改進的QuEChERS-UPLCMSMS測定姜中32種氨基甲酸酯類農藥

唐翩翩，支紅峰*，朱玉真

永康市食品藥品檢驗檢測中心（永康 321300）

氨基甲酸酯類農藥是三大農藥種類之一，隨著諸多劇毒有機磷和有機氯農藥的逐步禁用，氨基甲酸酯類農藥在蔬菜上的應用占比越來越高[1]，雖然殺蟲效果顯著，但是有急性毒性作用，在農產品中的殘留會對人畜危害嚴重[2-3]。其前處理方式主要包括：固相萃取、在線固相萃取、基質固相分散萃取、凝膠滲透色譜、加速溶劑萃取和QuEChERS法[4-5]等。其中QuEChERS法有著明顯的效率和經濟方法的優勢。但是它凈化效果相對不好，基質效應強。目前關于QuECh-ERS法基質效應的研究較多，但是對于消除基質效應的研究較少[6]。應用QuEChERS檢測果蔬農殘的國家安全標準和文獻，定量方式均為基質標定量。文章計劃優化方法條件，并結合稀釋，建立一種溶劑標定量的方法，增加方法的適用性和便捷性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

標準物質：滅多威，丁硫克百威，異丙威，甲硫威，三羥基克百威，殺線威，呋線威，猛殺威，硫雙威，惡蟲威，乙硫苯威，苯氧威，涕滅威等32種農藥均為100 μg/mL，購自農業部環境保護科研監測所。

試劑：乙腈、甲醇（色譜純，美國默克公司）；甲酸（質譜級，美國Sigma公司）；乙酸銨（質譜純，美國Sigma公司）；水（屈臣氏）；提取包（6 g無水硫酸鎂，1.5 g乙酸鈉）；凈化管[a）50 mg C18，50 mg PSA，150 mg MgSO4；b）50 mg PSA，50 mg GCB，150 mg MgSO4；c）25 mg PSA，2.5 mg GCB，150 mg MgSO4；d）50 mg PSA，150 mg MgSO4]：博納艾杰爾科技有限公司；生姜（市售）。

LC-30AD/API 5500高效液相色譜-串聯質譜儀（島津液相/美國AB質譜）；BSA822電子天平（德國賽多利斯股份公司）；Allegra 64R冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；E0F0-945066多管漩渦混合器（美國Talboys）；K600食品加工機（德國博朗）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

1.2.1.1 溶劑標的配制

將標液用色譜級甲醇溶解稀釋并定容成10 μg/mL，冷藏保存（0～4 ℃）。使用前配制成不同濃度的混合標準工作液。

1.2.1.2 基質標的配制

取空白樣品，按照1.2.2小節前處理方式，取得上機液。按照不同的稀釋比，用甲醇稀釋，配制基質標。

標液過0.22 μm PTEF濾膜上機。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取15 g（精確至0.01 g）均質后的樣品于干凈離心管中，放入一顆均質子，加入15 mL乙腈。用多管渦旋混合器按2 500 r/min振蕩20 min，加入提取包，振蕩2 min后，按8 000 r/min離心5 min。取1 mL上清液，加入凈化管中，用多管渦旋混合器渦旋凈化1 min，按4 000 r/min離心。將離心后上清液，按照稀釋比用甲醇稀釋處理。處理后上清液過0.22 PTEF濾膜待上機。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODSⅢ 2.0 mm×150 mm，2.2 μm；水相流動相（流動相A）：0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨；有機流動相（流動相B）：甲醇；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；梯度洗脫程序：流動相A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為甲醇；初始流動相1% B，1 min 35% B，6～10 min 37% B，7 min 45% B，23～26 min 98% B，26.1～29 min 1% B，29.1 min STOP。

1.2.3.2 質譜條件

正離子模式，離子源：ESI；噴霧電壓（IS）：5 500 V；霧化器壓力（GS1）：45 psi；氣簾氣壓力（CUR）：38 psi；輔助氣壓力（GS2）：45 psi；離子源溫度（TEM）：500 ℃。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 液相色譜條件的選擇

2.1.1.1 流速和梯度的調整

32種農藥均為氨基甲酸酯類農藥，有較多的同分異構體，如涕滅威和丁酮威、丁酮威砜和涕滅威砜等。為了更好地分離，使用了1%的有機相作為初始流動相，同時在1～7 min采取了比較緩和的梯度，便于涕滅威和丁酮威的分離。最終確定表1的梯度洗脫方案，并考察了流速，比較了0.2和0.3 mL/min的流速，采用了分離效果較好的0.2 mL/min的流速。

2.1.1.2 進樣體積

在同樣的條件下，進樣體積越小，目標物更易得到較高的離子化程度，使得基質效應更低[7]。較高的進樣量也會增加溶劑效應。經試驗總結，確定進樣體積為2 μL。

2.1.2 質譜參數的優化

針泵進樣，優化出農藥的子母離子、儀器參數等。根據備選子離子的受干擾和實際響應情況，對備選的子離子進一步篩選，確定檢測用子離子。涕滅威和殺線威選用[M+NH4]+。文章還考察了丁酮威的[M+NH4]+和[M+Na]+。在該文條件，丁酮威的[M+Na]+的子離子與[M+NH4]+的子離子相比，響應更好，且被涕滅威子離子干擾較小。故丁酮威選擇了[M+Na]+為檢測母離子。優化后的質譜參數見表1。32種氨基甲酸酯類總提取離子色譜圖見圖1。

圖1 32種氨基甲酸酯類總提取離子色譜圖

表1 質譜參數表

接表1

2.2 前處理條件優化

2.2.1 凈化方式的選擇

QuEChERS凈化材料有GCB，PSA，C18。C18凈化劑屬于反相吸附劑，可以除去脂肪、類脂。PSA凈化劑可以有效去除樣品中脂肪酸、某些極性親脂性色素、蠟質和糖類等。而GCB可以吸附平面結構的色素和甾醇，在吸附色素方面，有另外兩種凈化材料不可比擬的效果。試驗取1 mL提取液凈化，考察了四種凈化方式：a）50 mg C18，50 mg PSA，150 mg MgSO4；b）50 mg PSA，50 mg GCB，150 mg MgSO4；c）25 mg PSA，2.5 mg GCB，150 mg MgSO4；d）50 mg PSA，150 mg MgSO4。

對試驗結果分析后發現，從回收率上看，a凈化管與d凈化管相比回收率普遍較差，這表明C18對氨基甲酸酯類農藥存在明顯吸附，與馮婉瑩等[5]研究結果相同。GCB凈化效果明顯，它的添加會提高響應比較差（如久效威）的農藥的回收率和重復性。圖2是姜中久效威四種凈化方式的效果圖。凈化方式b定量離子的信噪比最高，而凈化方式a和d在凈化后仍有干擾。

圖2 姜加標樣品在四種（a、b、c、d）凈化方式處理后的久效威兩個提取離子（219.1/57.0，219.1/76.0）提取離子圖

四種凈化方式的回收率如圖3所示。

圖3 四種凈化方式凈化姜的加標回收率

GCB是把雙刃劍，它也會吸附平面結構的農藥[8]。文章發現GCB對姜中平面結構農藥有吸收。但是吸收與GCB的含量有關，且對回收率的影響與其他基質相比較少，這可能是因為姜中平面結構基質（色素等）較多。平面結構的基質對農藥起到了保護作用，減少了GCB對平面結構農藥的吸附。綜合SRSD值考慮，選擇了c作為篩查方法的凈化方式。

2.2.2 稀釋倍數

根據液質的原理，稀釋會降低農藥的基質效應[9]。文章嘗試通過稀釋減少農藥基質效應。試驗嘗試了稀釋5倍和稀釋25倍，結果如圖4所示。

由圖4可以看到。稀釋5倍回收率變化明顯。稀釋25倍大多數農藥回收率變化不大。稀釋同樣使得農藥的SRSD值變小。

圖4 稀釋倍數對農藥回收率的影響

2.3 方法學評價

對32種農藥進行3個濃度水平的加標試驗，每個濃度水平重復6次，具體數據見表2。表2中的標準曲線為溶劑標曲，加標數據為溶劑標定量結果。表2中的定量限是結合加標樣品和基質標曲中農藥定量離子響應，以信噪比（rSN）為10，確定方法的定量限。

表2 32種農藥在生姜基質加標的平均回收率，相對標準偏差，線性方程和定量限（n=6）

丁酮威和久效威在50，75和100 μg/kg加標。丁酮威回收率75.20%～109.65%，SRSD為7.50%～10.59%，定量限為1.7 μg/kg。久效威回收率在72.64%～80.23%之間，SRSD在8.5%～14.77%之間，檢出限為30 μg/kg。

在試驗條件下，三種基質中32種農藥的平均回收率（63.06%～109.65%）和SRSD（2.08%～14.77%）均滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[10]的要求。溶劑標和基質標，呈現良好的線性，相關系數＞0.99。除久效威外其余農藥在10 μg/kg回收率均在80%以上，65%的農藥在10 μg/kg加標回收在90%以上。32種農藥的定量限，除久效威為20 μg/kg，其余農藥均在0.05～1.8 μg/kg。

試驗結果表明，相應農藥的定量限小于文獻中傳統QuEChERS方法的定量限。許文娟等[11]對5種蔬菜17種氨基甲酸酯類農藥進行檢測的定量限是2.7～5.5 μg/kg。馮婉瑩等[5]檢測菠菜中五種氨基甲酸酯類農藥定量限在0.25～0.5 μg/kg。文獻同時提到不采用基質校正，回收只有40%～50%。久效威定量限為30 μg/kg，也小于文獻中的王連珠等[12]方法的定量限50 μg/kg。陳俊秀等[12]檢測了胡蘿卜中五種氨基甲酸酯類農藥，定量限為3～16 μg/kg。這主要是因為液質的基質效應多為基質抑制[6,11]。五倍稀釋后，信噪比的降低要小于稀釋倍數。方法條件的優化和儀器靈敏度的提高，也是定量限降低的原因。采用稀釋方法，也會因為干擾濃度減少，使得SRSD值略小。陳俊秀等[13]檢測的5種農藥的SRSD值為12.01%～15.02%，文章相應農藥的SRSD值為2.18%～9.89%。其他農藥，如丁酮威及其代謝物、茲克威等，文獻中對其檢測方法的研究較少，但是其均為曾廣泛使用，但目前被歐盟等禁用的農藥。其檢測數據表明，方法能滿足它們的檢測需要。

目前在果蔬農藥多殘留檢測中，QuEChERS方法須通過基質標校正基質效應。基質對農藥的影響各不相同。在篩查時，選擇有代表性的基質配制基質標，比較困難。雖然有研究通過試驗數據建議在果蔬農殘監測中選擇某種樣品作為代表基質，但是這種試驗多有其局限性[6]，無法達成定論。Ferrer等[9]的研究發現稀釋15倍，其研究中的65%的農藥基質效應可忽略不計。但是早期儀器的靈敏度不足，限制了該方法的應用。

文章的試驗結果表明：在目前的儀器條件下，通過優化試驗方法和稀釋減少基質效應，已經具備可行性。隨著儀器靈敏度的提高，稀釋法降低基質效應，以其通用性和簡便性必將是未來校正基質效應的趨勢。

2.4 實際樣品的檢測

檢測了本地20批生姜樣品，結果均未檢出。將方法擴展應用于日常檢測中出現的三個韭菜和二個辣椒中克百威陽性樣品的檢測，兩個平行樣品的相對偏差＜10%，回收率＞90%。

3 結論

文章建立了QuEChERS-LCMSMS測定姜中32種氨基甲酸酯類農藥殘留檢測的方法。方法采用改進的QuEChERS方法處理，溶劑標定量。該方法具有檢出限低、重復性好、操作簡便的優點，可以滿足基層地區農藥殘留量篩查的需要。文章選用姜這種富含硫化物的蔬菜，基質在果蔬中較為復雜[11]。32種農藥也有一定的代表性。文章證明了稀釋降低基質效應方法的可行性，為降低基質效應提供了新的思路。