微小RNA調控膠質瘤化學治療耐藥的研究進展*

曾昭穆，李琳，郭巖松，祁惠秀，劉永，閆晴宇，鄭克彬

(1.河北大學附屬醫院神經外科，保定 071000；2.河北大學臨床醫學院，保定 071000)

神經膠質瘤占原發性腦腫瘤的70%以上，復發率及死亡率極高[1]。多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)屬于4級高度侵襲性腫瘤。盡管手術聯合放射治療(放療)和化學治療(化療)方案已顯著改善GBM患者的生活質量，但中位數生存期依然較短，為12～15個月，5年生存率僅4.7%[2-3]。當前，由于腫瘤細胞的內源性和獲得性耐藥的存在，化療藥物對惡性膠質瘤患者的臨床益處依舊有限。隨著新一代測序技術和生物信息學分析的發展，非編碼RNA的相關研究取得明顯進展。越來越多的證據表明，微小RNA(microRNA，miRNA)不僅是膠質瘤增殖、侵襲、凋亡、自噬、免疫應答的生物標志物，同時也是參與膠質瘤耐藥的調節因子[4-5]。miRNA已成為膠質瘤耐藥過程中至關重要的明星分子，而靶向調控miRNA也可能成為逆轉膠質瘤耐藥的一種新型治療策略。因此，筆者系統總結miRNA在多種抗腫瘤藥物中的調控功能及耐藥機制，同時對基于納米載體轉運的核酸治療進行了相關展望。旨在進一步分析miRNA作為新的治療靶點在膠質瘤化療耐藥逆轉過程中的潛在意義。

1 miRNA參與多種抗腫瘤藥物耐藥

化療耐藥一直是膠質瘤臨床治療的主要障礙。惡性膠質瘤患者血腦屏障常常有不同程度的破壞，膠質瘤本身對抗癌藥物的耐受是導致化療失敗的最本質原因。更為重要的是，這些原發性或繼發性耐藥的腫瘤細胞常常表現出多重耐藥(multiple drug resistance，MDR)的特征，其表型主要特點是癌細胞對一種藥物產生耐藥的同時，對其他結構和機制不同的藥物也具有交叉耐藥性。事實上，膠質瘤的臨床MDR由許多因素所引起，這些因素可分為宿主因素、腫瘤因素和腫瘤-宿主相互作用因素，具體包括宿主遺傳變異、藥物相互作用；藥物跨膜轉運、DNA修復、上皮間充質轉化、膠質瘤干細胞表型和自噬；腫瘤微環境、細胞間轉移等[2]。因此，為了減少或消除化療耐藥，揭示其耐藥機制就顯得至關重要。

1.1miRNA參與替莫唑胺耐藥 替莫唑胺細胞毒性作用的主要機制是破壞膠質瘤細胞中的DNA結構，阻止DNA修復，誘導細胞發生凋亡。在腫瘤耐藥研究中，一些致癌性miRNA可以調控凋亡相關信號通路，誘導腫瘤細胞逃避凋亡，從而導致膠質瘤對替莫唑胺產生耐藥性。

1.1.1細胞凋亡 缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α介導的miR-26a是一種缺氧敏感性miRNA，在缺氧條件下的GBM細胞中表達水平明顯上調，并且miR-26a的上調可直接誘導線粒體的保護反應，增強體內外替莫唑胺的耐藥性。另外，研究證明miR-26a還可抑制Bax和Bad的表達，以此減弱替莫唑胺誘導的細胞凋亡[6]。同樣，在膠質瘤組織和細胞系中顯著表達的miR-299-5p可以通過靶向作用GOLPH3調控絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/細胞外信號調節激酶-(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號軸來抑制細胞凋亡，從而增強膠質瘤對替莫唑胺的化療耐藥[7]。此外，miR-497可以通過IGF1R /IRS1途徑上調mTOR和Bcl-2蛋白的表達來誘導膠質瘤細胞的替莫唑胺凋亡抵抗[8]。

1.1.2膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs) GSCs通過多種復雜交錯的信號網絡在膠質瘤化療過程中發揮重要作用。越來越多的證據表明，miRNA與GSCs驅動的膠質瘤耐藥性之間存在相關性。研究發現，miR-30b-3p在缺氧GSCs衍生外泌體中的表達顯著提高，并可伴隨外泌體跨膜轉運至受體GBM細胞內，直接靶向結合BRHOB，以促進替莫唑胺化療抵抗[9]。此外，外源性miR-26a和miR-223的高表達都可通過促進GSCs的增殖能力和球形形成，進而誘導膠質瘤細胞化療耐藥。研究表明，miR-26a可以通過與AP-2α的3'-UTR靶向結合來誘導GSCs增殖，從而促進膠質瘤對替莫唑胺的耐藥性[10]。miR-223在GBM細胞中的表達顯著增加，可以直接結合PAX6發生負向調控，并通過調節磷酯酰肌醇3 激酶( phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/絲氨酸蘇氨酸激酶 (serine-threonine kinase，AKT)信號通路來促進膠GSCs增殖分化，從而降低替莫唑胺的敏感性及生長抑制[11]。

1.1.3DNA損傷修復 相比之下，miRNA還可以作為腫瘤抑制因子，逆轉膠質瘤的替莫唑胺耐藥。例如，O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)是早期發現可造成腫瘤化療耐藥的一種DNA修復酶，它的基本功能是通過將鳥嘌呤O-6位點的甲基轉移至半胱氨酸殘基來修復受損的鳥嘌呤核苷酸，從而避免烷化劑藥物引起的基因突變和細胞死亡。研究發現，MGMT表達量下調與miR-648和miR-125b的表達水平呈負相關[12]。另一研究報道，將miRNA模擬物遞送至膠質瘤細胞中，高表達的miRNA-181d可以通過靶向結合MGMT來逆轉膠質瘤細胞對替莫唑胺的耐藥性。并且一種基于全基因組微陣列分析方法指出，miR-181d-5p是一個始終只與MGMT發生靶向結合的miRNA，這種特異性對于替莫唑胺耐藥性預測具有重要價值[13]。此外，miR-198也可降低膠質瘤細胞中MGMT的表達，從而增強替莫唑胺的細胞毒性。然而，生長轉化因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的過表達可通過抑制人表皮角質形成細胞中的KH-type剪切調控蛋白來阻礙miR-198剪切成熟，從而促進MGMT去甲基化和膠質瘤耐藥[14]。

1.1.4上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) EMT是惡性腫瘤的標志，其生物學進程在腦膠質瘤惡性表型及臨床治療評估中發揮著至關重要的作用。研究表明，miRNA同樣可以調節EMT過程，從而逆轉膠質瘤對替莫唑胺的耐藥性。例如，miR-26b過表達通過靶向結合Wee1逆轉耐藥膠質瘤細胞的EMT，從而增加耐藥細胞的替莫唑胺敏感性[15]。組織蛋白酶B被證實是miR-140的直接標靶，miR-140可通過降低組織蛋白酶B的表達來抑制腫瘤細胞EMT并增強替莫唑胺的細胞毒性[16]。另一研究中證實，miR-128-3p在膠質瘤組織和細胞系中表達下調，而過表達miR-128-3p可下調EMT轉化蛋白C-Met、PDGFRα、Notch1和Slug的表達水平，以此增強膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性[17]。

1.1.5自噬 自噬是一種基于溶酶體降解細胞內物質進行周轉的過程，在膠質瘤的多個方面扮演著重要角色，尤其是在藥物應激上，miRNA介導的自噬對膠質瘤耐藥性起著關鍵調節作用。在缺氧條件下，HIF-1α可以通過負向調節miR-224-3p的表達來影響腫瘤細胞的化療耐藥。ATG5是miR- 224-3p的直接作用標靶，高表達miR-224-3p可以通過抑制ATG5介導的缺氧自噬來逆轉LN229細胞和U251細胞的化學耐藥性[18]。此外，高表達miR-519a可提高膠質瘤細胞對替莫唑胺化療的敏感性，而這種化療增敏正是通過miR-519a抑制STAT3/Bcl-2/ Beclin-1途徑調控自噬和凋亡來實現[19]。

1.1.6跨膜轉運蛋白 藥物轉運與替莫唑胺耐藥之間有著一張龐大復雜的互作網絡，通過miRNA介導的相關轉運蛋白來逆轉膠質瘤對替莫唑胺的耐藥已被廣泛研究。例如，miR-302c上調后通過靶向抑制膠質瘤耐藥細胞中轉運蛋白P-糖蛋白(P-gp)來增強替莫唑胺的細胞毒性[20]。另一類似的研究報道，ABCC1在耐藥腫瘤細胞中表達發生上調，而miR-1268a的過表達可以逆轉這種上調，抑制ABCC1翻譯，從而增強耐藥細胞對替莫唑胺的化療敏感[21]。Wnt5a是miR-129-5p的關鍵靶點，過表達miR-129-5p可以通過抑制Wnt5a來阻斷PKC/ERK/ NF-κB和JNK信號通路的激活，從而逆轉膠質瘤細胞對替莫唑胺耐藥[22](表1)。

表1 MiRNAs參與替莫唑胺耐藥

1.2miRNA參與順鉑耐藥 順鉑作為復發性膠質瘤挽救治療中最常用的化療藥物。其主要作用靶點是DNA，可以共價結合鳥嘌呤和腺嘌呤的嘌呤堿基，形成鏈內加合物以抑制DNA的復制和轉錄，造成DNA損傷[23]。

1.2.1膠質瘤干細胞 GSCs是一群具有自我更新能力的細胞，GSCs相關的miRNA是膠質瘤化療耐藥的關鍵介質。miR-186被證實在膠質瘤組織中表達顯著降低。YY1作為GSCs的分子標志物，過表達miR-186可以通過靶向結合YY1來抑制GSCs表型的形成，進而逆轉膠質瘤的順鉑耐藥[24]。另外，研究發現，CD133陽性的GSCs對順鉑治療表現出更強的抵抗力，而過表達的miR-29a可以改善CD133介導的化學抗性，提高膠質瘤對順鉑的敏感性[25]。

1.2.2細胞凋亡 一些抑癌基因能夠逆轉膠質瘤的順鉑耐藥，主要是通過調控細胞凋亡來實現。研究發現，外源性miR-22模擬物可以通過與SNAIL1發生靶向結合來誘導腫瘤細胞發生細胞周期停滯，從而增強U87MG細胞對順鉑的敏感性[26]。另一研究表明，miR-107在膠質瘤組織中表達水平降低，而mTOR表達水平則顯著增高。與U251親本細胞比較，U251耐藥株中miR-107和mTOR的表達水平也有著類似趨勢。體外研究證明，過表達miR-107可以通過抑制mTOR和Survivin的表達來促進耐藥細胞發生凋亡，進而顯著增強順鉑介導的細胞毒性[27]。同樣，miR-501-3p可以靶向結合MYCN的3'-UTR來促進順鉑誘導的膠質瘤細胞調亡和增殖阻滯。需要注意的是，MYCN表達的恢復可逆轉miR-501-3p這種促進效應[28]。另外，在膠質瘤組織和細胞系中低表達的miR-128也可以逆轉順鉑耐藥。其潛在機制是，恢復miR-128的表達可以靶向結合JAG1分子位點使Bax表達增高及Bcl-2表達降低，從而通過促進腫瘤細胞凋亡和S期阻滯來增強順鉑介導的細胞毒性[29](表2)。

表2 MiRNAs參與順鉑耐藥

1.3miRNA參與植物源性抗腫瘤藥耐藥 近年來，植物提取物對抗腦膠質瘤倍受醫學研究人員的關注[30]。臨床研究表明，很多天然提取物不僅具有抗瘤活性，還可以緩解放療、化療不良反應，提高患者生活質量，降低腫瘤復發率[31]。此外，一些致癌性miRNA的表達可以直接影響天然抗癌藥物的化療功效。例如，miR-374a在惡性膠質瘤中表達顯著增高，當敲低miR-374a時可以直接增加膠質瘤細胞中FOXO1的表達，進而增強依托泊苷對腫瘤細胞誘導的細胞毒性[32]。miR-218為一種抑癌基因，而miR-218-2在膠質瘤組織和膠質瘤細胞中卻高表達，并與膠質瘤細胞的生長、侵襲、遷移和β-拉帕醌化療耐藥呈正相關。從機制上講，miR-218-2可以通過降低CDC27基因的表達來促進U87MG和U251細胞對β-拉帕醌的化療耐藥[33]。YIN等[34]首次證明miR-326的過表達可以提高惡性膠質瘤細胞對抗癌藥物姜黃素的化學敏感性。體外實驗結果證明高表達miR-326可以通過抑制SHH/GLI1信號途徑來降低腫瘤細胞的活力，進而增強姜黃素對U87MG和U251的細胞毒性。程序性死亡因子配體1(programmed death ligand 1，PD-1)在紫杉醇耐藥U87MG中的表達顯著增加，通過直接作用PD-L1的3'-UTR，miR-34a可以抑制腫瘤細胞的進展和化療耐藥[35]。此外，雷帕霉素的應用可以給膠質瘤細胞創造一種饑餓狀態，誘導腫瘤細胞自噬發生[36]。研究報道，miR-7-1-3p的高表達可以通過分別抑制GBM細胞中PKCa和iNOS的表達來增強木犀草素和水飛薊賓協同用藥的抗腫瘤活性，更重要的是，還可以通過抑制雷帕霉素誘導的自噬來促進細胞凋亡[37](表3)。

表3 MiRNAs參與植物源性抗癌藥耐藥

1.4miRNA參與分子靶向藥耐藥 分子靶向治療與傳統藥物比較，其毒性小，只針對腫瘤細胞起抑制作用；作用機制上，分子靶向藥物可以精準調控腫瘤細胞上的特定受體、關鍵基因和控制分子。然而，關于膠質瘤對分子靶向藥物的抵抗機制目前尚不清楚，但已發現一些miRNA可以直接參與調節分子靶向藥物的細胞毒作用[38]。舒尼替尼作為一種抗血管生成的絡氨酸酶抑制藥，通過直接作用P-gp和Bcrp的3'-UTR，miR-145模擬物轉染可以促進舒尼替尼在GBM中的細胞毒性效應[39]。同樣，miR-302a和miR-520b模擬物也可以直接靶向結合AKT1、PIK3CA 和SOS1的3'-UTR，通過抑制U87MG細胞中受體酪氨酸激酶介質AKT1、PIK3CA 和SOS1的表達，提高腫瘤細胞對舒尼替尼的敏感性和細胞凋亡。遺憾的是，miR-302a和miR-520b的這種調節效應在替莫唑胺中卻未能顯現[40]。

生長因子受體是惡性膠質瘤信號網絡中的重要調節蛋白。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和血小板源性生長因子受體新型藥物耐藥性一直是實驗研究的熱點。miR-106a是參與耐藥的重要分子，除了可以促進MDR1和MRP1的表達來增強U87MG耐藥細胞的藥物外排能力和抗凋亡能力外，還可以正向調節GST-π的表達來增強U87MG耐藥細胞的藥物解毒能力，協同通過上述多種調控機制來增加膠質瘤細胞對吉非替尼的耐藥抗性[41]。與正常膠質細胞比較，GBM中miR-450a表達顯著降低，miR-450a高表達可以通過抑制EGFR的翻譯來調控PI3K/AKT/mTOR信號通路，進而調節細胞凋亡和自噬以增強吉非替尼在膠質瘤細胞中的敏感性。另外，miR-450a誘導的上述反應可以被WIPI1敲低所逆轉[42]。在尼妥珠單抗的研究中證實，通過抑制膠質瘤細胞細胞系中高表達的miR-566可以負向調節VHL，進而提高腫瘤細胞對尼妥珠單抗的敏感性[43]。此外，在伊馬替尼耐藥GBM細胞中可以發現SNAI2表達增高，而沉默SNAI2可直接抑制腫瘤細胞EMT進程和耐藥性。研究還發現，miR-203模擬物可以通過與耐藥細胞中的SNAI2發生靶向結合來提高腫瘤細胞對伊馬替尼的敏感性[44](表4)。

表4 MiRNAs參與分子靶向藥耐藥

隨著生物工程技術的不斷發展，已有科研工作者利用基因編輯技術將復制能力強的病毒改造成溶瘤病毒，各類溶瘤腺病毒可以促使膠質瘤細胞發生凋亡而對正常細胞毒性較低，具備很高特異性和選擇性。YAO等[49]為了提高溶瘤腺病毒的細胞毒性和特異性，將4種膠質瘤抑制性miRNAs(miR-124、miR-128、miR-146b和miR-218)反應元件(MRE)與溶瘤腺病毒進行組合構建了重組溶瘤腺病毒 (OA-4MREs)。體內外實驗證明，MRE可以通過靶向結合E1A來調控病毒的復制能力，并且與增殖性腺病毒比較，OA-4MREs對膠質瘤細胞具有更強的細胞毒作用。令人振奮的是，研究人員還發現OA-4MREs對正常組織和細胞均沒有明顯的細胞毒性，僅表現有限數量的病毒后代。因此，OA-4MREs具有很高的安全性，為進一步測試臨床應用提供了可能(表5)。

表5 MiRNAs參與免疫治療藥耐藥

2 展望

近年來，RNA-Seq技術迅速發展，由于其具有高通量、高準確性和高靈敏度等特點，進一步揭開了非編碼RNA與多種癌癥表觀遺傳之間的“神秘面紗”，為非編碼RNA研究走向臨床打開了大門。相關研究顯示，許多蛋白質標靶因為缺乏合適的蛋白結構或轉錄因子，無法與藥物分子相互作用，所以不可成藥[50]。令人振奮的是，與廣泛應用于膠質瘤治療靶點的蛋白質編碼基因比較，非編碼RNA賦有與生俱來的應用潛質，其分子片段占整個人類基因組約98%，可以為膠質瘤化療提供充足的靶點選擇[4]。另外，幾乎所有用于膠質瘤化療的傳統藥物都面臨耐藥性的挑戰，但是目前還未出現關于非編碼RNA藥物耐藥的報道。并且非編碼RNA藥物還可以添加一系列的化學修飾，使得其在體內循環的半衰期比小分子或抗體藥物的半衰期更長。

綜上所述，miRNA在膠質瘤化學抗性中起關鍵調控作用，通過使用miRNA拮抗劑或模擬物靶向糾正耐藥形成過程中內源性miRNA的失調表達，可能是逆轉膠質瘤化學耐藥一種有效的治療策略。作為最早開始研究的非編碼RNA，研究者已開發出多種基于miRNA的核酸工具，如anti-miR、antagomiR、sponge inhibitor、mimics、agomir和Pre-miR等，這些具有獨特序列的核酸工具，可以直接抑制或增強內源性miRNA在腫瘤細胞中的作用，未來或許可以在此基礎進一步發展精深疾病早期診斷工具、早期診斷策略及更有效的藥物治療方法。與此同時，針對miRNA各類核酸藥物的研究開發也從未停止過。MRX34是一種由脂質體納米顆粒包裹的miR-34a mimic，其作為第一個進入臨床試驗的核酸單藥，在腎細胞癌、肢端黑色素瘤和肝細胞癌的治療過程中表現出令人滿意的臨床結果。但該研究因為患者出現嚴重不良反應而停止[51]。Cobomarsen是一種基于鎖核酸修飾的anti-miR-155，以患者體內的致癌性miR-155為靶點來調節細胞的增殖和分化。在一項針對淋巴瘤和白血病II期臨床試驗中，患者對全身和瘤內給藥的Cobomarsen均有著良好的耐受性。關于GBM治療，Regulus Therapeutics Inc公司研發了一種anti-miR-10b的新候選藥物RGLS5579，但是目前還處于臨床前階段[52]。

盡管miRNA治療前景廣闊，但要從眾多候選者中挑選關鍵目標miRNA以及選擇適宜的遞送系統仍然是一個巨大的挑戰。一方面，由于miRNA可以同時靶向調控網絡中多個功能基因，使得目的miRNA可對靶基因以外的其他基因發揮作用，最終導致脫靶效應，產生非特異性調控。因此，需要綜合考慮miRNA藥物在人體內的整體反應，按照嚴格的標準來挑選目的miRNA。另一方面，在維持治療性miRNA高效遞送效率的同時，還需要考慮載體本身對人體器官所帶來的傷害。病毒載體和陽離子納米顆粒是當前miRNA治療中最常用的載體系統，它們不僅存在一定的毒性，還可以誘導免疫原性反應。并且過量的陽離子成分還會使載體顆粒在腎小球基底膜處易于分解，從而導致miRNA的腎臟清除[53]。因此，開發出高效無毒的載體系統是膠質瘤miRNA治療成功的關鍵。此外，隨著近年來液體活檢、分泌物檢查等臨床技術的發展，miRNA作為藥物敏感性早期篩選指標是另一個具有潛力的研究方向。miRNA和化療藥物聯合用于膠質瘤增敏治療似乎也很有前景，值得進一步轉化研究和臨床試驗。

本綜述重點闡述了miRNA在多種抗腫瘤藥耐藥中的功能和機制，并闡明miRNA介導的精確治療將是克服膠質瘤化療耐藥一種理想的治療策略。總之，miRNA療法在臨床實踐中的全面應用還有很長的路要走，亟需進一步探索。同時，為了開發基于miRNA的藥物來改善膠質瘤患者的預后，也迫切需要進行更多的科學研究和臨床試驗。因此，miRNA療法將會是傳統療法的有效補充，有望在未來克服腫瘤細胞化療耐藥。