新疆部分地區奶牛乳房炎大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

賈立敏，蔡擴軍，2＊

1 烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063

2 新疆農業大學動物醫學學院，新疆烏魯木齊 830052

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛場最常發、最難治，也是危害最大的疾病之一，不僅使產奶量下降，而且影響牛奶質量，帶來了食品安全和公共衛生安全隱患，每年給全球奶牛養殖業造成的經濟損失高達數百億美元[1]。引起奶牛乳房炎的病原菌包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、肺炎克雷伯菌等，其中大腸桿菌屬于人畜共患的條件性致病菌，不但分離率高，而且耐藥性強，給奶牛乳房炎的防治帶來了困難[2，3]。隨著新疆奶牛養殖業的快速發展，奶牛養殖規模不斷擴大，截至2021年現存奶牛數超過220萬頭，已經成為我國重要的奶業基地之一[4]，奶牛乳房炎的防治成為必須要解決的重要問題[5]。為此，本研究采集了新疆5 個地州（市）5 個規模化奶牛場患有乳房炎的乳液樣品，并在實驗室開展大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗，為大腸桿菌引起的奶牛乳房炎的防治及奶牛產業的高質量發展提供技術支撐。

1 材料

1.1 樣品來源

分別在新疆烏魯木齊、伊犁、喀什、阿克蘇、巴州5 個地區的5 個規模化奶牛養殖場采集200 份患有臨床型和隱性乳房炎的奶牛乳液樣品。

1.2 主要試劑及儀器

Mueller-Hinton瓊脂（MHA）、伊紅美藍瓊脂（EMB）、EC肉湯，青島海博生物技術有限公司；細菌藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司；大腸桿菌通用型熒光PCR檢測試劑，深圳澳東檢驗檢測科技公司；大腸桿菌顯色培養基，法國科瑪嘉公司，革蘭氏染液，珠海貝索生物技術公司；熒光PCR儀、顯微鏡，賽默飛世爾科技公司。

2 試驗方法

2.1 樣品采集

以奶牛養殖場已經篩查出來的患有隱性乳房炎和臨床型乳房炎的奶牛為采樣對象。首先用消毒液對奶牛的乳房和乳頭進行清洗及消毒，然后棄去每個乳頭的前3 把奶，最后無菌操作將奶樣擠入采樣瓶中，做好標記，低溫運送至實驗室。

2.2 細菌分離培養

2.2.1 增菌

在生物安全柜中取25 mL奶樣放入三角瓶中，再加入225 mL EC肉湯，放入37 ℃培養箱中培養18～24 h。

2.2.2 分離

將增菌后的EC肉湯用接種環在伊紅美藍瓊脂（EMB）平板上劃線，隨后放入37 ℃培養箱中再培養18～24 h，觀察平板上生長的菌落形態。

2.2.3 顯色鑒定

將伊紅美藍瓊脂（EMB）平板上疑似大腸桿菌的菌落，再次在大腸桿菌顯色培養基上劃線，放入37 ℃培養箱中再次培養18～24 h。

2.3 革蘭氏染色鏡檢

在無菌載玻片上滴入1～2 滴滅菌水，將大腸桿菌顯色培養基上疑似陽性的單個菌落挑取至載玻片上混勻，火焰固定，按照革蘭氏染色液試劑盒說明書中初染、媒染、脫色、復染四個步驟進行革蘭氏染色，最后將載玻片放入顯微鏡下鏡檢。

2.4 熒光PCR鑒定

2.4.1 DNA模板的制備

從符合大腸桿菌鏡檢特征的平板中，挑取其中的目標菌落放入盛有EC肉湯的試管中，放入37 ℃恒溫搖床中培養18～24 h。利用水煮法制備DNA。吸取菌液1～2 mL于1.5 mL EP管，10 000 r/min離心2 min，棄去上清液，加入200 μL DEPC水混勻，在水中煮沸10 min，冰浴5 min，12 000 r/min離心5 min，轉移上清液于新的EP管中，即為DNA模板。

2.4.2 反應組分配制

取2 μL樣品DNA和23 μL反應體系加至反應管，反應總體積為25 μL，并且設置陰性和陽性對照。

2.4.3 PCR擴增

在熒光PCR儀上設置反應程序，預變性3 min 95 ℃、95 ℃變性5 s、65 ℃退火40 s，40 個循環。

2.5 藥敏試驗

用麥氏比濁儀將每一個菌株的濃度調至0.5麥氏濁度，然后用滅菌棉簽充分蘸取菌液，緊密的涂在MHA平板上，一般不同方向涂4 次即可，再將14 種藥敏片貼在涂布好的MHA平板培養基上，隨后將貼好藥敏片的平板培養基放入37 ℃恒溫培養箱中培養16～18 h，然后用直尺測量抑菌圈的直經，記錄結果，并按說明書及CLSI M100-2020第30版進行耐藥、敏感的判定。

3 結果

3.1 培養分離顯色結果

大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂培養基上呈現黑色中心有金屬光澤或無光澤的菌落，見圖1。在大腸桿菌顯色培養基上呈現藍綠色圓形凸起菌落，見圖2。

圖1 大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂上分離培養結果

圖2 大腸桿菌在顯色培養基上顯色結果

3.2 鏡檢結果

將染色干燥后的載玻片滴入一滴香柏油后放置顯微鏡下觀察，可以觀察到紅色的革蘭氏陰性桿菌，見圖3。

圖3 大腸桿菌的鏡檢結果

3.3 熒光PCR鑒定及結果

根據大腸桿菌通用型熒光PCR檢測試劑盒說明書進行判定，陽性樣品呈現“S”型擴增曲線。結果顯示，本次一共檢測樣品200 份，其中63 份陽性，137 份陰性，陽性率31.5%，陰陽性對照成立，結果見圖4。

圖4 大腸桿菌的熒光PCR部分檢測結果

3.4 藥敏結果

14 種藥敏片周圍出現了不同大小的抑菌圈，根據藥敏片說明書及CLSI的折點，判斷耐藥、中介和敏感，結果發現分離的大腸桿菌對青霉素的耐藥率最高，對美羅培南的耐藥率最低，見圖5。耐藥性統計結果見表1。

表1 大腸桿菌的藥敏試驗結果

圖5 大腸桿菌部分藥敏結果

4 討論

細菌的分離培養、革蘭氏染色鏡檢，并結合熒光PCR檢測是對細菌進行鑒定有效、可靠的技術方法。直接從牛乳中提取核酸，然后進行大腸桿菌的熒光PCR檢測，雖然可以節約分離培養的時間，但由于牛乳中不管死的細菌還是活的細菌都能提取出來細菌核酸，所以用這種辦法，大腸桿菌熒光PCR陽性并不確定牛乳中的大腸桿菌是否還有致病性，有可能已經失去了活性。本研究先將大腸桿菌從牛乳中培養分離出來，進行革蘭氏染色鏡檢，并開展熒光PCR檢測，這樣能保證熒光PCR陽性就是代表牛乳中存在有活性的大腸桿菌，能真實的反映奶牛乳房炎中大腸桿菌分離率和危害性。本研究奶牛乳房炎中大腸桿菌分離率為31.5%，與買爾哈巴·吾斯曼等[2]、常軍帥等[6]、劉肖利等[7]報道的分離率較為相符。

養殖環節獸用抗菌藥不科學、不合理使用導致動物源大腸桿菌的耐藥性不斷增加，不但造成治療效果不佳，增加養殖成本，而且給公共衛生安全帶來了嚴重威脅，已經引起政府相關部門及專家學者的廣泛關注，并制定了一系列強有力的舉措[8]。2016年我國發布了《遏制細菌耐藥國家行動計劃》，2017年原農業部印發了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃（2017—2020年），2021年4月施行了《中華人民共和國生物安全法》，將應對微生物耐藥性提高到維護國家安全的戰略高度。這些重大措施充分體現了國家對遏制細菌耐藥性、保障人民健康的決心。本研究中，從奶牛乳房炎分離的大腸桿菌對青霉素、氨芐西林、鏈霉素、多西環素、慶大霉素、復方新諾明的耐藥率分別為93.65%、73.01%、53.96%、39.68%、31.74%、31.74%，對其他8 種抗菌藥的耐藥率均低于30%，其中對美羅培南的耐藥率最低為1.58%。同一地區分離的大腸桿菌對不同抗生素的耐藥率不同，不同地區分離的大腸桿菌對同種抗生素的耐藥性也不同，這與平時治療、預防奶牛疾病用藥直接相關，應通過藥敏試驗科學規范合理選用抗菌藥物，避免盲目用藥。值得注意的是，在全國“減抗、替抗”的大背景下，中草藥等產品已經逐漸成為防治奶牛乳房炎，尤其是隱性乳房炎的主流。

5 小結

本研究對新疆部分地區奶牛乳房炎大腸桿菌開展了分離培養鑒定及藥敏試驗，結果顯示奶牛乳房炎中大腸桿菌廣泛流行，具有較高的耐藥性，提醒養殖者應采取積極措施預防大腸桿菌性奶牛乳房炎，并科學、合理使用抗菌藥物。