竹筍發(fā)酵中揮發(fā)性物質(zhì)及菌群多樣性動態(tài)分析

張雅雯，鐘源，郭愛玲*，唐丹萍，齊豫川

(1.華中農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，武漢 430070；2.柳州市柳南區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)服務中心，廣西 柳州 545027；3.中國科技開發(fā)院廣西分院，南寧 530012)

麻竹筍(Dendrocalamuslatiflorus)，別名甜竹、大綠竹、瓦坭竹，禾本科植物[1]。麻竹筍單個體積較大，重量約為4～5 kg，且種植面積大、產(chǎn)量高，是我國當前筍量最高的品種[2]。相較于其他竹筍而言，麻竹筍味道鮮美、肉質(zhì)脆嫩、營養(yǎng)豐富，含有大量氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等，廣受人們喜愛。但是由于新鮮竹筍中植酸含量較高，有一定苦澀味，過多的植酸還會妨礙人體對鐵、鎂、鋅、銅、錳等礦物質(zhì)的吸收，發(fā)酵腌制可以改善竹筍的口感與風味。到目前為止，竹筍發(fā)酵過程中特征性風味物質(zhì)產(chǎn)生的作用機制暫不明確，為實現(xiàn)酸筍特征風味的定向調(diào)控，提升風味品質(zhì)，需要深入探究酸筍中微生物與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性特征風味物質(zhì)的內(nèi)在聯(lián)系，為闡明微生物對特征香氣組分生成的調(diào)控機制提供了理論依據(jù)和技術支撐。

本研究應用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)對麻竹筍自然發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分進行分析，獲得竹筍發(fā)酵不同階段的特征風味物質(zhì)；應用高通量測序(high-throughput sequencing，HTS)對麻竹筍發(fā)酵過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)變化進行測定[3]；最后基于Pearson相關性分析優(yōu)勢菌群與主要特征風味成分之間的關系，旨在闡明自然發(fā)酵過程中特征風味組分形成與微生物菌群之間的關系，為酸筍規(guī)模化生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮麻竹筍：廣西來賓；食鹽(食品級)：四川宜賓豐源鹽業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CarboxenTM/PDMS StableFlexTM(二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷)萃取頭 美國Supelco公司；Centrifuge 5420 高速離心機 德國Eppendorf公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司；15 mL氣相色譜進樣瓶；Vortex-2G560E渦旋振蕩器 Scientific Industries Inc.；Veriti 96-Well 9902梯度基因擴增儀 Applied Biosystems公司；3-16P 24 孔離心機 Sartorius公司；BE-1100四維旋轉(zhuǎn)混勻儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DynaMagTM-96 Side Skirted磁力架 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將1 000 g新鮮麻竹筍去殼、洗凈，取中間部分切成條(7 cm×1 cm×1 cm)后，置于1 L玻璃瓶中，加入礦泉水，置于25 ℃自然發(fā)酵。在腌制的第 1，15，30，45天分別取樣進行揮發(fā)性成分和微生物多樣性的測定。

1.3.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

取酸筍樣品 3 g 和發(fā)酵液2 mL 放入15 mL 頂空樣品瓶中，水浴平衡20 min，萃取頭 250 ℃老化5 min。GC 條件:色譜柱使用 HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，HS-SPME法為自動進樣，解吸時間為 5 min。柱箱升溫程序:40 ℃保持2 min，以5 ℃/min 的速度升至 120 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min 的速度升至220 ℃，保持5 min，最后以7 ℃/min 的速度升至240 ℃，保持5 min。 MS 條件:傳輸線溫度260 ℃。離子能級70 eV，采用Scan(全掃描)模式，掃描質(zhì)荷比范圍為35～400 m/z[4]。

1.3.3 DNA提取

將30 mL酸筍發(fā)酵液樣品從-80 ℃冰箱中取出，融化后置于50 mL離心管中，4 ℃高速離心機12 000 r/min離心10 min，加入200 μL緩沖液SH混勻，渦旋5 s，4 ℃放置10 min。12 000 r/min離心3 min，加入500 μL緩沖液 GFA，混勻。加入10 μL磁珠懸浮液 G，振蕩混勻。將離心管放置于磁力架上靜置30 s，加入700 μL去蛋白液 RD，振蕩混勻5 min。將離心管放置于磁力架上靜置30 s，加入700 μL漂洗液 PWD，振蕩混勻 3 min。重復上述步驟1次后將離心管置于磁力架上，室溫晾干5～10 min，加入50～100 μL洗脫緩沖液TB，振蕩混勻，置于56 ℃孵育5 min，期間振蕩混勻3回，每回3～5 次。 將 DNA 溶液轉(zhuǎn)移至一個新離心管中，并于適當條件下保存。采用天根生化科技(北京)有限公司基因組提取試劑盒提取樣品中所有微生物的總DNA。使用酶標儀對提取的核酸進行濃度檢測，PCR 擴增后的產(chǎn)物進行電泳檢測，在凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。根據(jù)電泳結(jié)果用Image J 軟件定量，目的條帶亮于或者接近500 bp Marker時，預估可以一次建庫成功。

1.3.4 文庫構(gòu)建及測序

檢測合格的DNA樣品經(jīng)純化、PCR擴增、電泳檢測、Image J 軟件定量、混樣過柱純化、切膠回收等過程完成文庫構(gòu)建，對構(gòu)建好的文庫使用Illumina NovaSeq 6000(NovaSeq 6000，Illumina)進行上機測序。宏基因測序在百邁客生物科技股份有限公司進行。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

將GC-MS所得的揮發(fā)性風味物質(zhì)與標準質(zhì)譜庫NIST 11 Library匹配，選取相似度大于50的物質(zhì)進行分析。同時對總離子流色譜圖用峰面積歸一化法定量，計算出各組分的相對百分含量[5]。采用Origin 2018繪圖，SPSS軟件和R語言進行相關性分析[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化

2.1.1 發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

通過HS-SPME-GC-MS從竹筍發(fā)酵過程中共分離鑒定出88種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中包含醇類17種、酯類20種、胺類2種、醛類8種、酮類7種、烷烴類13種、烯烴類4種、酸類5種、醚類7種、酚類5種，其中酚類、醇類和酯類物質(zhì)為主要揮發(fā)性成分。

發(fā)酵1 d的酸筍中共鑒定出31種揮發(fā)性成分，相對含量為55.75%。主要有胺類1種(43.913%)，醇類8種(1.472%)，酯類3種(0.438%)，醛類3種(0.736%)，酮類1種(0.377%)，烷烴類7種(1.757%)，烯烴類3種(0.254%)，醚類5種(6.805%)。胺類物質(zhì)相對含量明顯高于其他發(fā)酵時間的樣品，其中胺類化合物為二甲胺，具有刺激性氣味。發(fā)酵15 d的酸筍中共鑒定出34種揮發(fā)性成分，相對含量為82.81%。主要有胺類1種(0.025%)，醇類5種(0.898%)，酯類12種(2.219%)，醛類2種(0.41%)，酮類4種(0.681%)，烷烴類2種(0.484%)，酸類3種(13.726%)，醚類1種(0.293%)，酚類4種(64.074%)。酚類物質(zhì)出現(xiàn)且含量高，其中主要酚類化合物為對甲酚(44.265%)，具有刺激性氣味。發(fā)酵30 d的酸筍中共鑒定出23種揮發(fā)性成分，相對含量為89.954%。主要有醇類4種(0.344%)，酯類6種(0.294%)，醛類3種(0.7%)，酮類3種(0.145%)，烷烴類2種(0.074%)，酸類2種(12.159%)，酚類3種(76.238%)等。酸類物質(zhì)中主要為酮丙二酸(7.123%)和乙酸(5.036%)，對甲酚含量進一步增加，達到72.359%。發(fā)酵45 d的酸筍中共鑒定出30種揮發(fā)性成分，相對含量為84.056%。主要有醇類6種(1.694%)，酯類6種(0.993%)，醛類3種(0.139%)，酮類2種(0.146%)，烷烴類4種(0.247%)，烯烴類1種(0.16%)，酸類2種(5.448%)，醚類3種(6.539%)，酚類3種(68.69%)等。在發(fā)酵后期，酚類物質(zhì)是酸筍揮發(fā)性物質(zhì)中測得的含量最高的一類物質(zhì)，主要是對甲酚、苯酚、2-甲氧基-5-甲基苯酚等。酚類物質(zhì)常會產(chǎn)生刺激性氣味，且閾值較低，對酸筍的風味產(chǎn)生重要影響。發(fā)酵過程中1-辛烯-3-醇含量不斷增加，1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香氣。胺類隨著發(fā)酵的進行逐漸減少，酸類在發(fā)酵后期產(chǎn)生了乙酸和乳酸，乙酸有刺鼻的醋酸味，對酸筍氣味有一定影響。

表1 竹筍自然發(fā)酵過程中含量增加的揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components with increased content during natural fermentation of bamboo shoots

續(xù) 表

表2 竹筍自然發(fā)酵過程中含量減少的揮發(fā)性成分Table 2 Volatile components with reduced content during natural fermentation of bamboo shoots

續(xù) 表

表3 竹筍自然發(fā)酵過程中先出現(xiàn)后消失的揮發(fā)性成分Table 3 Volatile components that appear first and then disappear during natural fermentation of bamboo shoots

續(xù) 表

由表1～表3可知，在發(fā)酵過程中新出現(xiàn)或含量增加的物質(zhì)共有24種，其中有4種醇類、6種酯類、2種醛類、1種酮類、4種烷烴類、1種烯烴類、2種酸類、2種醚類、2種酚類。環(huán)庚醇、環(huán)辛醇、乙酸、對甲酚等都是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，且含量較高；隨著發(fā)酵過程的進行，含量減少或消失的物質(zhì)共有29種，其中有7種醇類、3種酯類、1種胺類、3種醛類、1種酮類、7種烷烴類、3種烯烴類、4種醚類。發(fā)酵過程中胺類物質(zhì)大量減少，醇類物質(zhì)中，正己醇含量明顯減少，反式-2-辛烯醛也呈現(xiàn)下降趨勢，烷烴類含量減少明顯；在發(fā)酵中期先出現(xiàn)又消失的物質(zhì)共有32種，其中有6種醇類、11種酯類、1種胺類、3種醛類、4種酮類、2種烷烴類、3種酸類、2種酚類。主要物質(zhì)有酮丙二酸、4-甲氧基苯酚等，發(fā)酵中期產(chǎn)生多種酯類物質(zhì)，如甘油亞麻酸酯、異別膽酸乙酯等。二甲醚、苯酚等物質(zhì)含量變化無明顯規(guī)律。

2.1.2 竹筍發(fā)酵過程中各類揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化

發(fā)酵過程中各類揮發(fā)性風味物質(zhì)相對含量的變化情況見圖1。

圖1 麻竹筍不同發(fā)酵時間的揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量Fig.1 Relative content of volatile flavor substances in Dendrocalamus latiflorus at different fermentation time

對比可知，竹筍在發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量存在差異，其中酚類、酸類和醇類占主導地位。

在整個發(fā)酵過程中，共鑒定出5種酚類，占總揮發(fā)性風味物質(zhì)的60%以上。發(fā)酵15 d時酸筍樣品有酚類4種，相對含量高達64.074%，發(fā)酵30 d時酸筍樣品有酚類3種，相對含量增加到76.238%。發(fā)酵45 d時酚類含量略有降低。乳酸菌具有去羧基、去酯化、去甲基化和去糖基化的能力，不同乳酸菌能產(chǎn)生特定酶(例如,淀粉酶、木聚糖酶、單寧酶和蛋白酶[7])，然后通過脫羧反應等轉(zhuǎn)化為鄰酚類物質(zhì)。酚類中對甲酚的占比最高，其次是苯酚和2-甲氧基-5-甲基苯酚。對甲酚具有刺激性氣味、焦皮臭、動物臭且閾值較低，為0.047 mg/kg，在整個發(fā)酵過程中相對含量較高，對風味影響較大。蔡玥等[8]利用GC-MS也在發(fā)酵酸筍中檢測出了大量對甲酚。朱照華[9]研究表明，竹筍原材料中含有大量的酪氨酸，在發(fā)酵過程中酪氨酸大量降解，則酪氨酸有極大可能性轉(zhuǎn)化為對甲苯酚，成為影響酸筍風味的重要揮發(fā)性物質(zhì)。苯酚具有特殊的臭味和燃燒味，但其閾值較高，為5.9 mg/kg，對風味影響不大。

酸類的相對含量僅次于酚類，種類有5種，閾值普遍較低，對發(fā)酵酸筍的整體風味影響較大。在整個發(fā)酵過程中相對含量先升高后降低，發(fā)酵15 d時檢測到的酸類相對含量最高，為13.726%。其中相對含量最高的是酮丙二酸，發(fā)酵30 d時其他相對含量較高的物質(zhì)還有乙酸(5.036%)，發(fā)酵45 d時還產(chǎn)生了少量乳酸。

醇類物質(zhì)共有19種，在整個發(fā)酵過程中相對含量先減少后增加。醇類物質(zhì)具有令人愉悅的香味。其中正己醇和1-辛烯-3-醇含量較多，正己醇有淡青的嫩枝葉氣息，微帶酒香、果香和脂肪氣息，閾值為0.05 mg/kg。1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草和干草香氣，其閾值較低，為0.002 mg/kg[10]。發(fā)酵前期含有較多順-2-甲基環(huán)戊醇，發(fā)酵后期產(chǎn)生環(huán)庚醇和環(huán)辛醇。

具有復合香味的酯類在整個發(fā)酵過程中相對含量較少但種類較多。其中辛酸乙酯在發(fā)酵前期含量較多，具有水果香氣和白蘭地的酒香味，閾值較低，為0.65 mg/kg。苯甲酸乙酯和棕櫚酸乙酯在發(fā)酵中、后期含量較多，均呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，苯甲酸乙酯稍有水果氣味，閾值為0.06 mg/kg，棕櫚酸乙酯呈微弱蠟香、果爵和奶油香氣，但由于其閾值較大，大于2 mg/kg，對酸筍風味的影響不大。苯丙酸乙酯在發(fā)酵后期產(chǎn)生，也具有水果類香氣。

醛類物質(zhì)的氣味閾值普遍較低，對酸筍風味的形成具有較為重要的影響。己醛有豆類香氣[11]，識別閾值為0.21 mg/kg，可能對酸筍風味有一定貢獻。反式-2-辛烯醛呈脂肪和肉類香氣，并有黃瓜和雞肉香味，香味閾值較低。

此外，2-戊基呋喃在整個發(fā)酵過程中的相對含量較高，具有蔬菜芳香[12]，閾值較低，為0.004 8 mg/kg[13]；發(fā)酵前期二甲胺含量高，后期二甲胺不再檢測出來，由此可以推斷，發(fā)酵可以降低二甲胺等有害物質(zhì)的含量。

2.2 微生物多樣性變化

在細菌菌群結(jié)構(gòu)分析(見表4)中，發(fā)酵初期樣品中的優(yōu)勢細菌包括乳球菌屬(35.395%)、魏斯氏菌屬(23.330%)、腸桿菌科(2.279%)；發(fā)酵15 d樣品中的優(yōu)勢細菌有乳桿菌屬(52.350%)、乳球菌屬(41.246%)；發(fā)酵30 d樣品中的優(yōu)勢細菌有片球菌屬(2.262%)、魏斯氏菌屬(28.190%)；發(fā)酵末期酸筍樣品中的優(yōu)勢細菌主要為乳桿菌(66.665%)。腸桿菌科隨著發(fā)酵時間的推移逐步減少，這是由于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，抑制了腸桿菌的生長。乳桿菌多為兼性厭氧菌，具有較強的耐酸能力，更適合在發(fā)酵中、后期的低氧環(huán)境下生長代謝[14]。

表4 竹筍自然發(fā)酵過程不同階段細菌菌群結(jié)構(gòu)分析Table 4 Analysis of bacterial community structure at different stages of natural fermentation of bamboo shoots

根據(jù)菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，從中篩選出相對豐度較高的4個屬水平分類群，分別為乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)和片球菌屬(Pediococcus)，其在不同樣品中的相對豐度見圖2。通過比較發(fā)現(xiàn)，1 d時乳球菌屬含量最高，15 d和45 d時占比最高的為乳桿菌屬，30 d時魏斯氏菌屬含量最高。在整個發(fā)酵過程中，乳桿菌屬整體含量上的趨勢為先上升后下降再上升，1 d時幾乎沒有，15 d時為52.45%，30 d時為25.35%，45 d時為66.6%；乳球菌屬整體含量上的趨勢為先上升后下降，1 d時占 35.4%，15 d時占41.2%，后期降至10%～20%；魏斯氏菌屬在發(fā)酵過程中在0%～30%之間變動，且無明顯規(guī)律;片球菌屬含量在發(fā)酵前期幾乎沒有，30 d時出現(xiàn)且含量為2.3%。由以上規(guī)律可推測，泡菜發(fā)酵過程中起主導作用的是乳桿菌屬;在發(fā)酵初期作用顯著的是乳球菌屬和魏斯氏菌屬。這與佟婷婷等[15]提出的魏斯氏菌屬在此發(fā)酵過程中起到了啟動菌的作用的猜想符合。而整體的乳酸菌含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，這與文獻[16]中的結(jié)果一致。

圖2 發(fā)酵過程中乳酸菌屬水平之間的相對豐度比較Fig.2 Comparison of relative abundance of Lactobacillus during fermentation

2.3 微生物與揮發(fā)性風味物質(zhì)

酸筍中揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化受竹筍種類、地域、發(fā)酵條件和微生物種群等多種因素的影響，微生物種群可能是酸筍中揮發(fā)性風味物質(zhì)形成的關鍵因素[17-20]。如Yang等[21]研究認為明串珠菌能顯著提高泡菜中揮發(fā)性風味物質(zhì)丁酸乙酯、4-異硫氰基-1-丁烯和2-庚酮的含量。還有研究認為不同菌株之間的代謝互補，會產(chǎn)生一些單菌株無法產(chǎn)生的新的揮發(fā)性化合物，并且還會增加揮發(fā)性化合物的含量，從而提高泡菜香氣的復雜度[22]。而植物乳桿菌和戊糖片球菌共接種發(fā)酵可增加醇類、酯類、醛類、烴類和腈類化合物[23]。

由表5可知，乳桿菌屬和乳球菌菌屬與發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風味物質(zhì)大多呈正相關；糖單胞菌、嚴格梭狀芽孢桿菌、葡萄球菌等在發(fā)酵過程中與大多數(shù)揮發(fā)性風味物質(zhì)呈負相關。乳桿菌屬與F5(苯甲酸乙酯)、F6(苯丙酸乙酯)、F7(棕櫚酸乙酯)、F10(大馬酮)、F17(苯酚)都呈正相關，且相關系數(shù)較大；乳球菌屬與F4(辛酸乙酯)、F9(反式-2-辛烯醛)、F11(3-乙基-5-(2-乙基丁基)十八烷)呈正相關，與F13(乙酸)、F20(2-甲氧基-5-甲基苯酚)呈顯著負相關；魏斯氏菌屬與F17(苯酚)呈顯著負相關。在發(fā)酵酸筍中含量最高的特征風味物質(zhì)F18(對甲酚)與糖單胞菌、嚴格梭狀芽孢桿菌、片球菌屬、明串珠菌屬、葡萄球菌屬等都存在相關性。

3 結(jié)論

本研究以麻竹筍為原料，采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術對麻竹筍自然發(fā)酵中揮發(fā)性成分進行分析，結(jié)果表明，在整個發(fā)酵過程中共檢測出88種揮發(fā)性化合物，含量較多的為酚類、醇類、酯類、酸類、醚類；酮類、烷烴類、烯烴類、醛類比較少。對甲酚是酸筍中特殊味道的主體成分，同時，在研究過程中也發(fā)現(xiàn)，二甲胺等有害物質(zhì)隨著發(fā)酵過程的進行而消失。環(huán)辛醇、環(huán)庚醇、乙酸、乳酸、苯酚等物質(zhì)在發(fā)酵中、后期形成。

通過高通量測序?qū)ψ匀话l(fā)酵過程不同時期的菌群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在竹筍發(fā)酵的初期、中期和末期菌群結(jié)構(gòu)多樣性顯著改變。發(fā)酵初期優(yōu)勢細菌菌群主要有乳球菌屬、魏斯氏菌屬和腸桿菌屬等；中期優(yōu)勢細菌菌群主要有明串珠菌屬和片球菌屬；末期優(yōu)勢細菌菌群主要是乳桿菌屬等。

菌群與特征揮發(fā)性風味物質(zhì)的相關性分析發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬和乳球菌菌屬與發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風味物質(zhì)大多呈正相關；糖單胞菌、嚴格梭狀芽孢桿菌、葡萄球菌等在發(fā)酵過程中與大多數(shù)揮發(fā)性風味物質(zhì)呈負相關。在發(fā)酵酸筍中含量最高的特征風味物質(zhì)對甲酚與糖單胞菌、嚴格梭狀芽孢桿菌、片球菌、明串珠菌、葡萄球菌等都存在相關性。研究結(jié)果闡明了麻竹筍自然發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)形成與微生物菌群之間的關系，為酸筍中優(yōu)勢功能菌株的篩選和定向發(fā)酵提供了基礎數(shù)據(jù)。

表5 麻竹筍自然發(fā)酵過程優(yōu)勢菌群與揮發(fā)性風味物質(zhì)的相關性數(shù)據(jù)Table 5 Correlation data of dominant microbial community and volatile flavor substances during natural fermentation of Dendrocalamus latiflorus

續(xù) 表