維藥黑桑中1個新的桑根酮型二氫黃酮化合物及其胰島素增敏活性

賈 安，王玲玲，靳建杰，黃春躍，胡 曉, *

維藥黑桑中1個新的桑根酮型二氫黃酮化合物及其胰島素增敏活性

賈 安1，王玲玲2，靳建杰2，黃春躍2，胡 曉1, 2*

1. 黃河科技學院醫學院，河南 鄭州 450063 2. 中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院有限公司，創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 201203

研究黑桑莖枝中桑根酮型二氫黃酮化合物及其胰島素增敏活性。應用多種色譜技術并結合桑根酮型化合物的紫外吸收特征，對桑根酮型化合物進行分離純化，結合波譜技術及理化性質進行結構鑒定；采用地塞米松誘導胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞模型，采用GOD-POD法和ELISA法來檢測細胞上清液中葡萄糖和脂聯素的含量，考察化合物的體外胰島素增敏活性；通過LanthaScreen? TR-FRET 過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）競爭性結合檢測試劑盒檢測分離得到的化合物與PPARγ的結合能力。從黑桑莖枝90%乙醇提取部位中分離得到1個新的桑根酮型化合物，并鑒定其結構為(5a,10a)-1,3,8,10a-四羥基-4-(2-羥基-3-甲基- 3-丁烯-1-基)-5a-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-5a,10a-二氫-11-苯并呋喃[3,2-b]色原酮-11-酮，命名為黑桑根酮O（nigragenon O），該化合物在10、30 μmol/L能促進胰島素抵抗模型細胞對葡萄糖的攝取和對脂聯素的分泌；對PPARγ受體具有較強的結合活性，半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為5.1 μmol/L。黑桑根酮O為新化合物，具有明顯的體外胰島素增敏活性，是PPARγ潛在配體。

桑科；黑桑；桑根酮型二氫黃酮；黑桑根酮O；胰島素增敏；過氧化物酶體增殖物激活受體γ

黑桑Linn.為桑科（Moraceae）桑屬Linn.落葉喬木植物。桑屬為桑科中重要的屬，該屬植物有16種，我國主產11種，資源豐富，在全國各地均有分布。常見的桑屬植物有桑Linn.、黑桑、雞桑Poir.和蒙桑(Bur.) Schneid等。具有重要的藥用價值，如桑的根皮、枝、葉和果實均作為傳統中藥用于臨床[1]。黑桑俗稱藥桑，為維吾爾族傳統民間用藥，具有生干生寒、燥濕清熱的作用[2]。現代研究表明，黑桑中化學成分豐富多樣，富含黃酮類、二苯乙烯、生物堿類和多酚類成分[2-3]；具有調血脂、降血糖、抗衰老、美白和抗炎鎮痛等多種藥理作用[4-6]]。

桑根酮型黃酮（sanggenon-type flavanones，STFs）是桑屬植物特有的二氫黃酮醇類化合物，具2-異戊烯基-3-羥基取代、C環3位和B環2′位通過醚鍵形成呋喃環，3位的羥基和醚鍵構成一個獨特的半縮酮結構[7]。本課題組前期從黑桑中得到多個結構新穎的STFs，該類化合物具有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制活性[8-9]和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）激動活性[10]，具有潛在的降糖功效。本研究旨在對黑桑中的STFs進行定向分離富集和結構鑒定，并進行體外胰島素增敏活性研究。得到1個新的桑根酮型二氫黃酮醇，命名為黑桑根酮O（nigragenon O），見圖1。體外胰島素增敏活性考察結果顯示，該化合物10、30 μmol/L能促進胰島素抵抗模型細胞對葡萄糖的攝取，增加模型細胞對脂聯素的分泌，表現出明顯的體外胰島素增敏活性；對PPARγ受體顯示出較好的親和力，半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為5.10 μmol/L，結合常數（i）為2.46 μmol/L。

1 材料與儀器

1.1 儀器設備

Rudolph AUTOPOL VI型旋光儀（美國魯道夫公司）；UV-2500PC型紫外-可見分光光度計（日本島津）；JASCO J-810型圓二色光譜儀、JASCO-810旋光分光計（日本JASCO公司）；Nicolet iS5型FT-IR紅外光譜儀、Waters Xevo G2-XS Q-TOF質譜儀、3111型CO2培養箱（美國賽默飛公司）；Bruker AV III 400 MHz型核磁共振儀（德國Bruker公司）；LC3050N型制備液相（北京創新通恒公司）；BioTek Epoch酶標儀（美國伯騰公司）；Envision酶標儀（美國PerkinElmer公司）；CX23型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；YJ-840/YJ-1340型超凈工作臺（蘇州蘇信環境科技有限公司）；Echo 555液體處理系統（。

圖1 黑桑根酮O的化學結構

1.2 試劑與材料

柱色譜正相硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司）；柱色譜正相硅膠（100～200目，上海上邦實業有限公司）；柱色譜反相硅膠ODS-C18（s-50 μm，日本YMC公司）；大孔樹脂AB-8（上海摩速科學器材有限公司）；Sephadex LH-20（50～80 μm，瑞典GE Healthcare Bio-Science AB）；小鼠前脂肪3T3-L1細胞，來源于中科院細胞庫；DMEM（批號C11995500CP）、胎牛血清（批號2110875CP）、PBS（pH 7.4，批號10010-500BT）、Trypsin-EDTA（0.25%，批號25200-056）購自Gibco公司；10% FBS（批號10099）、胰島素（批號12585-014）、1X 抗生素-抗真菌素（批號15240-112）購自Lifetechnologies公司；IBMX（批號I7018）、地塞米松（批號D4902）購自美國Sigma公司；Cell Titer Glo試劑（CTG，批號G7572）購自美國Promega公司；葡萄糖測試盒（批號F006-1-1）購自南京建成生物工程研究所；小鼠脂聯素測定試劑盒（批號PA002）、BCA檢測試劑盒（批號P0012S）購自上海碧云天生物技術有限公司；LanthaScreen? TR-FRET PPARγ競爭性結合檢測試劑盒（批號PV4894）、DTT（批號P2325）購自美國Invitrogen公司；羅格列酮（批號100673-201902，質量分數≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院。

黑桑莖枝于2019年8月采自新疆維吾爾自治區和田縣，經中國醫藥工業研究總院中藥研究部吳彤研究員鑒定為桑科桑屬植物黑桑Linn.的莖枝，標本（HS190930001）存放于中國醫藥工業研究總院中藥研究部標本室。

2 提取與分離

取干燥黑桑莖枝22 kg，粉碎后采用90%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液濃縮得到浸膏1.7 kg。量取AB-8大孔吸附樹脂約1.2 kg裝柱，將部分提取物浸膏（1.2 kg）用水混懸上柱，依次用2倍柱體積的水、5倍柱體積40%乙醇和5倍柱體積95%乙醇洗脫，減壓濃縮干燥分別得到水部位（113.0 g）、40%乙醇部位（560.7 g）和95%乙醇部位（378.0 g）。取95%乙醇部位（250.0 g）經正相硅膠（100～200目）柱色譜，石油醚-醋酸乙酯（10∶1→7∶1→5∶1→2∶1→1∶1）梯度洗脫，得到6個組分Fr. A～F。根據桑根酮黃酮的紫外特征吸收（約300 nm處有最大吸收），對各部位進行HPLC-DAD跟蹤分析，其中Fr. B～E富含桑根酮類成分。進一步與課題組已分離得到的桑根酮型化合物進行比對，發現Fr. D部位有未知的桑根酮型化合物。

組分Fr. D（3.3 g）經Sephadex LH-20凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫分離后得到組分Fr. D-1～D-7。Fr. D-6（2.6 g）進一步經ODS柱色譜，甲醇-水（40∶60→90∶10）洗脫分離后得到Fr. D-6-1～D-6-15。Fr. D-6-9（101.6 mg）經過半制備HPLC（體積流量3 mL/min，乙腈-水63∶37）分離純化得到化合物1（R＝21.2 min，23.7 mg）。

3 結構鑒定

1H-NMR譜給出以下的信號：黃酮類成分特征的C-5位成氫鍵羥基信號H11.70 (1H, brs, 5-OH)；1組ABX體系芳香質子信號H7.35 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 6.50 (1H, dd,= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 6.37 (1H, d,= 2.0 Hz, H-3)；1個單峰芳香質子信號H5.92 (1H, s, H-6)；1組3-甲基-2-丁烯基信號H5.35 (1H, brt,= 6.4 Hz, H-10), 3.10 (1H, dd,= 14.4, 8.0 Hz, H-9a), 2.76 (1H, dd,= 14.4, 7.6 Hz, H-9b), 1.60 (3H, brs, H-13), 1.59 (3H, brs, H-12)；1組2-羥基-3-甲基-3-丁烯基信號H4.84 (1H, brs, H-17a), 4.64 (1H, brs, H-17b), 4.30 (1H, dd,= 7.6, 3.6 Hz, H-15), 2.90 (1H, dd,= 14.4, 3.6 Hz, H-14a), 2.80 (1H, dd,= 14.4, 7.6 Hz, H-14b), 1.64 (3H, brs, H-18)。

表1 化合物1的氫譜和碳譜數據

13C-NMR譜顯示25個碳信號，包括15個二氫黃酮骨架碳信號，其中C91.5 (C-2) 和C102.8 (C-3) 進一步證實化合物為桑根酮二氫黃酮類成分；3-甲基-2-丁烯基的5個碳信號C136.5 (C-11), 118.6 (C-10), 32.1 (C-9), 25.9 (C-12), 18.1 (C-13)；以及2-羥基-3-甲基-3-丁烯基的5個碳信號C148.3 (C-16), 110.3 (C-17), 76.1 (C-15), 29.3 (C-14), 18.2 (C-18)。

利用HSQC譜確定連接氫的碳信號，H2-17（H4.84,H4.64）與C-17 (C110.3) 相關，進一步表明具有末端雙鍵基團；H2-9 (H3.10, 2.76) 與C-9 (C32.1) 相關，H2-14 (H2.90, 2.80) 與C-14 (C29.3)相關，確定了2個不同異戊烯基上亞甲基的碳氫信號。在HMBC譜中（圖2），H2-9與C-2、C-10和C-11相關，H-9a與C-3有相關，確定3-甲基-2-丁烯基連接在C-2位；H2-17與C-15、C-16和C-18相關，H2-14與C-15和C-16相關，證實了2-羥基- 3-甲基-3-丁烯基基團的連接方式，H2-14與C-8、C-8a和C-7相關，確定該基團連接在C-8位。進一步通過HMBC譜中H-6與C-7，C-5和C-4a相關，H-6與C-2和C-4相關，H-3與C-1相關，確定所有碳、氫原子的化學位移歸屬。該化合物的平面結構被確定。

圖2 化合物1的關鍵HMBC相關

化合物的圓二色譜圖譜中，在217、250、292、333 nm附近呈現正Cotton效應，在238和274 nm附近呈現負Cotton效應，見圖3。根據桑根酮型二氫黃酮的圓二色譜規律[12]，并通過文獻對比[11]，確定該化合物C-2位和C-3位的絕對構型分別是2,3。C-15位的絕對構型嘗試用Mosher法確定未果，絕對構型待定。因此，化合物1確定為 (5a,10a)-1,3,8,10a-四羥基-4-(2-羥基-3-甲基-3-丁烯-1-基)-5a-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-5a,10a-二氫-11-苯并呋喃[3,2-b]色原酮-11-酮，經文獻及數據庫檢索確定為新化合物，命名為黑桑根酮O。

圖3 化合物1的圓二色譜圖

4 體外胰島素增敏活性考察

以地塞米松誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞，建立胰島素抵抗模型；采用試劑盒檢測培養細胞上清液中葡萄糖和脂聯素含量，具體方法參考文獻報道[13]，并做了微調。

4.1 細胞培養

3T3-L1細胞常規培養于含10% FBS的DMEM培養液（含1X抗生素）。

4.2 誘導分化

取3T3-L1細胞，加入誘導培養液（含DEME、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、2 μg/mL胰島素和10% FBS），誘導48 h后，換成含胰島素的培養液（含10 μg/mL的胰島素和10% FBS的DMEM），繼續培養48 h；隨后換含10% FBS的DMEM培養液，每48小時換液1次。超過90%的細胞可在8～10 d內分化成熟。

4.3 化合物1的細胞毒性初步考察

誘導分化成熟的3T3-L1細胞，經計數后以1×104個細胞/100 μL的規格接種于96孔培養板，每孔加入90 μL培養液（含血清）培養過夜，再加入10 μL化合物1溶液。培養48 h后，每孔加入CTG 100 μL，室溫靜置10 min，在酶標儀上測定各孔吸光度（）值，從而計算化合物1不同濃度下的細胞活力。

4.4 胰島素抵抗3T3-L1細胞的構建與實驗分組

將誘導分化成熟的3T3-L1細胞隨機分為對照組、胰島素抵抗組、羅格列酮組（陽性對照）和給藥組，對照組培養于含10% FBS的高糖DMEM培養液（含1%抗生素）；胰島素抵抗組、羅格列酮組和給藥組培養于含1 μmol/L地塞米松的高糖DMEM培養液（含10% FBS及1%抗生素），培養96 h；然后，胰島素抵抗組加入不同濃度藥物，繼續培養48 h，得到給藥組；以上所有組別在給藥的同時再分為不加胰島素和加胰島素（1 nmol/L）處理。48 h后檢測葡萄糖和脂聯素含量。按照試劑盒說明書，采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測上清液中葡萄糖含量；ELISA法測定細胞中脂聯素含量。

4.5 統計學分析

4.6 活性結果

前期研究表明，化合物1在30 μmol/L以下對細胞無明顯毒性，細胞活力約為85%，因此本研究選擇10、30 μmol/L對其細胞活力進行考察。如表2所示，當3T3-L1細胞發生胰島素抵抗，無論基礎狀態還是胰島素刺激狀態，胰島素抵抗組細胞液中葡萄糖含量均顯著增加（＜0.01），脂聯素含量顯著降低（＜0.01）。陽性藥羅格列酮各濃度均能顯著促進胰島素抵抗模型細胞對葡萄糖的攝取（＜0.01），并促進脂聯素的分泌（＜0.05、0.01）。化合物1能顯著降低細胞液中葡萄糖含量（＜0.05、0.01）；且30 μmol/L可顯著提高細胞液中脂聯素含量（＜0.05、0.01）。

表2 化合物1對胰島素抵抗3T3-L1細胞中葡萄糖吸收和脂聯素含量的影響(, n = 3)

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

##< 0.001control group;*< 0.05**< 0.01model group

5 PPARγ配體親和力檢測

5.1 實驗方法

根據LanthaScreen? TR-FRET PPARγ競爭性結合檢測試劑盒說明書進行實驗。0.6 nmol/L PPARγ配體結合區（PPARγ-LBD）、0.21 nmol/L 鋱標記的抗GST抗體（Tb-anti-GST Ab）、4 nmol/L 熒光小分子Pan-PPAR配體（Fluormone? Pan-PPAR Green）與200 nL不同濃度的檢測化合物溶液（1和羅格列酮）充分混合后，加入384孔熒光酶標板，總反應體系40 μL，孵育1 h。設相同體積DMSO作為高對照；含1000 nmol/L GW1929作為低對照。

使用EnVision平板閱讀器檢測TR-FRET信號，檢測各孔值（供體熒光495 nm，受體熒光520 nm），計算TR-FRET比值（Value，520/495）。按公式計算不同濃度化合物1的抑制率，并利用Graphpad Prism 5.0軟件繪制劑量反應曲線計算IC50值。

抑制率＝1－(Value化合物－Value低對照)/(Value高對照－Value低對照)

按以下公式計算結合常數（i）值。

i＝IC50/(1＋[tracer]/D)

[tracer] 為檢測反應中最大TR-FRET值對應的供體濃度，本實驗中設定為3 nmol/L，D為供體熒光的結合常數，本實驗的D值為（2.8±0.8）nmol/L

5.2 實驗結果

由圖4所示，化合物1對PPARγ受體顯示出較好的親和力，IC50值為5.10 μmol/L，i為2.46 μmol/L；陽性對照羅格列酮的IC50值和i分別為104.8 nmol/L和50.6 nmol/L。

圖4 化合物1 (100 nmol·L?1～100 μmol·L?1) 和羅格列酮(12 nmol·L?1～10 μmol·L?1) 劑量反應曲線(n＝3)

6 討論

桑屬植物具有重要藥用價值，中醫很早就用桑來治療糖尿病，日本古書《吃茶養生記》也記載桑有改善“飲水病”（糖尿病）的作用。桑屬植物富含生物堿糖類和酚類化合物，以1-脫氧野尻霉素為代表的生物堿糖類，作為強效α-葡萄糖苷酶抑制劑已被開發為抗糖尿病新藥。酚性成分因其異戊烯基的取代和衍生化而具有結構新穎性和多樣性，生物活性也活潑多樣，近年來備受關注。黑桑是桑屬藥用植物的特色種，是國內唯一的22倍體品種，在維醫用藥中具有較長的歷史。大量研究表明[14-16]，黑桑提取物具有明確的降血糖活性和胰島素增敏作用，但其活性物質基礎相關研究不夠充分。

PPARγ作為是一種配體激活的核受體轉錄因子，主要在脂肪組織表達，在脂肪細胞分化和糖脂代謝平衡環節發揮關鍵作用[17]。PPARγ與配體結合，激活PPARγ受體基因轉錄，進一步提高脂肪合成相關因子（C/EBPa、aP2、FAS等）的表達，從而促進脂肪細胞分化；通過上調胰島素增敏因子脂聯素的表達，增加外周組織對葡萄糖的轉運，從而改善胰島素抵抗，進而發揮降糖作用。PPARγ是當前發現胰島素增敏劑的重要靶標。

在課題組前期研究基礎上，本研究從黑桑莖枝中分離鑒定了1個新的桑根酮型二氫黃酮醇，并通過地塞米松誘導胰島素抵抗3T3-L1細胞模型，考察化合物1的胰島素增敏活性。結果提示，該化合物表現出明顯的體外胰島素增敏活性，可促進胰島素抵抗模型細胞對葡萄糖的攝取和對脂聯素的分泌。同時，化合物1對PPARγ受體具有較強的結合活性，是PPARγ的潛在配體，其胰島素增敏作用可能與其PPARγ結合活性有關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new sanggenon-type flavanone fromand its insulin-sensitizing activity

JIA An1, WANG Ling-ling2, JIN Jian-jie2, HUANG Chun-yue2, HU Xiao1, 2

1. Medical School, Huanghe Science & Technology College, Zhengzhou 450063, China 2. State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China

To investigate sanggenon-type flavanones (STFs) from the stems ofand the insulin sensitizing activity.Guided by the UV absorbtion characteristics of STFs, the compound was isolated and purified by a combination of various column chromatographic methods. The structure was elucidated through extensive analysis of HRMS, NMR, UV, IR, CD data and so on. The insulin-sensitizing activities of the compounds were investigated using insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes model induced by dexamethasone. The concentration of glucose and adiponectin in the culture supernatant was determined by GOD-POD assay and ELSA method, respectively. The competitive binding affinity toward PPARγ was evaluated using the LanthaScreenTMTR-FRET assay.A new STF (1) was obtained and identified, named as nigragenon O. Compound 1 decreased the glucose level and promoted adiponectin secretion in the model cells at the concentrations of 30 μmol/L and 10 μmol/L. It also exhibited potent binding affinity for PPARγ with an IC50value of 5.1 μmol/L.Compound 1 showed obviousinsulin-sensitizing effect and displayed potent binding affinity for PPARγ, indicating its potential as a natural insulin-sensitizing agent.

Moraceae;L.; sanggenon-type flavanones; nigragenon O; insulin-sensitizing activity; peroxisome proliferator-activated receptor γ

R284.1

A

0253 - 2670(2023)01 - 0045 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.007

2022-08-02

國家自然科學基金資助項目（32270421）；國家自然科學基金資助項目（81402824）；上海市自然科學基金資助項目（19ZR1454400）；上海市自然科學基金資助項目（21ZR1461800）

賈 安，副教授，從事中藥藥效物質基礎及其作用機制研究。E-mail: 869955076@qq.com

通信作者：胡 曉，研究員，博士生導師，從事天然先導化合物發現與中藥藥效物質基礎研究。E-mail: xjtuyxhx@126.com

[責任編輯 王文倩]