食品質量與安全專業探究性試驗教學的實踐
——以肉制品基因組DNA提取為例

張麗*，王小會，楊瑤，方瑩，王海英

中南民族大學 生命科學學院 武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點試驗室（武漢 430074）

為主動擁抱新科技革命和產業變革的機遇與挑戰，我國教育部、中央政法委、科技部等13個部門于2019年4月29日在天津聯合啟動“六卓越一拔尖”計劃2.0，全面推進新工科、新醫科、新農科、新文科（簡稱“四新”）建設，以提高高校服務經濟社會發展能力[1]。新農科要用現代科學技術改造升級涉農專業，助力打造天藍水凈、食品安全、生活恬靜的美麗中國[2]。實踐教學是理論聯系實際、培養學生掌握科學方法和提高動手能力的重要平臺，是培養具有創新意識的高素質現代科學技術人員的重要環節。傳統實踐教學存在試驗教學內容陳舊、方法單一的問題，學生在固定的操作步驟下機械地完成試驗過程，缺乏主動積極思考的機會。要提高學生的綜合素質，培養學生解決現代化農業發展中科學問題的能力，為現代化農業培養創新型、應用型人才，需要對實踐教學進行深入的改革。研究以肉制品基因組DNA提取為例對食品質量與安全專業探究性實踐教學的改革進行探索，為本專業的實踐教學改革提供示范。

肉及肉制品是人類飲食的重要組成部分，肉及肉制品的質量與安全關乎人們的身體健康和生命安全[3]。然而肉制品摻假屢禁不止，肉制品以次充好時有發生。2013年歐洲馬肉冒充牛肉事件，沃爾瑪濟南泉城分店銷售的五香牛肉摻狐貍和貉肉，上海雞肉染色變牛肉事件等造成了嚴重的社會影響[4-5]。為了防止此類肉制品摻假事件發生，需要建立準確可靠的鑒定方法。基于DNA的檢測方法近年來獲得了飛速的進步以及廣泛的應用。動物所有的組織細胞中都含有DNA，經過加工后的肉制品仍然可以通過DNA來進行鑒定。基于DNA的檢測方法的實施首先需要提取高質量的基因組DNA[6]。目前，在肉制品樣品的前處理以及基因組DNA的提取方面，不同的研究團隊有不同的處理方式。常規提取DNA的方法有SDS法、試劑盒法、異硫氰酸胍法、CTAB法、濃鹽法等[7-8]。在樣品的前處理方面，Kim等[9]、Amaral等[10]、Meira等[11]采用121 ℃高壓滅菌處理；張菊[12]、Cai等[13]采取80 ℃、72 h的烘干處理；Hou等[14]進行100 ℃和121 ℃烘干處理。哪一種基因組DNA提取方法效果更好？哪一種樣品前處理方式提取的基因組DNA質量更好？圍繞這些問題展開資料檢索、試驗方案設計、試驗結果分析等科研探索步驟，以激發學生的主觀能動性，培養學生的創新能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

2）生活習性。桃小食心蟲在渭北果區每年發生1～2代，以老熟幼蟲在土壤內結繭越冬。一般5月下旬至6月上旬越冬幼蟲破繭出土，成蟲多產卵于果實梗（萼）洼處。幼蟲孵化后，蛀入果實，在果實內蛀食20天左右，老熟后咬破果皮，脫果而出；脫果早的在土表作夏繭化蛹發生第2代，脫果晚的入土越冬。6月下旬至7月上中旬出現第1代成蟲，8月上中旬出現第2代幼蟲，在采果前大部分脫果。

生鮮牛肉、豬肉、羊肉、鴨肉等均購于附近超市，洗凈后剔除多余的結締組織和脂肪，切成小塊分裝，放于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 儀器與試劑

負責該段施工的班長趙華寧和黨員張維柱得知這一消息，心急如焚。他倆忘記了一天的疲勞，丟下手中的飯碗，火速趕到現場。由于管線已下溝埋入泥土中，如用鐵鍬挖土，一不小心就會破壞已防腐的管線。

Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（實時熒光定量PCR擴增預混和溶液，上海翊圣生物技術有限公司，貨號為11201ES03）；氯仿、乙醇、異丙醇、氯化鈉（分析純，購于國藥集團化學試劑有限責任公司）；EDTA、Tris-HCl、SDS、CTAB（分析純，購于Sigma-Aldrich）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

4) 按4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，使蛋白/SDS復合物沉淀出來。

RW20懸臂式攪拌器（IKA）；JK-WB-400三孔水浴鍋（上海精科）；MLS3780高壓滅菌鍋（三洋）；BSC-1304ⅡB2生物安全柜（蘇凈安泰）；5415D微型臺式離心機（eppendorf）；CFXConnect熒光定量PCR儀（Bio-Rad）；NanoPhotometer-N80超微量紫外分光光度計（Implen）；UVCI-1100凝膠成像系統（major science）。

1.2.2 DNA提取方法的比較

經過文獻檢索與比對，選擇改良CTAB法、高鹽法、改良SDS法三種具有代表性的基因組DNA提取方法進行比較研究。

1.2.2.1 改良CTAB法

1.2.2.3 改良SDS法

2) 加入5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，渦旋振蕩30 s。

3) 將離心管轉入65 ℃水浴鍋，溫浴60 min。

4) 加入5 μL 10 mg/mL RNase A，充分混勻，于65℃水浴10 min。

綠化荒山、改善區域生態環境是蘭州石化的“綠色約定”。經過幾十年的努力，蘭州石化將蘭州市南山東起馬耳山溝底、西到大元峁一帶的2500畝荒山建成了省級森林公園。如今，這里春有花、夏有蔭、秋有果、冬有青，成為市民休閑健身的理想場所。

5) 按13 000 r/min離心10 min，轉移上清液到新的2 mL離心管，加入800 μL氯仿，顛倒混勻。

6) 重復步驟（5），取上清液，加入2倍體積沉淀緩沖液（5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl），室溫下放置60 min。

7) 按13 000 r/min離心10 min，棄上清液。

8) 加入175 μL 1.2 mol/L NaCl溶解沉淀。

9) 加入等體積的氯仿，渦旋振蕩30 s，按13 000 r/min離心10 min。

10) 吸取上清液，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫下放置10 min。

11) 按13 000 r/min離心10 min，棄上清液，用750 μL 70%乙醇洗滌DNA沉淀。

當然，以上對被害人陳述進行證偽思維審查的前提是被害人必須出庭接受質證，否則僅對被害人陳述的筆錄進行書面審查則審查不全面或審查干脆進行不下去。有鑒于此，人民法院在刑事審判中必須通知被害人出庭接受質證。

12) 按13 000 r/min離心10 min，棄上清液，在37℃干燥DNA沉淀30 min。

13) 加入100 μL提前預熱的ddH2O溶解DNA。

14) 將提取好的DNA，儲存于4 ℃，若要長期存放，放置于-20 ℃。

1) 將牛肉剔除結締組織，稱取5 g切碎，放入烘干機中80 ℃烘干72 h，再將其磨成牛肉粉[13]。

1) 取50 mg粉末轉入1.5 mL滅菌離心管中，向離心管中加入400 μL DNA提取液[0.4 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），2 mmol/L EDTA（pH 8.0），1%SDS，20 μg/mL胰RNA酶]，用漩渦混合器渦旋30 s。

2) 加入8 μL 20 mg/mL蛋白酶K（終濃度400 μg/mL）。充分混勻后，放入55～65 ℃水浴鍋中溫浴2 h。期間不停顛倒混勻，直至溶液透明。

現代工業經濟不斷提升，為我國的經濟發展做出了重要的貢獻，同時環保問題隨之顯現，成為了重大的環境污染源之一，所以，必須踐行制造生產、環保優先的和諧發展理念［6］。

紫外分光光度法：每份DNA樣品取1.5 μL，利用超微量紫外分光光度計測定基因組DNA的A260/280，每個樣品重復測定3次。當A260=1時dsDNA濃度約為50 μg/mL，純度較好的DNA的A260/280在1.7～1.9之間。如果比值偏高，則說明有RNA未除干凈或基因組DNA降解；如果比值偏低，則說明存在蛋白質和酚類等殘留[12]。

4) 加入等體積異丙醇，混勻，離心管放置在-20℃ 1 h。

被并購方：雅士利，雅士利創始于1983年，是中國嬰幼兒奶粉產業中的領導品牌，該企業還從事營養產品的開發與發展。

5) 按10 000 r/min離心15 min，棄上清液，保留底部乳白色沉淀。

6) 用250 μL 70%乙醇洗滌沉淀，靜置20 min。

7) 按10 000 r/min離心5 min，棄上清液，風干DNA沉淀。

8) 向離心管中加入100 μL ddH2O溶解沉淀。將提取好的DNA，儲存于4 ℃，若要長期存放，放置于-20 ℃。

由所求得的相對重要度可知，人力資源政策對精益生產實施結果的影響最大，其次依次是企業績效管理系統、持續改善思想等。由影響因素的相對重要度排序得，在企業實施精益生產時，最應該注意的就是企業的人力資源政策，好的人力資源政策可以凝聚員工的向心力，使員工可以更好地全身心參與精益改革的過程中去，推動改革的成功。

1) 取50 mg粉末轉入2 mL的滅菌離心管中。加入100 μL水和250 μL CTAB提取緩沖液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，20 mmol/L Na2EDTA），置于渦旋振蕩器上充分振蕩至徹底懸浮。

1) 取50 mg粉末轉入1.5 mL滅菌離心管中，加入600 μL預冷的TE（pH 8.0），然后向裂解液中加60 μL 10% SDS溶液和10 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，于55℃放置3～16 h。

2) 將消化液降至室溫，加入10 μL無DNase的RNase，于37 ℃放置15～60 min。

3) 將樣品降至室溫，然后加入200 μL的醋酸鉀溶液（3 mol/L，pH 4.8），在振蕩器上劇烈振蕩20 s，使其充分混合。

取2 g待測樣本，剔除結締組織和脂肪，將其切成小塊并放入研缽，向研缽中倒入液氮，迅速研磨至樣品成細小的粉末狀為止。

5) 小心將上清液轉移到新離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）溶液，充分混合后，按12 000 r/min離心5 min，多次重復此操作步驟，直到兩相中間不能看到明顯的變性蛋白質為止。

6) 將上清液轉移到加有600 μL異丙醇的新離心管中，充分混合后在室溫下按12 000 r/min離心5 min，收集DNA沉淀。

7) 將DNA沉淀溶解于100 μL ddH2O中。將提取好的DNA，儲存于4 ℃，若要長期存放，放置于-20 ℃。

1.2.3 前處理方法的比較

對樣品進行前處理可以減少水、脂肪等成分對肉制品定量檢測的干擾。在進行干燥處理的同時需避免對基因組DNA提取質量產生影響。根據查閱文獻中所使用的方法，最終選取以下5種前處理方法進行比較，每種處理重復提取2次。

1.2.2.2 高鹽法

2) 將牛肉剔除結締組織，稱取5 g切碎，放入烘干機中100 ℃烘干至恒重，再向研缽中加入液氮，將樣品研磨成粉末[15]。

3) 將牛肉剔除結締組織，稱取5 g切碎，放入烘干機中60 ℃烘干72 h，再將其磨成牛肉粉[16]。

4) 將牛肉剔除結締組織，稱取5 g切碎，用蒸餾水洗凈，放入蒸餾水中浸泡過夜后，放入烘干機中70 ℃烘干4 h，將樣品研磨成粉末[17]。

5) 將牛肉剔除結締組織，稱取5 g切碎，在121 ℃和150 kPa的高壓鍋中加熱15 min，再將其磨成牛肉粉[9]。

1.2.4 DNA提取質量評估

3) 加入300 μL 6 mol/L NaCl，在旋渦混合器上高速混合30 s，按10 000 r/min離心30 s，移上清液到另一離心管中。

瓊脂糖凝膠電泳法：每份DNA樣品取2.5 μL，進行瓊脂糖凝膠電泳。利用凝膠成像系統觀察電泳條帶。基因組DNA的濃度越高，亮度越亮；如果泳道上有彌散條帶，則表明基因組DNA有降解；如果點樣孔很亮，表明基因組DNA中有蛋白質殘留[8]。

PCR法：采用真核生物18S rDNA通用引物對所稀釋的DNA進行實時熒光定量PCR擴增，引物序列為18S-EUKF：AGCCTGCGGCTTAATTTGAC，18S-EUKR：CAACTAAGAACGGCCATGCA，擴增片段為120 bp。實時熒光定量PCR體系：2×Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，基因組DNA模板1 μL，加ddH2O補齊至20 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，讀板，40個循環。根據擴增曲線及擴增Ct（閾值循環數，Cycle threshold）值判斷基因組DNA的可擴增性，擴增曲線典型、Ct值較低，則表明基因組DNA質量較好[16]。

根據工程的復雜程度，對設計資質提出具體要求，如對提灌站、壓力輸水管道、100 m以上的深井、規模較大的建筑物等技術含量較高的工程必須聘請有相應資質的單位進行設計，從源頭抓好工程質量。

2 結果與分析

2.1 DNA提取方法比較

2.1.1 紫外分光光度法評估

將1.2.2小節所述三種方法提取的鴨、豬、牛、羊肉基因組DNA采用紫外分光光度法測定濃度與純度。檢測結果如表1所示。從濃度上進行比較，改良SDS法提取的濃度最高，改良CTAB法提取的濃度最低，高鹽法居中。從純度上比較，改良CTAB法所提取出的DNA的A260/280基本都接近2.0，改良SDS法所提取出的DNA的A260/280大多低于1.7，高鹽法所提取的DNA的A260/280在1.7～1.9之間，相對其他兩種方法較為理想。

配置根保護主要為了防止新加入到網絡中的交換機被選舉為根交換機，從而影響網絡的穩定.當交換機端口啟用根保護后，該端口將會成為指定端口，并且在任何情況下也不會被選舉為根端口.在這里我們以交換機SW2為例，給出根保護的詳細配置命令.

2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳法評估

綜上所述，在開展小學語文教學的過程中，合理地借助網絡資源開展教學，不僅能夠開拓學生的學習層面，提升學生的人文素養，同時也能夠提高學生的實踐能力以及表達能力，促進學生的綜合發展。因此，在開展教學的過程中，教師需要下載網絡資源，并對其進行分析篩選，選擇適合學生接受的知識開展教學，保證學生的學習質量，促進學生綜合素養的形成。

將提取的鴨、豬、牛、羊肉基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示。三種方法提取出來的基因組DNA都有明亮的主帶，但改良SDS法提取的基因組DNA條有明顯的彌散條帶，表明基因組DNA降解較為嚴重。高鹽法和改良CTAB法提取的基因組DNA在瓊脂糖凝膠電泳中條帶差別不大。

圖1 三種方法提取鴨、豬、牛、羊肉基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.1.3 實時熒光定量PCR法評估

4.家長的榜樣作用不夠。父母是孩子的第一任老師，是孩子成長的榜樣。調查中發現，有許多的學困生父母，都有價值觀不正確或生活習慣差的問題。

用真核生物18S rDNA通用引物對所提取的DNA進行實時熒光定量PCR擴增，擴增曲線及其擴增Ct值如圖2和表2所示。圖2表明3種方法所提取的基因組DNA對18S rDNA引物均有典型擴增。對擴增獲得的Ct值進行方差分析，結果表明，改良CTAB法、高鹽法、改良SDS法提取的DNA在Ct值之間具有顯著差異（P＜0.05）。SDS法的Ct值最低，改良CTAB法的Ct值最高，高鹽法居中。這與紫外分光光度法測得的DNA濃度結果較為一致，DNA濃度越高，Ct值則越低。結合圖1中瓊脂糖凝膠電泳結果，雖然改良SDS法提取的基因組DNA有較為明顯的降解，但是該降解并未對18S rDNA 120 bp短片段靶標的擴增造成影響。Kim等[9]研究也表明短片段靶標適合于DNA有降解的檢測。

圖2 三種方法提取鴨、豬、牛、羊肉基因組DNA 18S rDNA定量擴增曲線

表2 不同基因組DNA對18S rDNA擴增Ct值

2.2 前處理方法比較

2.2.1 紫外分光光度法評估

整個教學設計由導入、體驗和歸納三個階段組成。在導入階段，以一部學生已經非常熟悉的電影展開回顧并提問，在這一過程中導入本課主題的概述；在體驗階段，教師將電影內容分層次再現，并布置合理的學習任務，要求學生模仿完成練習并加以運用；在歸納階段，學生根據教師引導，對所學虛擬語氣的三個基本形態予以歸納總結，形成系統知識，進一步提高他們的自學能力。

利用高鹽法提取經過5種不同前處理方法的牛肉，將提取后的DNA用超微量紫外分光光度計測定3次，檢測結果如表3所示。從60 ℃至121 ℃提取的DNA濃度越來越低，證明隨著處理溫度的提高，DNA的得率降低。其中，121 ℃所提取的基因組DNA的A260/A280比值小于1.7，且濃度較低，說明經過高溫高壓處理后，提取的DNA降解嚴重，質量較差。

表3 不同處理方法提取牛基因組DNA純度與濃度測定結果

2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳法評估

將經過5種不同前處理方法的牛肉基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。經60 ℃處理后提取的基因組DNA總體上清晰完整，條帶明亮。70，80和100 ℃所提取的基因組DNA條有明顯的彌散條帶。121 ℃處理后所提取的基因組DNA無明顯可見的基因組DNA條帶，表明基因組DNA隨著處理溫度的提高逐漸發生降解。

圖3 牛肉不同處理方法提取DNA電泳結果

2.2.3 實時熒光定量PCR法評估

用真核生物18S rDNA通用引物對60，70，80，100和121 ℃ 5種不同前處理方法提取到的DNA進行實時熒光定量PCR擴增，擴增Ct值及其擴增曲線如表4和圖4所示。結果表明所提取的基因組DNA對引物18S rDNA引物均有擴增，且Ct值均小于36，表明提取的樣品基因組DNA均具有可擴增性，能夠滿足PCR檢測的需求。其中60 ℃處理后提取的DNA的Ct值最低，這與紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法測得的濃度最高相符。60，70和80 ℃處理總體上對DNA的Ct值影響較小。100 ℃和121 ℃處理后，Ct值有明顯的增大。

表4 不同處理牛基因組DNA對18S rDNA擴增Ct值

圖4 不同處理方式提取牛基因組DNA 18S rDNA定量擴增曲線

3 結論與討論

分別使用改良CTAB法、高鹽法、改良SDS法三種不同的提取方法提取鴨、豬、牛、羊肉的基因組DNA，并且采用五種不同的方式對牛肉進行前處理。對所提取的基因組DNA分別通過紫外分光光度法測定A260/280、瓊脂糖凝膠電泳法、實時熒光定量PCR測定Ct三種不同的方法評估DNA質量。研究結果表明，高鹽法提取的基因組DNA沒有明顯的DNA降解和蛋白質殘留，質量較好。且高鹽法在操作過程中不涉及氯仿、異戊醇等有毒有害試劑，操作步驟和時間也較短，在本科試驗教學中優先推薦該方法的使用。在樣品的前處理方面，60，70，80，100和121 ℃的不同肉制品前處理方式中，60 ℃處理所提取的DNA濃度最高，質量也較好。研究結果為快速、簡單地提取肉制品基因組DNA提供參考，為基于基因組DNA的肉制品成分鑒定提供技術支持。

此研究是食品質量與安全專業探究性試驗教學改革實踐。在整個實踐教學過程中，首先需要檢索國內外文獻，查閱肉制品基因組DNA提取的方法、了解各種方法的基本原理，確定試驗方案。文獻檢索與文獻分析實踐過程，有助于培養大學生的信息素養。然后要掌握評估基因組DNA質量的方法，這些方法在理論課中多有提及，但是學生往往一知半解，通過實踐操作，可以加深學生對理論知識的理解與應用。綜合使用三種不同的評價方法來對基因組DNA質量進行評估，有助于學生對知識的融會貫通與綜合運用，讓學生獲得完整的實踐經驗，以防止學生的知識點零散、知識體系窄化脫離實際應用。此研究以肉制品基因組DNA提取為例對實踐教學進行改革，在凸顯教學內容的系統性及完整性的同時，強調試驗的設計性，有助于提高學生的實踐能力和創新思維能力，培養符合現代化社會發展需求的創新型、應用型人才。