基于代謝組學結合GC-MS對薰衣草水提液保護心肌代謝產物提取方法的比較研究

陳和平 李波 姜黎 曾洪燕 袁呈山

【摘要】探討用代謝組學結合GC-MS法對薰衣草水提液保護心肌代謝產物提取方法的比較研究。通過比對三種不同淬滅方法：60%甲醇/H2O，80%甲醇/H2O，以及80%甲醇/甘油，并以細胞內腺苷酸濃度（ATP、ADP和AMP）為標準來評估淬滅效率；采用氣質聯用（GC-MS）對沸乙醇提取法（BE），新式提取法（NE），凍融甲醇提取法（FTM）代謝成分的多少進行比較分析。對細胞外代謝物比較顯示，NE法可以提取出更多數量的細胞外代謝物。淬滅方法評估結果顯示，80%甲醇/甘油的淬滅方法中ATP泄漏量最小。薰衣草水提液濃度及其對心肌功能的保護作用結果顯示，60mg/L的薰衣草提取液（LAD）時流出液中CK和LDH的水平顯著降低，對心臟有最佳保護作用。大鼠血液成分分析結果顯示，經LAD處理后的血液成分在RT（實時12.71min）處有明顯不同，C17H23NO2豐度最高。

【關鍵詞】薰衣草水提液；心肌保護作用；淬滅提取；GC-MS；ATP；回收率

A comparative study on the extraction of cardioprotective metabolites from Lavandula augustifolia aqueous extracts based on metabolomics combined with GC-MS

Chen Heping1， Li Bo1， Jiang Li1， Zeng Hongyan2， Yuan Chengshan3

1.The 3rd Afficiated Hospital of Chengdu Medical College（Pidu District Peoples Hospital）Chengdu， Sichuan 611730， China；2.Chengdu Pidu District Hospital of TCM， Chengdu， Sichuan 611730， China；3.State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry， Lanzhou University， Lanzhou Gansu 730000， China

【Abstract】 To investigate the comparative study on the extraction of cardioprotective metabolites from the Lavandula augustifolia aqueous extract by metabolomics combined with GC-MS. The quenching efficiency was evaluated by comparing three different quenching methods： 60% methanol/H2O， 80% methanol/H2O， and 80% methanol/glycerol， and using intracellular adenosine concentrations （ATP， ADP， and AMP） as the standard. The results were compared with those of the extracellular metabolites. A comparison of the extracellular metabolites showed that the NE method could extract a higher amount of extracellular metabolites. The evaluation of quenching methods showed that the quenching method with 80% methanol/glycerol had the least amount of ATP leakage. The results of Lavandula augustifolia aqueous extract concentration and its protective effect on myocardial function showed that the levels of CK and LDH in the effluent were significantly reduced at 60 mg/ L of Lavandula augustifolia extract （LAD）， which had the best protective effect on the heart. The results of blood composition analysis in rats showed that the blood composition after LAD treatment was significantly different at RT （12.71 min in real time） with the highest abundance of C17H23NO2.

【Key Words】Lavandula augustifolia； Quenching； extraction； GC-MS； ATP； Recovery

薰衣草作為我國民族藥物，主要制成揮發性制劑和傳統藥物，用于腹脹、頭暈、頭痛、心悸、氣短和關節痛等癥狀的治療[1]。早期研究表明，不僅薰衣草精油對大鼠胸主動脈環具有松弛作用，對冠狀動脈結扎所致的心肌缺血或心律不齊具有明顯保護作用，而且薰衣草水提液中含有保護心臟的有效成分[2]，近年來，隨著代謝物譜分析技術的發展，代謝組學平臺（綜合性代謝物分析）在功能基因組學和系統生物學等領域發揮著越來越重要的作用[3-4]。但目前用于對薰衣草水提液保護心肌代謝產物的研究較少。

1 儀器與試藥

氣質聯用儀GC-MS-QP2010，日本島津公司生產，薰衣草由寧波芳香碼頭生物科技有限公司提供，肌酸激酶（CK）試劑盒和乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒均購自中國南京生物工程研究所，2， 3， 5-三苯基氯化四氮唑（TTC）和均勻藍均購自Sigma-Aldrich公司。

健康雄性大鼠（Wistar， SPF級），體重250～300g，由蘭州大學實驗動物中心提供。

2 方法與結果

2.1 薰衣草水提液的制備

將100 g薰衣草花放入圓底燒瓶中，加入300 mL蒸餾水浸泡30min，加入200 mL蒸餾水回流1h，過濾收集濾液，重復1次。之后將200 mL蒸餾水再加入回流混合液中0.5h，經三層過濾器收獲濾液， 55 ℃真空濃縮，制備薰衣草水提液（LAD）。

2.2 LAD濃度確定

結扎左冠狀動脈前降支可引起左心室心肌組織發生缺血再灌注損傷，以左心室發展壓（LVDP）為標準確定最有效的薰衣草水提液（LAD）濃度。圖1表明當灌注治療后LAD低于60 μg/mL時，LAD的保護作用隨濃度的增加而增加。30min后，I/R損傷后LVDP的恢復率在60 μg/mL濃度下達到最大值。當LAD濃度高于60μg/mL（從70μg/mL到100μg/ mL）時，I/R后LVDP的恢復率下降，這表明高濃度LAD對心臟有副作用，因此60 μg/mL的LAD對心臟有最佳保護作用。

2.3 薰衣草水提液對心肌功能的保護作用

測定薰衣草水提液處理后的大鼠血漿CK和LDH水平評估LAD的心肌保護作用。表1，表2結果表明，I/R組中流出液中CK和LDH的水平顯著升高，而經60μg/mL LAD處理后（實驗組），流出液中CK和LDH的水平顯著降低。這表明60μg/mL LAD對心肌細胞損傷具有保護作用。

2.4 以ATP為標準的淬滅方法評估

淬滅方法參考早期研究報道。在-80℃下用80%甲醇/甘油淬滅血液。淬滅后的樣品經7000g，4℃離心5min收集血細胞。將血細胞在4℃下用0.9%生理鹽水洗滌2次。不同樣品采用相同的淬滅步驟，并用不同的方法進行提取，渦旋混勻后以10000g， -20℃離心5min。根據早期研究，可通過測量ATP的濃度對優化方法的淬滅效率進行評估。采用螢火蟲熒光素酶催化的生物化學發光型ATP測定試劑盒，對ATP滲漏進行分析，評估淬滅步驟的穩定性（敏感測定法，Biaffin GmbH & Co KG，德國）。圖2表明，在80%甲醇/甘油的淬滅方法中，培養基上清液中可測量的ATP濃度約為85 μM ATP，這是ATP泄漏量最少的實驗組，誤差線表明所得結果可靠性較高。

采用細胞內腺苷酸濃度（ATP、ADP、AMP）評估淬滅效率，結果見圖3，細胞內代謝物的三種淬滅方法獲得的結果與上清液中ATP的結果一致。在所有提取方法中，若采用80%甲醇/甘油進行淬滅，則細胞內腺苷酸濃度均較高，誤差線表明所得結果可靠性較高。采用80%甲醇/甘油的淬滅方法對ATP和ADP的測定無顯著差異。對三種不同樣品進行淬滅，結果表明，所有樣品中AMP的濃度幾乎相等。綜上所述，80%甲醇/甘油溶液可用作優化后的淬滅和提取方法。

2.5 提取方法對PCA結果的影響

PCA作為一種無監督方法，已廣泛用于比較不同提取方法中樣品的代謝譜（Winder等，2008）。PCA結果表明，R2X = 0.796，Q2 = 0.446，其中t[2]的貢獻僅為8.87%，這些結果表明這三種提取方法均有良好的重現性。此外，每種提取方法均明顯產生了不同的代謝物譜圖（圖4A）。對PCA負載圖（圖4B）進一步評估表明，天冬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、棕櫚酸酯、磷酸鹽是BE的重要代謝產物；AMP、纈氨酸、乳酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、焦谷氨酸是FTM的重要代謝物；亮氨酸和3-磷酸甘油酸酯是NE的重要代謝產物。

2.6 基于OPLS-DS模型的提取方法評估

OPLS-DA作為一種評估驗證方法，在本研究中用于代謝組學分析，做為PCA結果的交叉驗證和補充。OPLS-DA的Q2表示可預測性和質量，R2表示X和Y的變異性。OPLS-DA的得分圖為：R2（X）= 0.849，R2（Y）= 0.997和Q2 = 0.869，表明不同提取方法差異性顯著（圖5A）。對200個隨機排列測試（圖5B）通過原始R2和Q2的值高于排列值來驗證試驗結果。這些結果表明本試驗結果具有較高的可信度。

3 討論

以左心室發展壓（LVDP）為標準確定最有效的LAD濃度時，當灌注治療后LAD低于60μg/mL時，LAD的保護作用隨濃度的增加而增加。30min后，I/R損傷后LVDP的恢復率在60 μg/mL濃度下達到最大值。當LAD濃度高于60μg/mL（從70 μg/mL到100 μg/mL）時，I/R后LVDP的恢復率下降，這表明高濃度LAD對心臟有副作用，因此60 mg/L的LAD對心臟有最佳保護作用。

PCA結果表明三種提取方法均有良好的重現性。且每種提取方法均明顯產生了不同的代謝物譜圖，早期研究指出，不同提取方法對某些代謝產物有較高的提取率，不同的提取方法在對特定代謝產物提取中具有各自的特征。因此，應根據不同實驗的目的選擇合適的提取方法。

參考文獻

[1] 吳霞，劉凈，于志斌，等.薰衣草中黃酮類化學成分的研究[J].中國中藥雜志，2007（9）：821-823.

[2] 李淑芳，劉繼紅，尹海燕，等.基于超高效液相色譜-高分辨質譜的非靶向代謝組學技術結合化學計量學對信陽茶樹品種差異的研究[J].分析測試學報，2022， 41（2）：149-155.

[3] 楊華，徐金柱，趙丹陽，等.基于GC-MS的綠僵菌代謝組學前處理技術研究[J].華南農業大學學報，2021， 42（5）：69-79.

[4] 王方杰，王婷，羅芳梅，等.基于GC-MS代謝組學技術的杜仲抗骨質疏松作用研究[J].中國中藥雜志，2020， 45（22）：5555-5560.