木姜葉柯茶湯中總黃酮的加工穩定性

夏旭，庾卓思，呂宗浩，楊建琳，胡應祥，向小樂*

1.懷化市農業科學研究院（懷化 418000）；2.長沙理工大學（長沙 410000）；3.湖南富農甜茶有限責任公司（懷化 418000）

木姜葉柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun），為殼斗科柯屬常綠喬木，根據典籍記載木姜葉柯有著悠久的民間飲用歷史[1]，是一種藥食兩用，兼有茶、糖、藥三種功能的植物[2]，并于2017年被納入新食品原料目錄。木姜葉柯廣泛分布于我國長江以南各省區海拔500～2 500米以上的低山密林中[3-4]，在湖南懷化地區又稱為芷江甜茶或溆浦瑤茶，目前已經實現了木姜葉柯茶的產業化種植。

木姜葉柯含有豐富的黃酮類和三萜類成分，三葉苷、根皮苷和3-羥基根皮苷等二氫查爾酮類化合物為其主要黃酮類成分和甜味成分[4-6]，其中三葉苷甜度為蔗糖的300倍，熱量極低。研究表明木姜葉柯及其提取物有降糖、抑菌、抗過敏、抗氧化等功效[1-5,7-8]。因此，木姜葉柯制茶與普通的綠茶相比有含有天然甜味，不易產生茶多酚沉淀物，具有抗氧化、降糖降脂功效等優點，是一種前景廣闊的茶飲。目前研究人員對木姜葉柯葉提取物生物學活性的研究較為多見，對木姜葉柯茶湯的加工特性研究則尚未見報道，研究擬對木姜葉柯茶飲中總黃酮的加工穩定性進行研究，旨在為木姜葉柯茶飲的加工應用和產業鏈延展提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木姜葉柯茶由湖南富農甜茶有限責任公司提供，產地：懷化芷江。

蘆丁標準品（純度＞98%，上海金穗生物科技有限公司）；氯化銅：化學純；鹽酸、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、30%過氧化氫、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、無水氯化鈣、硝酸鋁、氯化鐵、L-抗壞血酸、苯甲酸鈉、檸檬酸、蔗糖、葡萄糖、焦磷酸鈉、山梨酸鉀等試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器與設備

DHG-9070A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；800Y多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；ATX224電子天平（日本島津）；HH-6數顯恒溫水浴鍋（常州市普天儀器制造有限公司）；722可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；PHS-3C pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

1.3 茶湯的制取

木姜葉柯干制茶葉用粉碎機粉碎，過0.250 mm篩網后，作為供試茶樣。供試茶樣按0.2%茶水比于沸水中提取2 min，期間攪拌數次。提取完成后，自然冷卻，用定量濾紙過濾，即為樣品茶湯。

1.4 標準曲線繪制和總黃酮測定

參照夏旭等[9]建立的方法，精密稱取200 mg蘆丁標準品于100 mL容量瓶中，用70%甲醇定容作為母液。吸取0，0.5，1，2，3和4 mL蘆丁母液分別置于25 mL容量瓶中，補加70%甲醇至10 mL，再加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加10% Al(NO3)3硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入4% NaOH氫氧化鈉溶液10 mL，再加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min；以空白試劑做參比，在波長510 nm處繪制蘆丁標準曲線和測定木姜葉柯總黃酮。

1.5 不同因素對木姜葉柯總黃酮穩定性的影響

1.5.1 儲存時間和光照對總黃酮穩定性的影響

向潔凈的具塞試管中加入木姜葉柯茶湯，分成2組分別置于室內試管架和室外陽光直射下儲存，間隔時間取樣，按照黃酮類化合物的檢測方法檢測吸光度，記錄數據并繪圖。

1.5.2 pH對木姜葉柯茶湯穩定性的影響

分別量取50 mL制備好的木姜葉柯茶湯置于10個小燒杯中用氫氧化鈉稀釋液及鹽酸稀釋液將茶湯樣液pH調節至2～11，在波長510 nm處測定吸光度。

1.5.3 還原劑Na2SO3對木姜葉柯茶湯穩定性的影響

在加有10 mL樣品茶湯的試管中，分別加入Na2SO3配制成0.01%，0.02%，0.03%，0.04%和0.05%的溶液，避光放置30 min后，在波長510 nm下測定吸光度。

1.5.4 氧化劑H2O2對木姜葉柯茶湯穩定性的影響

在加有10 mL樣品茶湯試管中，分別加入H2O2配制成0.25%，0.5%，1%，1.5%和2%溶液，避光放置30 min后，在波長510 nm下測定吸光度。

1.5.5 食品添加劑和糖對木姜葉柯茶湯穩定性的影響

在加有10 mL樣品茶湯試管中，分別加入下列食品添加劑配制成相應濃度的溶液：0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%抗壞血酸、檸檬酸，0.05%，0.1%，0.15%，0.20%和0.25%苯甲酸鈉、山梨酸鉀，以及2%，4%，8%，8%和10%蔗糖和葡萄糖。搖勻后，避光放置30 min，在波長510 nm下測定吸光度。

1.5.6 金屬離子對木姜葉柯茶湯穩定性的影響

在加有10 mL樣品茶湯的試管中，分別加入金屬離子Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Fe3+溶液，使得金屬離子在茶湯中的質量分數分別為0.01%，0.02%，0.03%，0.04%和0.05%，避光放置30 min后取上層清液，在波長510 nm下測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 木姜葉柯茶湯中總黃酮含量測定

測定蘆丁標品的吸光度，得蘆丁標準曲線的回歸方程：y＝30.067x+0.046 1（R=0.999 2），說明總黃酮含量與吸光度線性關系良好。木姜葉柯茶湯的吸光度為0.194±0.025，根據標準曲線，求得木姜葉柯茶湯中總黃酮含量約為0.005 mg/mL，折合總黃酮提取率約為0.25%，顯著低于有關研究[10-11]，可能是因為茶湯煮制時間太短。為表示方便，下文均以吸光度的變化來表示木姜葉柯總黃酮含量的變化。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 儲存時間和光照對木姜葉柯總黃酮穩定性的影響

在室內避光貯藏，木姜葉柯總黃酮吸光度隨時間（0～8 h）的延長保持平緩不顯著降低的趨勢，茶湯顏色隨著時間的延長而加深，可能原因是茶湯中存在的黃酮類和兒茶素類等呈色成分發生氧化所致[12]；在室外陽光直射條件下（6月），木姜葉柯總黃酮吸光度變化較大，先上升后又隨之下降，可能是黃酮類化合物在自然光的條件下發生水解、異構化、氧化等原因導致的，隨后又因為光氧化作用導致黃酮類成分進一步被破壞[13-14]，茶湯顏色也隨著時間的延長而加深但是加深的程度比室內的更少，可能是因為是光氧化進一步破壞了呈色成分，這說明室內避光條件下，木姜葉柯總黃酮的穩定性優于陽光直射條件。

圖2 儲存時間和光照對總黃酮穩定性

2.3 pH對木姜葉柯總黃酮穩定性的影響

由圖3可知，在pH 2～7范圍內，木姜葉柯茶湯的吸光度在酸性條件下變化較小，且隨著pH的增加吸光度逐步升高，在pH 6附近有最大吸光度，說明此時的木姜葉柯總黃酮含量最高，研究結果和朱新鵬等[15]的相關研究類似，原因可能是總黃酮苯環結構中含有酚羥基，顯弱酸性，所以總黃酮在該pH附近的弱酸性環境中比較穩定[16]。在堿性條件下，木姜葉柯黃酮穩定性較差，當pH＞9時吸光度迅速降低，說明木姜葉柯茶湯中黃酮類化合物在堿性較強的環境中容易受到破壞，表現出不穩定性，在酸性條件下穩定性較好，因而弱酸性條件有利于木姜葉柯總黃酮的儲存。

圖3 pH對總黃酮穩定性的影響

2.4 還原劑Na2SO3對木姜葉柯總黃酮穩定性的影響

從圖4可以看出，還原劑Na2SO3的加入使得吸光度降低，可見還原劑Na2SO3對木姜葉柯黃酮化合物有較強的破壞作用。可能的原因是Na2SO3使得黃酮類化合物的結構被破壞[17]，從而導致總黃酮含量下降，隨著Na2SO3濃度的增大，黃酮類化合物的呈現出一定的下降趨勢。所以，在木姜葉柯茶湯的生產、存儲過程中應該避免與還原能力較強的還原劑Na2SO3等接觸。

圖4 還原劑Na2SO3對總黃酮穩定性的影響

2.5 氧化劑H2O2對木姜葉柯總黃酮穩定性的影響

從圖5可以看出，與空白樣相比，0～2%濃度處理下隨著H2O2濃度的增大，吸光度不斷下降，這表明木姜葉柯總黃酮在氧化劑的環境中容易受到破壞，在加工和儲存時應注意避免與氧化劑的接觸。有文獻[18]表明，總黃酮會表現出一定的抗氧化性，但研究吸光度呈現出快速下降趨勢，可能是因為總黃酮含量過低。

圖5 氧化劑H2O2對總黃酮穩定性的影響

2.6 食品添加劑對木姜葉柯總黃酮穩定性的影響

從圖6可以看出，在不同濃度的山梨酸鉀、苯甲酸鈉、L-抗壞血酸和檸檬酸處理下的木姜葉柯總黃酮吸光度呈平穩趨勢，說明在食品添加劑允許使用的濃度范圍內，山梨酸鉀、苯甲酸鈉、L-抗壞血酸和檸檬酸對木姜葉柯總黃酮的穩定性影響較小，這和有關報道相似[15]。

圖6 食品添加劑對木姜葉柯總黃酮穩定性的影響

2.7 糖類對木姜葉柯總黃酮穩定性的影響

從圖7可以看出，2%～10%不同濃度的蔗糖和葡萄糖對木姜葉柯總黃酮吸光度影響均較小，黃酮的穩定性良好，有文獻[19]表明白糖對黃酮有一定的保護作用，可能原因是白糖含量增加，溶液中含氧量隨之降低，繼而抑制了黃酮的氧化分解。

圖7 蔗糖和葡萄糖對總黃酮穩定性的影響

2.8 金屬離子對木姜葉柯總黃酮穩定性的影響

木姜葉柯總黃酮的穩定性與溶液中的金屬離子關系較密切，在相同濃度不同金屬離子條件下的木姜葉柯總黃酮穩定性差異很大。如表1所示，K+、Na+對木姜葉柯總黃酮的穩定性基本沒有影響；Mg2+及Ca2+對木姜葉柯黃酮類化合物有較小影響；Al3+離子隨著濃度的升高對黃酮類化合物有比較大的影響，且茶湯由橙黃色變黃紅色后又逐漸消退，可能是發生了絡合顯色反應[20]；而金屬離子Fe3+、Cu2+對木姜葉柯總黃酮的穩定性有顯著影響，其中Cu2+可引發褐色絮凝沉淀，而Fe3+引起輕微渾濁并導致茶湯顏色變黑，原因可能是Cu2+與木姜葉柯總黃酮的發生絡合沉淀反應，而Fe3+與總黃酮的發生絡合顯色以及氧化還原反應[21-22]。因此，在生產、貯存及使用過程中應避免與含Fe3+、Cu2+、Al3+的容器接觸，木姜葉柯茶湯用水應盡量去除這些離子。

表1 不同金屬離子對總黃酮穩定性的影響

3 結論與討論

以木姜葉柯為原料，探究了木姜葉柯茶湯中總黃酮的加工穩定性。結果表明：隨著光照時間的增長會降低木姜葉柯茶湯中總黃酮的穩定性；木姜葉柯總黃酮在pH為6左右的弱酸性條件下比較穩定，氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3均會導致木姜葉柯總黃酮穩定性下降；食品添加劑苯甲酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和山梨酸鉀以及糖類蔗糖、葡萄糖等對木姜葉柯總黃酮穩定性影響較小；金屬離子中Na+、K+對木姜葉柯總黃酮無影響，Mg2+、Ca2+有較小影響，Al3+離子隨著濃度的升高導致木姜葉柯茶湯中的黃酮類化合物穩定性降低，而Cu2+、Fe3+可分別導致絡合反應以及絡合和氧化還原反應，對其穩定性有明顯影響。研究結論可為木姜葉柯茶飲加工提供一定的技術參考。

有研究表明，黃酮類有機分子與金屬元素絡合形成金屬配合物，不僅有可能增強其原有的活性，甚至還可能產生新的藥理作用[23]，絡合形態的黃酮相比游離態的黃酮有更強的生理活性[24]。研究發現木姜葉柯黃酮與Cu2+極易生成絡合物沉淀，未來將對木姜葉柯黃酮的金屬絡合純化法和木姜葉柯黃酮-金屬離子絡合物的抑菌活性等做進一步研究。