基于同源重組的CRISPR 精準基因編輯技術及其在農作物育種中的應用

江桐欣，李曉琳，朱慶鋒，張 琪，張愛霞，劉勤堅，于 洋，劉文華

（1.廣東省農業科學院農業生物基因研究中心/廣東省農作物種質資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.仲愷農業工程學院農業與生物學院，廣東 廣州 510225）

成簇的有規律間隔的短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其關聯蛋白（CRISPR associated，Cas）是細菌和古細菌的獲得性免疫體系。自CRISPR 體系被改造成以RNA 為導向、以Cas蛋白為效應蛋白的可程序化設計的核酸酶后，便取代以往的鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）和轉錄激活子類效應子核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN），成為基因編輯領域最常用的工具。在農業領域中，CRISPR基因編輯通常用來敲除基因，達到驗證基因功能或創制新種質的目的。CRISPR 核酸酶在基因位點產生的雙鏈切口（DNA double strand break，DSB），經非同源末端連接修復（Non-homologous end joining，NHEJ）后，在切口處往往插入或缺失一定數目的核苷酸，引起移碼突變而提前出現終止密碼子，從而使基因編碼產物失去正常功能。因為插入或缺失的核苷酸完全是隨機性的，因而CRISPR基因敲除是一種非精準的基因編輯。但是，經過長期馴化形成的作物精英品種，往往會丟失一些優良基因，而要從野生種或者地方品種中引入無遺傳拖拽（Genetic drag）的優良基因，需要在精英品種基因組的安全位點進行基因插入或等位基因位點進行基因替換。與CRISPR 介導的基因敲除相比，CRISPR 介導的基因插入和基因替換屬于更為精準的基因編輯，是實現基因編輯自由的終極目標。

CRISPR 精準基因編輯包括單堿基編輯（Base editing，BE）、引導編輯（Prime editing，PE）和基于同源重組（Homologous recombination，HR）的基因插入或替換。單堿基編輯是對堿基C 或A進行置換產生T 或G 的編輯［1-6］，引導編輯是對任意數個到幾十個核苷酸進行突變、插入或替換的編輯［7-8］。由于單堿基和引導編輯利用的脫氨酶和逆轉錄酶被限制在CRISPR 產生的雙鏈切口附近，因而只能對切口附近的一個至數十個堿基進行編輯，不能滿足長片段的插入或替換。基于同源重組的CRISPR 精準編輯，即基因打靶（Gene targeting，GT），可在CRISPR 靶位點產生雙鏈切口后，在含有靶位點同源序列的供體DNA 或RNA 存在的情況下，利用細胞內在的同源定向修復（Homology directed repair，HDR）機制，在靶位點進行DNA 大片段的插入或替換。本文從HDR 修復機制、CRISPR 組分（Cas9/12和sgRNA/crRNA）及修飾、供體DNA/RNA 及修飾、CRISPR 組分和供體DNA/RNA 在植物遺傳轉化中的遞送等方面進行綜述，并對基于同源重組的CRISPR 精準基因編輯技術在農作物基因功能分析和新技術育種中的應用前景進行展望。

1 DNA 雙鏈切口同源重組修復

1.1 SDSA 途徑介導的同源重組修復

在植物中，DNA 產生雙鏈切口（DSB）后，細胞中存在兩種主要修復機制，即非同源性末端連接修復（NHEJ）和同源定向修復（HDR），且發生NHEJ 的概率遠遠高于HDR［9-11］。合成依賴鏈退火（Sequence-dependent strand anneling，SDSA）途徑是植物體細胞中主要的基于同源重組的修復機制，其過程如下：基因組DNA 產生雙鏈切口后，在MRN 復合體（Mre11、Rad50、Nbs1）等的作用下形成3'突出末端。在含有與3'突出末端同源的外源供體DNA 存在的情況下，突出末端侵入供體DNA，與供體DNA 同源臂互補配對，并以供體DNA 為模板合成DSB 缺失部分核苷酸，當合成到另一個同源臂時脫離供體DNA，返回與基因組DNA 另一條鏈退火配對，這樣外源供體DNA 替換DSB 處的基因，或在DSB 處插入新的基因（圖1A）。此途徑中CtIP、RAD52、RAD54 等蛋白起到關鍵作用［12-14］。在植物減數分裂形成配子時，有一條與SDSA 途徑前半部分重疊的特殊同源重組修復途徑，稱為雙鏈切口修復（Double-strand break repair，DSBR），雙鏈切口修復除在切口處產生基因的插入或替換外，有時也會產生基因的交換和重組［15］。

圖1 DNA 雙鏈切口同源重組修復Fig.1 DNA double-strand break（DSB）repair via homology recombination

1.2 NHEJ 輔助的SSA 途徑介導的同源重組修復

DNA 產生雙鏈切口后，如果在切口兩側出現重復序列，細胞會采用單鏈退火修復（Singlestrand annealing，SSA）連接兩個斷口。SSA 的修復過程如下：在MRN 復合體等的作用下，形成3'突出末端，切口兩側的3'突出末端在重復序列處退火配對，切除不配對的近3'末端序列，最后在連接酶的作用下形成丟失重復序列之間序列的DNA［16］。有別于微同源介導的末端連接（Microhomology mediated end joining，MMEJ），SSA 最短同源序列的長度一般在63～89 bp［17］。在植物中，RAD51 家族蛋白XRCC2、RAD51B 和RAD51D 在SSA 途徑中起著重要作用［18］。

借助NHEJ 修復，SSA 也可被用于在基因組中插入或替換DNA 片段［19］，其過程如下：在細胞中引入含有待插入或替換序列和DSB 一側同源序列的供體DNA，當基因組DNA產生雙鏈切口后，依賴NHEJ 途徑，使供體DNA 無縫插入在DSB 處，并重構DSB 位點。當再次產生DSB 后，SSA 修復機制發生作用，最后實現DNA 序列的插入或替換（圖1B）。

2 用于同源重組精準基因編輯的CRISPR 核酸酶

2.1 Cas 及融合蛋白

Cas 蛋白是CRISPR 基因編輯系統的核心組分，這類來自細菌和古細菌病毒免疫系統的蛋白，自從被改造為基因編輯工具后，在植物基因插入或替換中便得到廣泛應用。Li 等［20］用Cas9 和供體DNA 在煙草原生質體中獲得9%的基因打靶（Gene targeting，GT）效率，但在擬南芥原生質體中未獲得成功。Li 等［21］利用Cas9 和供體DNA對水稻內源的除草劑敏感基因5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因進行替換，效率為2.0%。Shi 等［22］利用Cas9 和供體DNA 在玉米中進行基因替換和插入，其效率分別為1%和2.5%～4.1%。Wolter 等［23］利用Cas12 和供體DNA在擬南芥中進行基因打靶，效率為1.47%。Vu 等［24］利用Cas12 和供體DNA 在番茄中也成功進行基因打靶，其效率因光照和溫度的變化而變化，介于6%～10%。

使用原始的Cas9 和供體DNA 進行基因打靶，雖然其效率在不同植物中有所不同，但一般都在5%以內，還有許多提升空間。考慮到DNA 雙鏈切口重組修復途徑中的一些關鍵蛋白以及Cas9 和供體DNA 的共位性（Colocalization）可能對HDR效率提高產生的影響，近年來相繼出現許多Cas9融合蛋白（圖2）。CtIP 在DSB 修復早期與5'端切除有關，開啟了基于同源重組的SDSA 途徑。在動物中，Charpentier 等［25］采用Cas9-CtIP 融合蛋白將基于同源重組的轉基因整合效率提高近2 倍。在HDR 途徑中，RAD52 有助于3'突出末端侵入供體DNA，Shao 等［26］利用RAD52-Cas9融合蛋白，將人細胞和豬細胞中同源重組效率分別提高3 倍和2.2 倍。根據動物和植物HDR 途徑的相似性，在植物中使用Cas9-CtIP 和Cas9-RAD52 也有可能提高HR 效率。與該推論一致的是，在楊樹中過量表達CtIP 并同時抑制NHEJ途徑，可使基于同源重組的基因敲入效率提高48%［27］。除此類HDR 途徑關鍵蛋白外，另一類可直接結合或催化反應后結合雙鏈或單鏈供體DNA 的蛋白或酶，也可與Cas9 形成融合蛋白，從而提高HR 效率。VirD2 是來自根瘤農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的毒性因子，能識別T-DNA 5'端邊界序列，繼而通過其松弛酶活性產生單鏈切口，并與產生的單鏈DNA 5'端共價結合，在T-DNA 由農桿菌向植物細胞轉位及其在植物細胞基因組整合過程中起著重要作用。利用VirD2 與單鏈DNA 的結合活性，Ali 等［28］使用Cas9-VirD2 融合蛋白在水稻中成功實現OsALS和OsCCD7 基因的替換以及OsHDT 基因HA 標簽的無縫整合，HR 效率與Cas9 相比提高4 倍。鏈霉親和素（Steptavidin，SA）是自然界中存在的能非共價結合4 個生物素（Biotin）分子的蛋白，水溶性的單價鏈霉親和素（mono-Streptavidin，mSA）也具有較強的生物素單分子結合活性［29］。我們實驗室采用Cas9-mSA 融合蛋白，在豬細胞基因組中進行Rosa26 位點Green1 基因的無縫整合，效率為6%，在水稻中也成功獲得OsALS基因的替換植株，HR 效率約為4%。逆轉錄子（Retron）是細菌中發現的病毒免疫相關操縱子，包括逆轉錄酶（Reverse transciptase，RT）基因和一段非編碼RNA，非編碼RNA 能被RT 逆轉錄成多拷貝單鏈DNA（Multicopy single-stranded DNA，msDNA），并形成RNA-msDNA 共價復合體［30］。Kong 等［31］在人細胞基因組中，利用Cas9-RTEMX1 和HEK3 位點進行替換，其效率高達10%。同樣，Zhao 等［32］在人基因組中，利用Cas9-RT 進行精準基因編輯，HDR 效率最高可達11.4%。借鑒動物中利用Cas9-RT 提高HDR 效率的成功經驗，在植物中利用Cas9-RT 進行精準基因編輯，有望獲得相同效果。

圖2 Cas 及融合蛋白Fig.2 Cas and fusion proteins

2.2 sgRNA/crRNA 及修飾

CRISPR 核酸酶的另一組分是與Cas 蛋白結合的小分子RNA，稱為sgRNA（single guide RNA）或crRNA（CRISPR RNA）。與Cas9 蛋白結合的是sgRNA，與Cas12 結合的是crRNA。sgRNA 包括5'端與靶序列互補配對的含20 個核苷酸的引導序列以及3'端具有莖環結構的83 個或93 個核苷酸的骨架序列（圖3）。為提高sgRNA 在細胞中的表達量和穩定性，研究者對sgRNA 進行序列和結構的優化，衍生出幾種新型sgRNA，包括U-A 堿基對換的sgRNA（sgRNA flipped）、莖環結構中配對堿基數增加10 個的sgRNA（sgRNA extended）、結合兩種修飾類型的sgRNA（sgRNA flipped and extended）［33］。crRNA 包括5'端能形成莖環機構的20、24 或29 個核苷酸的骨架序列，以及3'端與靶序列互補配對的21 個核苷酸的向導序列（圖3）。同樣，對crRNA 5'端進行延長，增加4 個、9 個等數目的核苷酸，均可提高基于NHEJ 和HDR 的基因編輯效率［34］。

圖3 sgRNA/crRNA 及修飾Fig.3 sgRNA/crRNA and modifiers

3 用于同源重組精準基因編輯的供體DNA/RNA

3.1 雙鏈供體DNA 及修飾

用于同源重組精準基因編輯的雙鏈供體DNA具有如下結構：5'端和3'端與靶位點同源的序列；中間為需要替換或插入的目標序列。與靶位點同源的序列也稱為同源臂，其為基因組雙鏈缺口產生后的3'突出端侵入供體DNA 提供互補配對序列，同源臂的長度為數百到數千堿基不等［35］。供體DNA 可進行多種修飾，產生多種可提高HR 效率的衍生體（圖4）。為防止細胞中脫氧核酸酶對雙鏈供體DNA 的降解，對雙鏈供體DNA 末端2～3 個磷酸酯鍵進行硫代磷酸化（Phosophorothioation）修飾，有利于提高雙鏈供體DNA 在細胞中的穩定性。Gutierrez-Triana 等［36］采用硫代硫酸化的供體DNA 注射動物胚胎，極大地提高了HR 效率。在水稻中，Lu 等［19］硫代磷酸化雙鏈供體DNA 4 個末端，并磷酸化雙鏈供體DNA 2 個5'末端，通過NHEJ 輔助的SSA 途徑，獲得6.1%的基因替換效率。5'端生物素標記（Biotinylation）的雙鏈供體DNA，能結合Cas9-mSA 融合蛋白，使供體DNA 和DSB 共位，從而提高HDR 效率。我們實驗室應用此方法成功獲得OsALS基因的替換水稻，HR 效率為4%。此外，有研究表明染色質及其結構影響HDR 效率［37］。Cruz-Becerra 等［38］將供體雙鏈DNA 染色質化并引入人細胞，與“裸露”雙鏈DNA 相比，HR 介導的基因插入效率提高2.3～7.4 倍。

3.2 單鏈供體DNA/RNA 及修飾

單鏈供體DNA 與雙鏈供體DNA 一樣，含有5'和3'末端同源臂，但對HDR 效率的影響表現出不對稱性（Asymmetry）的特點，實驗發現PAM（Protospacer adjacent motif）遠端同源臂較短、PAM 近端同源臂較長，可提高HDR 效率60%［39］。單鏈RNA 也可作為HDR 模板，Butt 等［40］在水稻中表達sgRNA 和模板RNA 相連的嵌合RNA，獲得OsALS 基因替換的水稻植株。同樣地，在水稻中，Li 等［41］利用Cas12 和在細胞核中表達crRNA 和供體RNA，使HDR 介導的OsALS基因替換效率達到1.7%～4.6%。為提高同源重組效率，單鏈供體DNA 或RNA 也可進行適當修飾（圖4）。在水稻中，Ali 等［28］利用5'端帶有T-DNA右邊界序列（Right border，RB）的供體單鏈DNA和Cas9-VirD2 蛋白，通過VirD2 識別和共價結合RB 序列，使單鏈供體DNA 和基因組DNA 雙鏈切口共位，從而使HR 介導的基因插入或替換效率提高4 倍。在逆轉錄子（Retron）基因編輯體系中，供體DNA 為多拷貝單鏈DNA（msDNA），每份拷貝供體DNA 的5'端通過逆轉錄子結構性RNA（msr）間接連接在sgRNA 上，這樣當Cas9-逆轉錄酶（Cas9-RT）在細胞中產生雙鏈切口時，多份拷貝單鏈供體DNA 同時出現在雙鏈切口處，極大地提高了HDR 效率，在人細胞中HDR 介導的基因替換效率大于10%［31-32］。逆轉錄子基因編輯在動物細胞中的成功應用為植物基因編輯工具的開發提供了一條嶄新的途徑。

圖4 供體DNA/RNA 及修飾Fig.4 Donor DNA/RNA and modifiers

4 植物遺傳轉化及CRISPR 組分和供體DNA/RNA 遞送

4.1 依賴于組織培養的遺傳轉化及CRISPR 組分和供體DNA/RNA 遞送

像植物所有基因轉化一樣，植物基因插入或替換等精準基因編輯往往需要通過組織培養，在植物細胞中同時遞送CRISPR 組分及供體DNA 或RNA，待細胞基因被編輯后，再誘導編輯細胞進行胚胎發生，獲得再生植株（圖5A）。CRISPR組分及供體DNA 或RNA 可通過根癌農桿菌侵染、基因槍轟擊和PEG/Ca2+轉化植物愈傷組織或原生質體進入植物細胞，且它們在細胞中的位置和數量直接影響基因插入或替換的效率。

圖5 植物遺傳轉化和CRISPR 組分和供體DNA/RNA 的遞送Fig.5 Plant genetic transformation and delivery of CRISPR reagents and donor DNA/RNA

將Cas9、sgRNA 和兩端含有sgRNA 識別位點的供體DNA 編碼序列置于同一個農桿菌雙元表達載體上，通過農桿菌侵染進入植物細胞并整合到植物基因組后，植物細胞核中就同時存在翻譯產生的Cas9、轉錄產生的sgRNA 以及CRISPR組分酶切釋放的供體DNA，當CRISPR 組分在靶基因處產生雙鏈切口后，可保障在切口處有供體DNA 的存在，從而實現靶基因的插入或替換，這個過程被稱為植物原位基因打靶（in plantaGene targeting）［42］。植物原位基因打靶利用的供體DNA 只有一份，在農桿菌雙元載體中插入雙生病毒（Geminivirus）復制子組分編碼序列，可使供體DNA 通過滾環復制形成多份拷貝，從而提高植物原位打靶的效率。Cermak 等［43］利用含有豆類黃矮病毒（Bean yellow dwarf virus，BeYDV）復制子組分編碼序列的雙元載體，通過農桿菌轉化，成功在ANT1 基因編碼序列前插入35S 啟動子，在獲得的轉化植株中，有2/3 是HDR 介導的精準插入。使用同樣的供體DNA 擴增策略，Wang 等［44］利用小麥矮化病毒（Wheat dwarf virus，WDV）復制子，在水稻ACT1 和GST 位點分別實現19.4%和7.7%的精準替換。

利用基因槍也可將Cas9、sgRNA 和供體DNA遞送到組織細胞，再通過組織培養誘導分化產生基因編輯植株。基因槍轉化可根據需要以DNA、RNA 或核酸蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）的形式引入CRISPR 組分和供體DNA 或RNA，且不受引入數量的限制，因而在水稻和玉米等作物中廣泛使用。Ali 等［28］使用基因槍轉化法，將Cas9-VirD2、sgRNA 和帶有RB 序列的供體DNA 成功引入水稻愈傷組織細胞，分別獲得OsALS基因被替換、OsCCD7基因被替換及OsHDT基因后無縫整合HA 編碼序列的水稻再生植株。Sun 等［45］利用基因槍轉化法，將含有Cas9、sgRNA 和供體DNA 編碼序列的雙元載體以及游離供體DNA，一同引入水稻愈傷組織細胞，成功獲得OsALS 的替換植株。Lu 等［19］利用基因槍轉化法，將Cas9和sgRNA 編碼質粒以及供體DNA 引入水稻愈傷組織細胞，利用雙鏈切口的NHEJ 輔助的SSA 途徑，在基因組中多個位點進行基因插入或替換。Svitshev 等［46］用基因槍法轉化玉米幼胚，引入CRISPR 組分和供體雙鏈DNA 或單鏈DNA，也成功獲得ALS2 替換植株。

PEG/Ca2+轉化法可將Cas9 和sgRNA 組成的RNP 以及供體DNA 引入植物原生質體，實現基因的插入或替換等精準基因編輯。但對大多數植物來說，原生質體再生植株難度較高。目前，在萵苣和番茄等植物中，已有通過原生質體轉化獲得CRISPR 基因敲除植株的報道［47-48］，將來有望在這些植物中實施基于同源重組的更為精準的基因編輯。

4.2 無組織培養過程的遺傳轉化及CRISPR 組分和供體DNA/RNA 遞送

組織培養是限制植物基因轉化或基因編輯效率的瓶頸之一，成熟植株從頭誘導分生組織分化形成幼莖的方法可消除這一瓶頸的影響。在雙子葉植物中，生長調節因子WUSCHEL2（Wus2）、SHOOT MERISTEMLESS（STEM）及植物細胞分裂素生物合成基因-異戊基轉移酶基因（Isopentenyl transferase，Ipt）在分生組織發生和維護及幼莖分化中起著關鍵的作用。Maher 等［49］將CRISPR 組分及Wus2、STEM 和Ipt 的不同組合，通過農桿菌侵染幼苗或成熟植株，在植株上產生靶基因編輯的幼莖，切下幼莖，進一步在培養基中誘導生根，可獲得基因敲除的植株。目前，這一避開植物組織培養、直接在幼苗和成熟植株上進行的基因遞送，在Nicotiana benthamiana、番茄、馬鈴薯和葡萄中得以實現。

利用病毒將sgRNA 遞送到植物頂端分生組織，以期在后代種子中獲得基因編輯植株，是避開組織培養的另一種有效方法。Ellison 等［50］用煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus）遞送融合了Flowering Locus T（FT）RNA 的sgRNA 到穩定表達Cas9 的Nicotiana benthamiana植株頂端分生組織，在后代植株中有30%發生多位點基因編輯。在小麥中，Li 等［51］用大麥條紋花葉病毒（Barley strip mosaic virus）遞送融合了FT RNA 的sgRNA 到植株頂端分生組織，在后代植株中有12.9%～100.0%發生基因編輯。由于病毒遞送受到載體容量影響，基因插入或替換需要遞送除sgRNA 外的供體DNA 或RNA，因此將該技術用于基于同源重組的精準基因編輯具有一定的挑戰性。

5 基于同源重組的CRISPR 精準基因編輯技術應用前景展望

在開發出基于NHEJ 輔助的SSA 介導的CRISPR 基因插入或替換技術后，Lu 等［52］呼吁在全球協作開展水稻蛋白標簽計劃（Rice Protein Tagging Project，RPTP），即在5 年內對水稻全基因組編碼蛋白進行原位FLAG 或HA 標簽。預見在不久的將來，隨著這一計劃的順利實施，水稻蛋白定位，蛋白與蛋白互作，蛋白與DNA、RNA、碳水化合物和脂肪等互作的研究，將獲得長足發展。這種系統性地解析水稻全基因組編碼蛋白功能的研究，將為水稻重要農藝性狀的改良提供堅實的基礎。

基于同源重組的CRISPR 精準基因編輯技術還可直接應用于作物育種中。Dong 等［53］利用該技術在水稻基因組的安全位點（Genomic safe harbor，GSH）插入類胡蘿卜素生物合成途徑中的兩個關鍵酶基因（5.2 kb），獲得類胡蘿卜素在水稻種子中高水平表達而其他性狀不受影響的“黃金大米”。作物中的許多復雜生命過程，如次生代謝產物合成、C3 和C4 光合作用、生物固氮等，往往涉及到多基因的協同表達和時空調控。隨著同源重組介導的CRISPR 精準基因編輯技術不斷優化，可望在作物代謝產物流向控制、C3向C4 光合作用轉變及固氮效能提高等方面有所突破。在作物遺傳改良中，許多性狀是由具有不同的編碼序列或啟動子序列的等位基因決定的，利用基于同源重組的CRISPR 基因編輯技術可克服傳統育種的遺傳拖拽現象，達到在精英品種中迅速引入并固定野生植物或農家品種中優良等位基因的目的。在作物雜交育種中，如果選育的目標性狀是由隱型突變基因控制的，可利用有性生殖過程中的同源重組機制，構建隱性突變基因的CRISPR 基因驅動（Gene drive），使隱性突變基因在雜種F1代中進行超孟德爾遺傳，從而使優良性狀在雜種F1代中迅速穩定下來。

生物基因組的自由撰寫（編輯）是自基因組完整閱讀（測序）以來合成生物學領域一直追求的目標，基于同源重組的CRISPR 精準基因編輯技術在動植物中的成功應用，無疑是向這一目標邁進的一大步。隨著對植物同源定向重組修復機制研究的更加深入和CRISPR 基因編輯技術的不斷革新，基于同源重組的CRISPR 精準編輯技術必將在農作物功能基因組學研究和新技術育種中發揮越來越重要的作用。