骨巨細胞瘤中H3F3A G34W 蛋白表達陰性病例的基因突變類型分析*

龍亞康，王蘇杰，王芳，馬偉峰，吳小延

510515 廣州，南方醫科大學 公共衛生學院（龍亞康、馬偉峰）；510060 廣州，中山大學腫瘤防治中心分子診斷科（龍亞康、王蘇杰、王芳、吳小延）

骨巨細胞瘤（giant cell tumor of bone， GCTB）是一種溶骨性腫瘤，占所有原發性骨腫瘤的4% ～ 5%，約占良性骨腫瘤的20%［1］，多發于青壯年（20 ～ 55歲）四肢長骨骨端［2-3］，兒童及青少年發病率較低，約為1.8% ～ 10.6%［4］。該病男性多見，男女發病率為（1.1 ～ 1.5）∶1.0［5］。組織學上，GCTB 以單核基質細胞為特征，核圓形至梭形，有單核巨噬細胞樣細胞和破骨細胞樣多核巨細胞。部分單核基質細胞表現出成骨細胞前體表型，這些細胞被認為是GCTB的腫瘤細胞，而單核巨噬細胞樣細胞和破骨細胞樣多核巨細胞則被認為是非腫瘤成分［6-7］。GCTB 有時會表現出繼發性變化，例如動脈瘤樣骨囊腫（aneurysmal bone cyst，ABC）變化、泡沫狀組織細胞聚集和反應性骨或軟骨質形成。GCTB 需要與來自各種類型的具有破骨性巨細胞的骨病變區分，包括軟骨母細胞瘤、非骨化性纖維瘤、棕色腫瘤（甲狀旁腺功能亢進）、巨細胞修復性肉芽腫、原發性 ABC 和骨肉瘤，尤其是巨細胞豐富型腫瘤。

組蛋白H3.3 由位于不同位點的兩個基因編碼：1 號染色體上的H3F3A 和17 號染色體上的H3F3B。先前的一項研究揭示了GCTB 中頻繁發生H3F3A p.G34W 突變及軟骨母細胞瘤中的H3F3B p.K36 M 突變［8］。隨后的研究表明，大約85%到95%的GCTB 攜帶H3F3A p.G34W 突變，并且一小部分（約1% ～ 2%）攜 帶H3F3A p.G34L、p.G34M、p.G34R 或p.G34V 突變［9-11］。抗H3.3 G34W 突變抗體現在可用于免疫組織化學染色，但無法用于其他罕見突變［12］。在本研究中，我們對15 例經免疫組織化學染色評估H3F3A G34W 蛋白的表達為陰性的GCTB 病例進行H3F3A DNA Sanger 測序分析，探討H3F3A G34W 蛋白陰性表達的GCTB 中H3F3A 的突變類型，為這些突變的診斷意義提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2017 年1 月至 2022 年8 月中山大學腫瘤防治中心收治的確診為GCTB 的15 例患者， 經免疫組織化學染色評估H3F3A G34W 蛋白表達均為陰性。患者腫瘤組織通過活檢、刮除或切除獲得，采用中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋。15 例GCTB 中，男7 例，女8 例，男女比例為1∶1.14，年齡15 ～ 55 歲。GCTB 的診斷均符合2013 年世界衛生組織軟組織和骨腫瘤的組織形態診斷標準、臨床特征、影像學特征及基因檢測等結果。

1.2 免疫組織化學染色方法

免疫組織化學染色使用4 μm 厚福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片進行。免疫組織化學采用EnVision 二步法，一抗 H3.3 G34W 兔單克隆抗體（SD350）購自通靈公司（稀釋度 1∶400），二抗購自英國徠卡公司。同時設陰性及陽性對照。使用Leica 全自動免疫組化儀（Leica Microsystems Nussloch GmbH）對H3F3A G34W 進行免疫組化染色評估。

1.3 H3F3A 突變分析

進行PCR 和Sanger 測序分析以檢測H3F3A 中的基因突變。對福爾馬林固定和石蠟包埋組織的標本，使用 QIAamp DNA FFPE Tissue 純化試劑盒（FFPE DNA Kit 試劑盒， QIAGEN 公司），根據試劑盒說明書，從組織標本中分離基因組DNA （gDNA）。對于每個樣品，添加180 μL 裂解緩沖液和20 μL蛋白酶K 消化。渦旋混勻后，將樣品在56℃的金屬浴中孵育過夜。再經過核酸純化，洗脫獲得DNA。通過NANO 2000 對從 FFPE 樣本中獲得的DNA進行定量和定性分析，以確定濃度和純度。僅當A260/A280 比值大于1.8 時，才認為 DNA 適合分子分析。PCR 反應體系：2×Premix EX TapTM 12.5 μL，10 μmol/L 擴增引物，60 ng DNA 模板及5.5 μL去離子水。PCR 擴增程序：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共32 個循環；72℃ 5 min，4℃保溫。用于PCR 和測序的引物為：H3F3A 上游引物（GGCTCGTACAAAGCAGAC）； H3F3A 下游引物（CAGTACATTTATTTAAGCAGTAG）。 測 序 由 ABI 3500 XL 遺傳分析儀進行。使用NCBI 數據庫“國家生物技術信息數據庫中心”（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST） 中 的 Basic Local Alignment Search Tool （BLAST） 進行突變分析。

1.4 高通量測序

利用蘇州吉因加生物醫學工程有限公司 Gene+Seq 2000 測序儀進行測序。將基因組DNA 經超聲波打斷成 200 bp 左右的片段后，進行末端修復加堿基A，加上接頭，通過PCR 擴增制備成文庫；將樣本文庫與探針雜交捕獲，洗脫，PCR 富集目標DNA 片段，制備DNA 納米球，加入到測序芯片上，進行高通量測序；對測序結果進行生物信息分析，得出結果。

2 結 果

2.1 H3.3 免疫組織化學結果

GCTB 病變由單核細胞和破骨細胞樣多核巨細胞組成。單核細胞顯示H3.3 G34W 的核表達，本研究15 例GCTB 中所有病例腫瘤細胞皆為陰性（圖1A、B）。

2.2 Sanger 測序結果

通過 Sanger 測序，對15 個H3F3A G34W（p.Gly34Trp，NM_002107.4）位點免疫組織化學呈陰性的病例，進行DNA 測序分析。結果顯示10 例存在少見型的突變，分別為：1 例G34R（c.103G ＞ C，Gly 34 Arg，NM_002107.4，1/15，6.7%）（圖1C），2 例 G34V

（c.104G ＞ T，Gly 34 Val，NM_002107.4，2/15，13.3%）（圖1D），7例G34L（c.103G ＞ C /104G ＞ T及c.103G ＞ T/104G ＞ T ，Gly 34 Leu，NM_002107.4，7/15，46.7%）（圖1E、F），其余5 例均為野生型（Gly 34，5/15，33.3%）。另外，G34L 有兩種不同的堿基突變形式GGG ＞ CTG及GGG ＞ TTG。未發現有 G34W（c.103G ＞ T，p.Gly-34Trp，NM_002107.4）的突變形式。

圖1 骨巨細胞瘤H3F3A 免疫組織化學及基因突變檢測結果Figure 1．Results of Immunohistochemistry and Gene Mutation of H3F3A in Giant Cell Tumor of Bone

2.3 高通量測序法驗證Sanger 測序野生型的標本

本研究中，共有5 例Sanger 測序為野生型的樣本，我們對其中3 例進行高通量測序驗證，其余 2 例因核酸質量不足而無法進行進一步驗證。結果發現，3 例原本是Sanger 測序野生型的標本，高通量測序結果仍為野生型（圖 2）。

圖2 骨巨細胞瘤H3F3A 高通量基因檢測結果Figure 2．High Throughput Gene Detection Results of H3F3A in Giant Cell Tumor of Bone

3 討 論

在GCTB 中，以往研究在位于染色體1q21 上的H3F3A基因里發現了雜合性的特定突變，編碼蛋白質組蛋白H3.3［10］。這些突變可在 92% 的GCTB中檢測到，并且僅存在于具有成纖維細胞樣外觀的腫瘤細胞群中，而不存在于巨細胞及其前體細胞中［12-13］。突變頻繁發生于編碼甘氨酸34 號密碼子的103 位堿基。組蛋白 H3.3 的改變可能通過改變破骨細胞 RANKL（核因子Kappa-B 受體活化因子配體）的基本信號的表達導致破骨細胞激活異常［14-15］，從而影響GCTB 的發展。

在骨吸收抑制劑denosumab 治療后，GCTB 可能出現一系列形態變化，與治療前差距較大，denosumab 治療后的GCTB 特征包括OLGC 缺失、病變內大量骨沉積和膠原基質，以及無核梭形細胞取代單核腫瘤細胞的增殖，這些細胞在形態學上與GCTB幾乎沒有相似之處［16-17］。如果不了解denosumab 的先前治療，這部分GCTB 可能被誤診為良性纖維骨病變或骨肉瘤等骨腫瘤［18-19］。因此，H3F3A 突變的分子檢測對于 GCTB 與其他骨腫瘤的鑒別診斷具有重要的意義。

GCTB 中H3F3A 的突變檢測，以往研究顯示［12-13］，可以使用免疫組織化學和單克隆兔抗體，該抗體靶向組蛋白3 上的突變位點G34W。該抗體檢測H3F3A 突變的GCTB 時，單核細胞群表現明顯強核染色，而包括破骨巨細胞在內的所有其他細胞核均為陰性。免疫組織化學是一種易于應用的方法，但使用該抗體的局限性在于它只能檢測最常見的Gly34Trp 突變，少數GCTB 含有其他無法通過該方法檢測的 Gly34 突變。 此外，應仔細考慮含有骨碎片的樣品，因為抗原結構可能會受到脫鈣過程的影響。

研究顯示，一小部分 GCTB（1% ～ 2%）具有 H3-F3A p.G34L、p.G34M、p.G34R 或 p.G34V 突變［9-11］。Yamamoto 等［20］研究發現，原發性GCTB 免疫組化H3.3 G34R 陽性并伴有 H3F3A p.G34R 突變，及 H3.3G34V陽性并伴有 H3F3A p.G34V 突變，而所有 H3.3 G34W陽性的 GCTB 和非 GCTB 病變的 H3.3 G34R 和 G34V的免疫組織化學均為陰性。這些結果表明，除 H3.3 G34W 外，H3.3 G34R 和G34V 的免疫組織化學染色可能是 H3F3A 基因型診斷 GCTB 的高度特異性替代標志物。然而，有文獻指出，H3.3 G34V 抗體和G34L突變蛋白之間會出現交叉反應，會成為診斷GCTB 的一個潛在陷阱，同時指出，H3G34 突變特異性抗體并不是腦腫瘤中H3.3 突變的完美替代物［21］。

我們采用Sanger 測序對15 例H3F3A G34W蛋白表達為陰性的GCTB 病例進行檢測驗證基因突變類型，發現其中10 例GCTB（10/15，66.7%）有G34R/V/L 罕見的突變類型。之前有研究顯示［22］，免疫組織化學和Sanger 測序兩種方法結果一致的比例為 86%（43/50），而結果不一致的比例為14%（7/50）。對于不一致的樣本，有的樣本通過Sanger測序檢測為野生型，而通過免疫組織化學檢測出c.103 G ＞ T 突變陽性，反之亦有。 這種差異可能是由于 Sanger 測序的敏感性低。通常，至少需要20%的腫瘤樣本攜帶該突變，Sanger 測序才會檢測到突變的等位基因，而免疫組織化學方法只需要部分細胞即可檢測出來。對于無法通過免疫組化或Sanger 測序獲得結果的病例，可以使用下一代測序方法進一步進行檢測驗證。免疫組織化學靈敏且快速，可在數小時內完成診斷，對大多數情況很有用，因為c.103G ＞ T， p.Gly34Trp （NM_002107.4，NP_002098.1）覆蓋了大約92%的陽性，如果免疫組化結果為陰性，可以進行 Sanger 測序進行驗證分析。

本研究中，有5 例標本H3F3A G34W 蛋白表達和Sanger 測序結果均為陰性，由于免疫組化抗體種類受限，只能檢測G34W 蛋白突變類型，而一代測序的靈敏度相對比較低，只能檢測腫瘤細胞含量20%以上的突變，因而致低頻突變容易產生誤診。鑒于以上兩種方法會有漏檢的情況，本研究對5 例野生型標本進行高通量測序，2 例標本因核酸質量不足而無法進行進一步驗證，剩余3 例標本高通量測序結果仍為野生型。高通量測序因其靈敏度高，近幾年在各種突變檢測中不斷被開發利用，對低頻突變尤其占優勢。

綜上所述，通過免疫組織化學和Sanger 測序分析15 例 GCTB 病例，我們證明Sanger 測序是一種準確可靠的方法，可識別 c.103G ＞ T （G34W） 和c.103G ＞ C （G34R）等多種GCTB 中的H3F3A 基因突變形式。Sanger 測序似乎更準確，因為Sanger測序可以識別免疫組織化學陰性的病例。免疫組織化學可以用作第一種方法，它既快速又具有成本效益，同時具有高特異性和靈敏度。以上兩種方法可以用于初步檢測，但是，當檢測結果為陰性或弱陽性時，建議使用高通量測序驗證。

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