楚雄葛根提取工藝優化及免疫調節活性初探

趙悅，李佳錦，張希，楊婧娟，馬雅鴿*

云南中醫藥大學（昆明 650500）

葛根常作為保健食品的原料。葛根中的活性成分有黃酮類化合物（3.78%）[1]、香豆素類、氨基酸類等[2]，而如何提高葛根素提取效率一直是研究熱點。常用的傳統提取法有水提取法、醇提取法[3]和回流法[4]；現代提取工藝有微波輔助提取[5]、超聲提取[6]、酶解法、超臨界流體提取法[7]、半仿生提取法[8]、仿生提取法[9]等。水提和醇提法最為常見，但用這2種方法提取葛根素得率的差異需做進一步試驗研究。葛根素、黃酮類含量常見的檢測方法有高效液相法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10]、紫外分光光度法[1]等。葛根素具有廣泛的藥理活性，如降壓[11]、降糖[12]、改善骨質疏松[13]、保護心肌細胞[14]、抗腫瘤[15]、抗血小板聚集等[2,16]。還可用于輔助治療心腦循環障礙相關疾病[11,17-18]，及慢性酒精誘導的肝損傷[19]、糖尿病[16,20-23]。近年來，對于免疫類疾病的研究也成為熱點，試驗研究更是涉及細胞、動物、通路等，相關研究技術和思路也更加成熟和系統。葛根素也具一定免疫調節作用，如葛根素可通過NF-κB信號通路減輕高糖誘導的RSC96細胞炎癥[24]，但研究并不全面。

基于此，試驗采用高效液相色譜法[10]測定楚雄葛根粉中葛根素含量；采用均勻設計法[8]，對葛根素及黃酮的水提和醇提工藝進行優化和對比研究；以小鼠RAW264.7巨噬細胞為模型，探討2種提取物對RAW264.7的免疫調節活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楚雄葛根全粉（Chuxiong Radix Puerariae thomsonii Powder，CRPTP，云南省楚雄州姚安縣）；RAW264.7細胞（RAW購自武漢普諾賽生命科技有限公司，源自Abelson鼠科白血病病毒誘導的腫瘤；sIg-、Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原陰性。RAW264.7細胞不分泌可檢測到的病毒顆粒，XC斑點形成試驗陰性。RAW264.7細胞可以胞飲中性紅并吞噬乳膠顆粒與酵母聚糖，并且可以抗體依賴性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細胞。LPS或PPD處理2的、可誘導RAW264.7細胞分解紅血球，但對腫瘤靶細胞無作用）。

蘆丁（99.99%，上海源葉生物科技有限公司）；葛根素（99.99%，上海麥克林生物科技有限公司）；其余試劑均為國產分析純；中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；脂多糖（LPS，純度≥98%，Solarbio）；CCK-8試劑盒（proteintech）；胎牛血清（BI公司）；DMEM高糖培養基（美國gibico公司）

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（L5S，上海精密儀器儀表有限公司）；電子天平（CP214，上海奧豪斯儀器有限公司）；超聲波清洗機（SB-5200D，寧波新芝生物科技股份有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司）；低速離心機（SC-3614，安徽中科中佳科學儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（HGZF-Ⅱ/H-101-3，上海躍進醫療器械有限公司）；超純水儀（LAB-250SY，南京歐鎧環境科技有限公司）；高效液相色譜儀（HITACHI L2000，美國安捷倫公司）。

1.3 方法

1.3.1 葛根素和黃酮提取方法

稱取5.000 0 g的葛根粉，配好提取液，頻率40 kHz，功率100 W，室溫，超聲5 min，控制不同條件提取，提取物離心15 min，得到葛根提取液。

1.3.1.1 水提法

采用DPS軟件，以葛根素和總黃酮含量為指標，進行提取時間（X1）、提取溫度（X2）和料液比（X3）的三因素九水平均勻試驗設計，進行試驗，對楚雄葛根水提物中葛根素和黃酮的提取條件進行優化。

1.3.1.2 醇提法

采用DPS軟件，以葛根素和總黃酮含量為指標，進行乙醇體積分數（X1）、提取時間（X2）、提取溫度（X3）、料液比（X4）的四因素九水平的均勻試驗設計，進行試驗，對楚雄葛根醇提物中葛根素和黃酮的提取條件進行優化。

1.3.2 高效液相色譜法測定葛根素含量

色譜條件：ODSHYPERSIL色譜柱（250 nm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（25∶75，V/V），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量20 μL，檢測波長250 nm。

樣品溶液的制備：準確稱取5.000 g葛根粉，置于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 70%的乙醇，在80 ℃水浴鍋中回流提取60 min，提取液以3 000 r/min離心10 min，取上清液，加入70%的乙醇定容至100 mL，待測。

葛根素含量的測定：用雙蒸水將100 mg/mL的葛根素標準品母液，稀釋成質量濃度為10，20，30，40，50，60，80，100，120和200 μg/mL的葛根素標準品使用液。進樣量20 μL，進行HPLC測定。以葛根素含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。取4種市售葛根樣品液，進樣量20 μL，根據峰面積計算葛根素含量[22]。

1.3.3 分光光度法測定葛根素含量

用30%乙醇配制100 mg/mL葛根素標準液，稀釋成質量濃度為0，10，20，30，40，50，60，80，100和120 μg/mL的葛根素標準品使用液。在波長250 nm處，測定吸光度。以葛根素濃度為橫坐標，250 nm處吸光度為縱坐標繪制標準曲線。用紫外可見分光光度計在波長250 nm處，測定葛根提取液的吸光度，將吸光度代入葛根素標準曲線，計算樣品中葛根素含量。

1.3.4 分光光度法測定總黃酮含量

用80%乙醇體積分數配制質量濃度100 μg/mL的蘆丁標準液母液，稀釋成質量濃度為0，20，30，40，50，60，70和80 μg/mL的蘆丁標準系列使用液。在波長510 nm處測量吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，A510nm為縱坐標繪制標準曲線。在波長510 nm處，測定葛根提取液的吸光度，將吸光度代入蘆丁標準曲線，計算樣品中黃酮含量。

1.3.5 葛根粉水提物和葛根粉醇提物對RAW264.7細胞增殖作用的影響

將長勢良好的RAW264.7細胞以1×105CFU/mL的密度取200 μL接種到96孔板[25]，在5% CO2，37℃條件下培養24 h。設置空白組（NG）、陽性對照組（LPS）、給藥組，給藥組分別加入葛根水提物（pueraria aqueous extract，PAE）和葛根醇提物（pueraria ethanol extract，PEE）且分別設低、中、高劑量組，濃度分別為50，200和800 μg/mL，每組5個復孔。繼續培養24 h后，棄去培養液，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，并加培養液至100 μL，將96孔板置于培養箱中孵育1 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度，按式（1）計算細胞增殖率，即細胞活力。

1.3.6 葛根水提物及醇提物對RAW264.7細胞吞噬作用的影響

將長勢良好的RAW264.7細胞以1×105CFU/mL的密度，取200 μL接種到96孔板，在5% CO2，37 ℃條件下培養24 h。棄去舊培養液，設置空白組（NG）、陽性對照組（LPS）、給藥組，給藥組分別加入PAE和PEE，且分別設低、中、高劑量組，每組5個復孔。培養12 h后，棄去舊培養液，用PBS緩沖液清洗1次，加入50 μL中性紅染色液，染色20 min，棄去染色液，用PBS緩沖液清洗2次，在顯微鏡下檢測細胞染色情況。加入200 μL中性紅檢測裂解液，室溫振蕩裂解10 min，裂解50 min，用酶標儀在540 nm處測定吸光度，按式（2）計算吞噬率。

1.3.7 數據處理

試驗采用DPS 9.50軟件對所有數據進行回歸分析，擬合出變量之間的方程，用于最優條件的選擇，其他所有數據以均數±標準差（SD）表示。數據采用一般線性模型和單因素方差分析，組間差異采用Duncan’s multiple range檢驗，采用SPSS軟件。每個試驗至少重復3次。差異顯著，P＜0.05，差異極顯著，P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 HPLC法測定種植楚雄葛根全粉中葛根素含量結果與分析

不同標準品濃度測得葛根素標準曲線方程y=51.853x+114.48，相關系數R2=0.998 8，說明該標準曲線的線性相關性良好，可用于葛根素含量10～200 μg/mL的樣品測定，見圖1。根據色譜條件測定楚雄葛根全粉中葛根素峰面積，見圖2，計算出樣品中葛根素含量，如表1所示。

圖1 葛根素標準曲線的高效液相色譜圖

圖2 楚雄葛根全粉中葛根素含量的高效液相色譜圖

表1 楚雄葛根全粉中葛根素含量測定結果

經過對楚雄姚安的葛根全粉中葛根素含量的測定，結果得出其葛根素含量為4.05 mg/g。

2.2 楚雄葛根中葛根素和黃酮水提工藝的優化結果與討論

測得葛根素含量標準曲線方程y=0.033 5x+0.115 9，相關系數R2=0.995 2，說明該標準曲線的線性相關性良好，可用于葛根素含量10～100 μg/mL的樣品測定。蘆丁含量標準曲線方程為y=0.011 1x+0.003 3，相關系數R2=0.995 4，說明該標準曲線的線性相關性良好，可用于黃酮含量20～80 μg/mL的樣品測定。楚雄葛根水提物中葛根素和黃酮含量如表2所示。

表2 均勻試驗設計水提葛根中葛根素和黃酮測定結果（以干重計）

利用DPS數據處理系統中二次多項式逐步回歸分析法對在各試驗方案下所得含量進行分析，得到水提物葛根素和黃酮含量回歸方程：Y1=557.96+82.11X1+63.58X3-29.41X22-30.60X32+28.14X1X3+79.28X2X3；Y2=647.10-250.68X2-61.08X3+30.48X22-5.85X1X2+2.87X1X3+10.79X2X3。

Y1相關系數R=0.996 7，顯著水平P=0.019 4，Y2相關系數R=0.994，顯著水平P=0.035 6，說明2個回歸方程相關性較好。通過回歸方程分析，預測的葛根素水提的最優工藝條件為提取時間135 min、溫度92.7 ℃、料液比1∶50（g/mL），葛根素含量最高提取值為1 156.05 μg/g。預測的黃酮水提的最優工藝條件為提取時間15 min、溫度92.7 ℃、料液比1∶48（g/mL），黃酮含量最高提取值為5 221.02 μg/g。

綜合考慮，在時間135 min、溫度92.7 ℃、料液比1∶50（g/mL）條件下，各進行3次平行試驗，水提物葛根素平均含量為809.42±11.32 μg/g，黃酮平均含量為3 848.08±23.43 μg/g。將葛根素和黃酮的平均值與最高含量預測值進行比較，即此條件下所得葛根素含量為預測值的70.00%，黃酮含量為預測值的73.70%。2個預測值誤差較大，但仍能接受。

2.3 楚雄葛根中葛根素和黃酮醇提工藝的優化結果與討論

楚雄葛根醇提物中葛根素和黃酮含量如表3所示。

表3 均勻試驗設計醇提葛根中葛根素和黃酮測定結果（以干重計）

利用DPS數據處理系統中二次多項式逐步回歸分析法對在各試驗方案下所得含量進行分析，得醇提葛根素和黃酮含量回歸方程：Y1=-172.64+155.48X3+755.11X4-32.46X32-46.06X42-4.85X1X2+1.05X1X4-0.30X3X4；Y2=666.16-134.67X1-26.00X2-12.30X4+7.61X12+3.68X22+1.82X42-0.11X1X4

Y1相關系數R=1，顯著水平P=0.05，Y2相關系數R=1，顯著水平P=0.002 9，說明2個回歸方程相關性較好。通過回歸方程分析可知，在此方案下醇提葛根素的最優工藝條件為乙醇體積分數90%、提取時間15 min、溫度33.5 ℃、料液比1∶48（g/mL）。醇提黃酮的最優工藝條件為乙醇體積分數60%、提取時間135 min、溫度60 ℃、料液比1∶50（g/mL）。在此工藝條件下，預測的葛根素含量和黃酮含量最高提取值分別為638.67和3 136.78 μg/g。可對此試驗方案下所得最佳指標的試驗方案進行驗證。

綜合考慮，在乙醇體積分數60%、提取時間135 min、溫度60 ℃、料液比1∶50（g/mL）條件下，分別進行3組平行試驗，葛根素含量為590.21±21.44 μg/g，黃酮含量為3 089.72±45.36 μg/g。分別將葛根素和黃酮的平均值與最高含量預測值進行比較，即此條件下所得葛根中葛根素含量為預測值的92.41%，黃酮含量為預測值的98.50%。在誤差允許的范圍內驗證成功。

在水提法和醇提法2種最優工藝條件下，水提物葛根素平均含量為809.42±11.32 μg/g，黃酮平均含量為3 849.08±23.43 μg/g，醇提物葛根素平均含量為590.21±21.44 μg/g，黃酮平均含量為3 089.72±45.36 μg/g。結果表明在最佳工藝條件下水提所得到的葛根素和黃酮含量都略高，但是差異不顯著。

2.4 PAE及PEE對RAW264.7細胞的增殖作用影響

由圖3（A）可知，與NG組比較，LPS組，100，200和400 μg/mL PAE對RAW264.7細胞的促進作用具有顯著性差異，提示PAE對RAW264.7細胞的增殖均有一定促進作用。由圖3（B）可知，與空白組比較，LPS組，200，400和800 μg/mL葛根水提物對RAW264.7細胞的促進作用具有顯著性差異，PEE對RAW264.7細胞的增殖均有一定促進作用。同時，隨著濃度的增加，PAE和PEE對細胞的增殖作用都呈現先上升后降低趨勢，但是兩者增殖作用的差別不顯著。PAE最佳濃度為200 μg/mL，PEE最佳濃度為400 μg/mL。

圖3 PAE（A）和PEE（B）對巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響

2.5 PAE和PEE對RAW264.7細胞中性紅吞噬作用影響

由圖4可知，與NG組比較，陽性組能極顯著增強RAW264.7細胞的吞噬能力，PAE濃度50和200 μg/mL，PEE濃度200 μg/mL時能極顯著增強RAW264.7細胞的吞噬能力，且隨著濃度的增加，對RAW264.7細胞吞噬能力的作用呈先上升后下降趨勢。低濃度時，PAE大于PEE；高濃度時，PAE小于PEE，但兩者吞噬作用的差別不顯著。結果表明PAE及PEE均能有效激活RAW264.7細胞發揮吞噬作用，而且兩者的差異不顯著。

圖4 PAE和PEE對巨噬細胞RAW264.7吞噬作用的影響（平均值）

3 結論

由試驗結果可知，水提法在最優提取工藝下所得葛根素和黃酮含量都略高。由此可見，不同提取方法下的葛根素得率存在一定差異，因此，實際生產過程中應確定最佳提取方法，才能提高生產效率，避免原料、人工、資金等的浪費。通過PAE和PEE刺激RAW264.7細胞發現兩者在促進RAW264.7細胞的增殖和吞噬能力方面不存在顯著差異，但試驗并未進一步研究葛根提取物提高免疫的機制，后續試驗可將細胞因子及相關通路中蛋白的表達作為檢測指標，深入探索葛根提取物通過調控具體通路及通路蛋白發揮免疫作用的機理。綜上，實際生產中可用PAE作為原料，開發具有免疫調節功能的食品，以滿足市場需求，為功能食品工藝研究、質量控制標準的制定和開發其免疫相關功能食品奠定理論基礎。