酸 全培養基 空白PH=7 14.54 13.43 9.61 9.23 3.51 PH=7.6 13.51 11.21 9.65 9.45 2.41

4 討論

在E.tenella艾美耳球菌的體外培養技術中，MDBK是一個很好的上皮細胞系[5]，但布氏E.tenella在MDBK細胞中發育不好[6-7]，微小隱孢子蟲在MDBK中不發育。BHK廣泛應用于AMEL培養，被認為優于雞腎和火雞腎細胞。楚德軍認為BHK、MDBK和RK-13適合球蟲的生長，更適合E.tenella艾美球蟲的體外培養[8]。有證據表明，mdbk和hep2細胞更適合弓形蟲、rk13、bhk、rdavero和cer的體外培養[9]。HCT-8細胞被認為是最適合體外培養微小隱孢子蟲的細胞，但有些人在微小隱孢子蟲侵入后比MDCK、MA-104、HEP-2和VERO細胞更容易受到感染，其中微小隱孢子蟲不能有性繁殖，VERO細胞侵入性最小，不能形成滋養層[10]。結果還表明，小隱孢子蟲體外培養的絨毛細胞獲得的卵囊更具感染性，更適合小隱孢子蟲體外培養[11]。溫度對球蟲的生長也有很大的影響。以LMH、BHK、MDBK、HCT-8、VERO、CRFK、PK-15、RK-13和IEC-6為載體時，41℃更適合球蟲生長，以CaCO-2和MDCK為載體時，37℃更適合球蟲生長。更適合球蟲生長。因為球蟲自然宿主的體溫是41℃。研究表明，弓形蟲在37℃和室溫下的體外培養對弓形蟲感染率有顯著影響，29℃的體外培養可產生較多的速殖子。但是溫度對葡萄孢菌體外培養的影響不大，在細胞類型中起著重要作用。然而，艾美耳球菌體外培養細胞毒的研究卻未見報道。實驗結果表明，37℃下強毒艾美球蟲的侵襲時間明顯長于41℃，這可能是由于體溫為41℃所致。雖然37℃更適合細胞生長，但如果需要進行毒力艾美耳球菌的體外培養試驗，則認為孢子侵染和隨后的培養過程中的溫度控制更接近自然狀態。

培養基也是影響球蟲生長的重要因素。結果表明，5%水解乳蛋白的MEM細胞培養基是一種適合E.tenella艾美耳球菌體外培養的培養體系。將腺苷或肌苷加入THP-1培養72h的微小隱孢子蟲培養基中，可以增加卵囊的產生，而在MDBK細胞中添加肌苷24h也可以增加卵囊的產生。在培養基中加入葉酸可提高球蟲的表達。此外，ph值也會影響球蟲的產量。一般認為pH7.4對球蟲生長最有利。血清含量對弓狀細胞增殖有明顯影響。實驗結果表明，肌苷能提高孢子的侵染率，且比其他組分更有效。

血清是球蟲培養不可缺少的成分。經過長時間的探索，我們發現雞血清在培養嫩鏈球菌中起著重要作用。與牛血清和豬血清相比，雞血清能促進雞腎細胞的生長和有絲分裂原的形成。實驗表明，雞血清有利于卵泡的形成，其作用機制可能與雞血清的同源性有關。

維生素曾經被認為是球蟲培養的重要成分。蘇丁澤陽， 高陽[12]證明，生物素、葉酸、肌醇、鹽酸硫胺素、維生素E、維生素K、對氨基苯甲酸、維生素BX和維生素E有利于E.tenella第二代分裂階段和卵泡形成。然而，王黎霞等[13]發現這些維生素不是E.tenella生長所必需的E.物質。氨基酸中的精氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸和色氨酸被認為是e培養物，E.tenella的有用物質由于缺乏在培養基中，對培養結果有很大的影響。蔣保余[14]證實了這一點。盡管以前對培養基的組成進行了大量的研究，但E.tenella的栽培工作未能突破，卵囊產量沒有提高，檢測結果不穩定，影響細胞培養的正常化。為了解決卵囊產生的問題，我們研究了胰島素對E.tenella細胞的影響。E.tenella細胞的培養表明，它不僅能促進雞原代腎細胞的生長，而且能促進第二代E.tenella淋巴細胞的生長和增加卵泡數量。以前的培養E.E.tenella的結果是每平方厘米只有200個卵囊。結果表明，在胰島素培養基中加入0.05μg/mL，培養基中卵泡數穩定且顯著增加。電流實驗結果達到700個單位。生理學研究表明，胰島素在調節糖、脂肪和蛋白質代謝中起著非常復雜的作用。胰島素調節的一般方向是促進合成代謝和抑制合成代謝。結果表明，胰島素對雞腎細胞和E.tenella芽孢桿菌的作用相似，但其作用機制有待進一步研究。

雞腎原代細胞和對蝦腎原代細胞的培養，細胞生長迅速，活力旺盛，第二代血吸蟲數量高于小牛血清。然而，細胞生長迅速，細胞團消失，如果繼續使用胎牛血清，最終培養的卵囊數量減少，這與小跑團的減少有關。在E.tenella細胞培養中，建議用小牛血清和雞血清提高卵囊產量。

整體而言，作者認為在體外培養過程中，當vero細胞在40℃條件下使用時，在培養基中加入葉酸更有利于實驗的準確性。