基于疾病基因表達譜和藥物轉錄組的抗高尿酸血癥藥物“重定位”

逄成章 劉文彬 金小寶

1廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院（廣州 510006）；2廣東省生物活性藥物研究重點實驗室（廣州 511436）

高尿酸血癥（HUA）是一種由于嘌呤代謝紊亂所引起的血尿酸濃度超出標準范圍的慢性代謝性疾病。研究表明，HUA是引發痛風的重要因素，也可引起冠心?。?］、高血壓［2］、糖尿病［3］。目前 HUA的治療主要包括兩個途徑：一是促進尿酸代謝，此類藥物抑制近端腎小管對尿酸的重吸收而達到促進尿酸外排，如苯溴馬?。?］、丙磺舒［5］等；二是抑制尿酸產生，如黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇［6］。但上述藥物在使用過程皆伴隨著不同程度的副作用，因此，開發新型抗尿酸藥物具有重要意義。

新藥開發是一個耗時、昂貴和有風險的過程。近年來許多藥物被批準用于其他適應證［7］，老藥新用策略應運而生，即利用目前已知藥物并發掘活性藥物成分重新治療新的適應癥。與傳統新藥研發相比，基于現有藥物研究的優勢，可克服在新藥研發領域所投入的大量資金、規避新藥研發失敗風險和減短新藥上市周期等［8］。基因表達譜技術可以通過對比疾病前后基因表達的差異，分析疾病發病機理和潛在藥物作用靶點，建立“靶點-疾病”間的關聯。因此，本研究使用疾病基因表達譜獲得的“靶點-疾病”信息與藥物轉錄組獲得的“靶點-藥物”信息進行相關性分析，預測潛在的HUA治療藥物，并進行體外細胞實驗驗證，本研究為新型抗HUA藥物的研發提供一種新的方法和視角。

1 材料與方法

1.1 細胞株來源 人腎小管上皮細胞系HK-2，由廣東省生物活性藥物研究重點實驗室提供，保存于-80℃冰箱。

1.2 試劑與儀器 阿維菌素（Solarbio，批號：No.410BO21）；黃嘌呤氧化酶（XOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20220523）；尿酸（UA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：190706）；腺苷（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C13160852）；全自動酶標儀ELx800（美國Bio-Tek公司）。

1.3 HUA差異表達基因譜的篩選與分析 通過GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索HUA相關的轉錄組數據，篩選對HUA基因表達譜芯片。以P＜0.01，logFC≥1或logFC≤-1為篩選條件，利用Bioconductor軟件對差異表達基因進行篩選，使用edge R包繪制差異基因表達熱圖，篩選HUA差異表達基因，建立HUA特征性表達譜并利用STRING平臺（https：//www.string-db.org/）進行蛋白質-蛋白質相互關系（protein-protein interaction，PPI）分析，應用Cytoscape 3.6.1軟件對差異基因進行PPI網絡可視化分析與數據處理，篩選HUA中的核心基因。將HUA差異基因上傳至DAVID數據庫中（https：//david.ncifcrf.gov/），并導入關鍵靶點蛋白，設置P＜0.05進行篩選，對交集靶點進行KEGG（https：//www.genome.jp/kegg/）和 GO（http：//geneontology.org/）富集分析。

1.4 CMAP篩選抗HUA治療藥物 使用Connectivity Map數 據庫（https：//cmap.ihmc.us）篩 選抗HUA候選藥物，分上調基因和下調基因上傳至藥物轉錄組數據庫，進行藥物表達譜與疾病表達譜數據對比，并采用非參數Kolmogorov-Smirnov方法處理，獲得負分值藥物，表示對HUA有潛在治療作用，預測抗HUA藥物。

1.5 候選藥物與核心靶點蛋白分子對接驗證 使用PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/）下載核心基因靶點蛋白的3D結構；使用Pubchem數據庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載抗HUA活性候選藥物的3D結構；采用chem3D軟件轉換為mol2文件，選擇 Swissdock（http：//www.swissdock.ch/docking）平臺進行分子對接，下載對接文件后，采用Chimera1.14軟件進行對接文件的可視化與數據分析，記錄各對接靶點的Estimated ΔG值。

1.6 抗HUA候選藥物的細胞毒性和對HK-2HUA細胞模型的影響 取對數生長期的HK-2細胞，接種于96孔培養板。加入不同濃度的阿維菌素溶液實驗組，將細胞培養24 h和48 h后，分別加入CCK-8試劑，37℃孵育1 h后，酶標儀在450 nm處測定吸光度A值，計算細胞活力。取對數生長期的HK-2細胞，接種于96孔板培養24 h，實驗設為6個組，陽性藥物對照組加入100 μmol/L別嘌醇溶液，樣品組分別不同濃度的阿維菌素溶液，37℃培養箱孵育24 h。實驗組均用2.5 mmol/L的腺苷孵育30 h后，加入0.005 U/mL的XOD溶液孵育12 h。收集細胞上清液，酶標儀檢測細胞上清液中尿酸的含量及XOD活力。

1.7 統計學方法 實驗數據使用SPSS 20.0軟件處理，F方差檢驗后，用均數±標準差表示，實驗組間差異進行t檢驗分析，P＜0.05認為差異有統計學意義，*P＜0.05，**P＜0.01。

2 結果

2.1 HUA差異表達基因譜的篩選 GEO數據庫中，獲得基因表達數據GSE160170，并通過RMA算法對矩陣數據歸一化，經標準化處理后GSE160170芯片數據集的樣本基因表達均衡，（圖1A）。以P＜0.01，Fold change＞1.5為截斷值，Limma分析拆芯片數據的差異基因，得到下調基因810個，上調基因682個（圖1B）。

圖1 HUA差異基因分析Fig.1 HUA differential gene analysis

2.2 HUA關鍵基因的篩選 將差異基因上傳至STRING數據庫，構建了差異基因的PPI網絡（圖2A），并在此基礎上了構建了核心基因差異基因的PPI網絡，應用Cytoscape軟件對PPI網絡進行可視化分析，結果顯示，白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、趨化因子配體 2（Chemokine Ligand 2，CXCL2）、白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）等可能是HUA發病中的核心靶點（圖2B）。

圖2 HUA差異基因的PPI網絡分析Fig.2 PPI network analysis of HUA differential genes

2.3 差異表達基因GO和KEGG富集分析 將生物過程、細胞組成和分子功能顯著的差異基因繪制成柱狀圖，GO分析顯示，共同差異表達基因參與核小體組裝、白細胞趨化性、負調控細胞群增殖等生物過程；參與核小體、細胞頂端部分、細胞間交流等分子組成；涉及蛋白質異二聚化活性、趨化因子活性、C-C趨化因子結合等分子功能（圖3A）。KEGG共篩選到9條與HUA治療有關的通路，分析顯示這些差異基因主要涉及HDACS去乙?；M蛋白（HDASC deacetylate histones）、IL-7信號（IL-7）、UB特異性加工蛋白酶（UB-specific processing proteases）等信號通路（圖3B）。

圖3 HUA差異基因的GO和KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis of HUA differential genes

2.4 CMap藥物轉錄組數據庫預測HUA治療藥物 通過CMap藥物轉錄組數據庫分析：預測435個藥物對HUA差異基因進行負調控，選取負調控藥物中的前15個藥物進行文獻調研，有1個為HUA臨床使用藥物，5個為有明確的文獻報道具有降尿酸作用（表1），選擇三種評分較高的藥物阿維菌素、蓽茇酰胺和布地奈德進行體外活性實驗驗證，蓽茇酰胺與布地奈德均無抗HUA活性，阿維菌素在體外模型中具有良好的抑制尿酸生成及抑制XOD酶活性，后續對阿維菌素進行體外抗HUA細胞模型研究。

表1 CMap藥物轉錄組數據庫對抗HUA藥物的預測Tab.1 Prediction of anti-HUA drugs from the CMap drug transcriptome database

2.5 候選藥物與核心靶點蛋白分子對接驗證 受體與配體蛋白結合構象越穩定則能量越低，越可能發生相互作用。當結合能絕對值Estimated ΔG大于4.25具有一定活性，大于5.0有較好結合活性，而大于7.0則具有強結合活性。結果發現，阿維菌素與TNF、CXCL2、IL-6和IL-1β的結合能分別為-7.97、-6.25、-6.73、-7.68 kcal/mol，表明阿維菌素與核心靶點蛋白均有良好的結合活性（圖4）。

圖4 阿維菌素與HUA核心靶蛋白的分子對接Fig.4 Molecular docking of Avermectin with HUA core target protein

2.6 抗HUA候選藥物的對HK-2的細胞毒性及對HUA細胞模型的影響 在對候選藥物的抗HUA活性驗證中發現，在藥物濃度為400、200 μg/mL的阿維菌素作用下，對HK-2細胞有較大生長抑制（P＜0.000 1），而在12.5～100 μg/mL范圍內對HK-2細胞存活率影響較?。≒＞0.05，圖5A、B）。與模型組相比，陽性藥物別嘌醇（allopurinol，ALLO）組細胞上清液中尿酸濃度明顯降低（t=20.44，P＜0.000 1），表明高尿酸細胞模型建立成功，可以用來評價藥物降尿酸活性。與模型組相比，25、50和100 μg/mL阿維菌素可使HK-2細胞上清液尿酸濃度顯著下調（t=22.04～40.54，P＜0.000 1），且呈濃度依賴性（圖5C）。與模型組相比，25、50和100 μg/mL的阿維菌素都能明顯抑制HK-2細胞XOD活性（t=1.718～31.26，P＜ 0.000 1，圖5D）。

圖5 不同濃度阿維菌素對HK-2細胞活力的影響及對HUA模型上清液UA濃度與XOD活性的影響Fig.5 The effect of different concentrations of abamectin on the viability of HK-2 cells and the effect of UA concentration and XOD activity in the supernatant of HUA model

3 討論

近年來，HUA正在成為一個嚴重的公共衛生問題［14］，現有的HUA治療藥物均存在明顯的不足，因此，開發新型抗HUA藥物具有迫切需求［15］。本研究中對HUA的疾病基因表達譜分析獲得了1492個差異基因，其中下調基因810個，上調基因682個。通過CMap藥物轉錄組數據庫分析預測阿維菌素具有較好的細胞安全性和抑制XOD酶、降低尿酸的作用?；虮磉_譜技術與藥物轉錄組數據庫可以連接“疾病-靶點”與“靶點-藥物”之間的信息，有助于精準的挖掘現有藥物的特定功效，實現高效藥物重定位。如LUO等［16］通過從公共數據庫獲得缺血性卒中和正常人群的差異基因，通過CMap預測發現木犀草素具有抗缺血性卒中作用，后續動物模型中證實木犀草素可通過抑制MMP-9和激活PI3K/Akt信號通路發揮抗缺血性卒中作用。

本研究在差異基因的PPI網絡中預測到IL-1β、TNF、CXCL2、IL-6等可能是HUA發病核心靶點，有研究報道痛風急性發作伴隨著促炎細胞因子IL-1β的分泌，血清中尿酸濃度越高，可能引起IL-1β的分泌增加［17］。TNF信號通路是重要的炎癥信號通路，信號轉導由TNF受體1（TNFR1）和受體2（TNFR2）介導，TNFR2在免疫細胞中表達，它與TNF-α和TNF-β結合來調節免疫反應［18］。TNF-α是一種由不同細胞類型產生的促炎細胞因子，如巨噬細胞、淋巴細胞和成纖維細胞等，其中細胞中尿酸可提高TNF-α的含量，進而TNF-α可促進刺激IL-1β的分泌［19］。CXCL2拮抗劑可緩解尿酸誘導的心臟肥大并抑制心臟炎癥和纖維化，CXCL2可能對預防和治療尿酸誘導的心臟肥大和炎癥反應有效［20］。有研究表明與正常人相比HUA患者血清中IL-1β和IL-6水平顯著升高，且具有統計學意義［21］。以上研究顯示，IL-1β、TNF、CXCL2、IL-6可能是阿維菌素治療HUA的關鍵靶點。KEGG分析顯示HUA核心靶點主要涉及HDASC deacetylate histones、IL-7、UB-specific processing proteases等信號通路，通過以上生物信息學分析結果顯示，治療HUA藥物可能通過多靶點、多通路作用于HUA。

本研究通過分子對接和HUA細胞模型實驗驗證發現阿維菌素具有降尿酸作用，阿維菌素是由阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）產生的大環內酯類抗生素［22］。阿維菌素具有良好的殺蟲效果，還具有抗癌［23］、抗病毒［24］、抗真菌［25］等作用。據報道，阿維菌素在劑量為300 μg/kg，阿維菌素與血漿蛋白結合，在肝臟中經過細胞色素P450系統代謝，幾乎全部通過糞便排出，由于血腦屏障的限制，在大腦中發現的阿維菌素藥物含量最低，因此阿維菌素對大多數哺乳動物物種是安全的［26］。本研究首次發現阿維菌素具有抑制XOD酶活性、降低尿酸的作用，有望成為治療HUA的候選藥物，但阿維菌素抗HUA作用和機制還有待進一步通過動物實驗進行驗證和深入研究。

綜上所述，本文通過HUA疾病基因表達譜和藥物轉錄組數據相結合，連接“靶點-疾病”和“靶點-藥物”信息，從老藥中篩選出具有抗HUA的潛力藥物為阿維菌素，并在體外細胞模型對其抗HUA活性進行了驗證。此研究的開展將有助于提高抗HUA藥物研發效率，為抗HUA研發提供一種新思路。