幽門螺桿菌的脂質組成及其與胃組織病變損傷的關系研究

李秋蘭 顏芙蓉 李彩蘋 李永余 趙越真 鄭小蔚 陳 津

（1 福建醫科大學附屬第二醫院，福建 泉州 362000；2 晉江市醫院檢驗科，福建 泉州 362200；3 福建省泉州市婦幼保健院兒童醫院，福建 泉州 362000）

胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，胃癌在全球的癌癥發生率及病死率高居第5位及第4位。據報道，全球范圍內90%以上的胃癌可以歸因于H.pylori持續慢性感染導致的胃黏膜慢性炎癥和損傷[1-2]。H.pylori作為慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌的主要致病因素，其被世界衛生組織歸類為Ⅰ類致癌物，然而其具體致病機制仍不明確。目前還未有運用脂質組學的方法對幽門螺桿菌進行分析的報道，本文采用脂質組學與快速、高通量、高精度的質譜技術，結合病理以及免疫印跡方法，比較在胃癌發展的不同階段、以及不同細菌類型的結構組成變化，以探討不同毒性的幽門螺桿菌的對胃黏膜侵襲與致病性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 所有病例均為來自福建醫科大學附屬第二醫院進行胃鏡檢查的患者，其中男性21例，女性10例，平均年齡（52.40±18.86）歲。知情同意并簽署知情同意書，本研究已獲得我院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 空腹采靜脈血3 mL，分離血清，操作遵照試劑盒說明書進行。免疫印跡法檢測血清中的H.pylori抗體，包括抗Vac A、抗Cag A、抗Ure A及抗Ure B抗體。根據H.pylori抗體分型檢測結果將抗Vac A和（或）抗Cag A陽性分為Ⅰ型，僅抗Ure B和（或）抗Ure A陽分為Ⅱ型，抗Vac A、抗Cag A、抗Ure A及抗Ure B均為陰性，即為H.pylori感染陰性。

1.2.2 胃黏膜組織病理學 取胃黏膜組織固定于中性甲醛溶液中，常規脫水、石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡下觀察胃黏膜組織細胞形態學變化。

1.2.3 分離培養 活檢標本接種于H.pylori選擇性血平板（HpSBP）上，置微需氧培養罐，再置37 ℃培養箱中用5% O2和10% CO2及85% N2的混合氣體進行培養。培養到第5天，觀察是否有典型幽門螺桿菌菌落。如果有陽性菌落，進行革蘭染色鏡檢，觀察細菌形態，同時進行尿素酶、氧化酶和觸酶等檢測；若無菌落生長，則繼續培養至第7天，仍無菌落生長判定為陰性結果。

1.2.4 脂質組學

脂質提?。孩倜坷魅.pylori菌落6～8個置1.5 mL管中，用PBS液洗滌二次，用液氮淬滅后，置37 ℃與-80 ℃間進行5次反復凍融裂解細菌后，加入225 μL甲醇及標準品，以最大速度渦旋10 s。②加入750 μL甲基叔丁基醚，以最大速度渦旋10 s，室溫靜置30 min。③加入188 μL質譜級水，渦旋20 s，室溫靜置10 min，4 ℃條件下，15000 rpm離心15 min，取700 μL上清液于新EP管中。④氮吹儀吹干上清液，加入100 μL回收液（異丙醇∶乙腈∶水=30∶65∶5），10 s渦旋后，4 ℃條件下，14000 rpm離心10 min，吸取上清液于樣品管。⑤采用LC-MS質譜儀進行檢測。每個待測樣本各取等量體積混合成質控樣本（QC），用來校正混合樣品分析結果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤，用剩余待測樣本進行LC-MS檢測。

將培養出27例H.pylori菌進行脂質組學試驗。先進行脂質提取，再上機檢測。

色譜條件：儀器采用Thermo Ultimate3000，使用ACQUITY UPLC? BEHC18色譜柱（1.7 μm、2.1 mm×100 mm），自動進樣器溫度設為8 ℃，以0.3 mL/min的流速，50 ℃的柱溫，進樣2 μL進行梯度洗脫，流動相為：水（0.1%甲酸+10mM甲酸銨）（A）-異丙醇∶乙腈=2∶5（0.1%甲酸+10mM甲酸銨）（B）。

質譜條件：儀器使用Thermo Q Exactive Focus，電噴霧離子源（ESI），正負離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣流速30 arb，輔助氣流速10 arb。毛細管溫度325 ℃，以分辨率35000進行全掃描，掃描范圍150～2000 m/z，并采用HCD進行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時采用動態排除去除無必要的MS/MS信息。

數據處理：經LC-MS檢測，所獲得的原始質譜數據導入美國Thermo公司的Lipid Search 4.0軟件，進行峰提取和預處理；再將數據導入Microsoft Excel 2010軟件進行歸一化處理。然后將篩選的數據導入瑞士Umetrics公司SIMCA14.0軟件進行多元統計分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。根據OPLS-DA模型中變量投影重要性（VIP）值＞1篩選變量，并結合t檢驗的P值（P＜0.05）尋找差異性脂質代謝物。

1.3 統計學分析 采用 SPSS19.0軟件進行統計分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義；對于顯著偏態分布的資料的組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。

2 結果

2.1 病理學 炎癥18例（伴糜爛8例、潰瘍10例）；萎縮/化生者7例；腫瘤6例（腺癌5例，鱗癌1例）。HE染色可見胃壁細胞腫大、壞死，伴有明顯的炎癥浸潤；部分病例伴有腸異生、萎縮。

2.2 血清H.pylori抗體分型 總陽性率為70.10%。Ⅰ型：表達為抗體Cag A、Vac A、Ure A 及Ure B均陽性占24.50%；表達為Cag A/Vac A+Ure A/Ure B 陽性占25.5%。Ⅱ型：表達為抗體Ure A、Ure B均陽性占9.70%；表達為Ure B或Ure A陽性占6.40%及3.20%。陰性組為Cag A、Vac A、Ure A及Ure B均為陰性。將抗體分型結合病理診斷進行分組。見表1。

表1 H. pylori分型與病理關系[n（%）]

2.3H.pylori培養 共31例，其中4例培養無菌落生長。菌落為無色、透明、針尖狀；涂片經革蘭染色檢查呈革蘭陰性、S形或弧形彎曲狀菌體；脲酶、氧化酶、觸酶均為陽性。

2.4 脂質組學

2.4.1 不同病理異變組的H.pylori脂質成分 按組織活檢病理診斷的嚴重程度進行分組分析：無異變組即無組織類型改變者，共12例，包括炎癥、糜爛、潰瘍者；異變組即存在異型病理變化，共15例，包括萎縮/化生者9例、腫瘤6例（腺癌5例、鱗癌1例）。按脂質類別及類別中占10%以上的主要組分列出H.pylori的脂質譜，共篩選出有明顯差異的18種脂質，具有統計學差異（P＜0.05）。見表2。

表2 不同病理異變組的H.pylori主要脂質成分

圖1 按是否異變分組的H.pylori脂質組學PCA分析散點圖

置換檢驗（圖4.2B）r2＝（0.0，0.836）、Q2＝（0.0，-0.175）、無過擬合存在，表明該模型符合樣本數據的真實性，并可以很好地解釋兩組樣本間的差異。

圖2 按是否異變分組的病例H.pylori脂質組學多元分析散點圖

2.4.2 按是否異變分組的病例H.pylori的差異組分篩選 按異變分組的H.pylori具體組分經多元分析按VIP數值大小列圖3。

圖3 按是否異變分組的病例H.pylori脂質組分差異分布

同時將異變組中的化生和腫瘤組進行成組t檢驗，發現TAG54:1-FA20:0和CE(16:0)組分在兩組間的表達具有顯著性差異，VIP＞1且P＜0.05。見表3；直觀關系熱圖見圖4。

表3 不同分層的異變病例H. pylori差異組分

圖4 不同分層的異變病例H. pylori差異組分熱圖

3 討論

本研究對31例在本院接受胃鏡檢查的患者進行幽門螺桿菌培養，血清H.pylori抗體分型檢測，組織塊病理檢查，以及將培養出的H.pylori進行脂質組學分析。與抗體Ⅱ型組比較，抗體Ⅰ型組胃黏膜組織進行HE染色可見胃壁細胞腫大、壞死，伴有更明顯的炎癥浸潤；同時伴有腸異生、萎縮等?？贵wⅠ型包括抗CagA抗體、抗VacA抗體。而CagA、VacA是慢性感染幽門螺桿菌的毒力因素，也是胃癌的危險因素[3]。H.pylori在胃疾病發展中的作用已完全確立[4-5]，H.pylori的致病性與CagA、VacA相關[6-8]。但不是所有H.pylori菌株都會有CagA的表達，且CagA幾乎只出現在VacA表達陽性的H.pylori患者中[7]。VacA是一種穿孔毒素，可識別靶細胞表面的受體并穿過細胞膜發揮其空泡毒性[8-10]。本次研究發現，Ⅰ型抗體陽性的H.pylori患者在胃腸道異變中具有更高的陽性率，而且其所致胃部損傷程度更為嚴重。因此，血清H.pylori的Ⅰ型抗體可作為臨床H.pylori感染后的治療指征。

本研究又將不同病變階段的胃組織異變程度的胃黏膜培養出H.pylori進行了脂質組學的研究，發現了18個主要脂質類成分。其中，具有明顯差異的脂質是以C18和C16碳鏈為主的LPC、LPE、PE、PC、CE、CER、DAG、SM和TAG等脂質。CE（16:0）的表達降低，且具有統計學意義。雖然剩余脂質的表達也有所降低，但均無統計學差異。我們又將胃黏膜異變的化生組與腫瘤組進行差異脂質進行比較發現，CE與TAG在腫瘤組表達更高。H.pylori的TAG比例的不斷提高，一方面提示胃黏膜異化后的局部環境不利于H.pylori生存，脂滴儲存的致病菌有利于保持感染狀態、使其對寄生部位胃組織持續刺激及毒害；另一方面，研究發現胃細胞癌化時與細胞代謝及增殖相關的脂肪酸結合蛋白表達上調[11]、脂質合成功能增強[12-13]、游離脂肪酸、三酰甘油和總膽固醇等含量升高[14]，癌細胞在人體內的生存依賴脂質、在多種癌癥微環境中都發現積累的脂滴[14-45]，H.pylori高水平的TAG可促進腫瘤的發生與發展。CE（16:0）水平能充分反應胃組織類型改變時的H.pylori整體脂質狀態，可以作為今后H.pylori表觀性狀的風向指標、降低臨床研究成本。膽固醇酯（cholesterol ester，CE）是膽固醇（cholester）在轉運和儲藏過程中的主要存在形式，二者變化趨勢相似；它既可類似于TAG在細胞內合成，也可經H.pylori吸收菌外游離膽固醇（FC）后的轉化[16-17]。作為磷脂雙層的骨架組成之一，高水平膽固醇提升了細胞膜的穩定性、降低了水溶性物質的通透性[18]，也可增強膜脂屏障和（或）逃避宿主免疫系統能力[19-20]，屬于H.pylori在惡劣條件下生存的有利因素。

胃黏膜由炎癥到化生再發展到腫瘤的胃上皮表現與試驗結果一致，故推測CE與TAG與H.pylori的致病相關，CE/TAG組分可能與CagA/VacA小泡成分或H.pylori菌體上的分泌功能結構相關。

綜上所述，H.pylori的致病強弱與H.pylori的脂質成分相關，差異性脂質代謝物，如CE、TAG等為進一步深入研究胃疾病的致病機制提供了方向，但它們如何參與疾病的進程和具體的作用，以及是否所有的胃疾病患者都存在相同的差異性脂質代謝物仍然需要大樣本的試驗來進一步明確。