竹筍發酵中揮發性物質及菌群多樣性動態分析

張雅雯，鐘源，郭愛玲*，唐丹萍，齊豫川

(1.華中農業大學 食品科技學院，武漢 430070；2.柳州市柳南區現代農業產業服務中心，廣西 柳州 545027；3.中國科技開發院廣西分院，南寧 530012)

麻竹筍(Dendrocalamuslatiflorus)，別名甜竹、大綠竹、瓦坭竹，禾本科植物[1]。麻竹筍單個體積較大，重量約為4～5 kg，且種植面積大、產量高，是我國當前筍量最高的品種[2]。相較于其他竹筍而言，麻竹筍味道鮮美、肉質脆嫩、營養豐富，含有大量氨基酸、礦物質、維生素等，廣受人們喜愛。但是由于新鮮竹筍中植酸含量較高，有一定苦澀味，過多的植酸還會妨礙人體對鐵、鎂、鋅、銅、錳等礦物質的吸收，發酵腌制可以改善竹筍的口感與風味。到目前為止，竹筍發酵過程中特征性風味物質產生的作用機制暫不明確，為實現酸筍特征風味的定向調控，提升風味品質，需要深入探究酸筍中微生物與發酵過程中產生的揮發性特征風味物質的內在聯系，為闡明微生物對特征香氣組分生成的調控機制提供了理論依據和技術支撐。

本研究應用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)對麻竹筍自然發酵過程中的揮發性成分進行分析，獲得竹筍發酵不同階段的特征風味物質；應用高通量測序(high-throughput sequencing，HTS)對麻竹筍發酵過程中微生物菌群結構變化進行測定[3]；最后基于Pearson相關性分析優勢菌群與主要特征風味成分之間的關系，旨在闡明自然發酵過程中特征風味組分形成與微生物菌群之間的關系，為酸筍規?；a加工提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮麻竹筍：廣西來賓；食鹽(食品級)：四川宜賓豐源鹽業有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 7000D氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CarboxenTM/PDMS StableFlexTM(二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷)萃取頭 美國Supelco公司；Centrifuge 5420 高速離心機 德國Eppendorf公司；SHP-250生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；15 mL氣相色譜進樣瓶；Vortex-2G560E渦旋振蕩器 Scientific Industries Inc.；Veriti 96-Well 9902梯度基因擴增儀 Applied Biosystems公司；3-16P 24 孔離心機 Sartorius公司；BE-1100四維旋轉混勻儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DynaMagTM-96 Side Skirted磁力架 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將1 000 g新鮮麻竹筍去殼、洗凈，取中間部分切成條(7 cm×1 cm×1 cm)后，置于1 L玻璃瓶中，加入礦泉水，置于25 ℃自然發酵。在腌制的第 1，15，30，45天分別取樣進行揮發性成分和微生物多樣性的測定。

1.3.2 揮發性風味物質的測定

取酸筍樣品 3 g 和發酵液2 mL 放入15 mL 頂空樣品瓶中，水浴平衡20 min，萃取頭 250 ℃老化5 min。GC 條件:色譜柱使用 HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，HS-SPME法為自動進樣，解吸時間為 5 min。柱箱升溫程序:40 ℃保持2 min，以5 ℃/min 的速度升至 120 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min 的速度升至220 ℃，保持5 min，最后以7 ℃/min 的速度升至240 ℃，保持5 min。 MS 條件:傳輸線溫度260 ℃。離子能級70 eV，采用Scan(全掃描)模式，掃描質荷比范圍為35～400 m/z[4]。

1.3.3 DNA提取

將30 mL酸筍發酵液樣品從-80 ℃冰箱中取出，融化后置于50 mL離心管中，4 ℃高速離心機12 000 r/min離心10 min，加入200 μL緩沖液SH混勻，渦旋5 s，4 ℃放置10 min。12 000 r/min離心3 min，加入500 μL緩沖液 GFA，混勻。加入10 μL磁珠懸浮液 G，振蕩混勻。將離心管放置于磁力架上靜置30 s，加入700 μL去蛋白液 RD，振蕩混勻5 min。將離心管放置于磁力架上靜置30 s，加入700 μL漂洗液 PWD，振蕩混勻 3 min。重復上述步驟1次后將離心管置于磁力架上，室溫晾干5～10 min，加入50～100 μL洗脫緩沖液TB，振蕩混勻，置于56 ℃孵育5 min，期間振蕩混勻3回，每回3～5 次。 將 DNA 溶液轉移至一個新離心管中，并于適當條件下保存。采用天根生化科技(北京)有限公司基因組提取試劑盒提取樣品中所有微生物的總DNA。使用酶標儀對提取的核酸進行濃度檢測，PCR 擴增后的產物進行電泳檢測，在凝膠成像儀下觀察電泳結果。根據電泳結果用Image J 軟件定量，目的條帶亮于或者接近500 bp Marker時，預估可以一次建庫成功。

1.3.4 文庫構建及測序

檢測合格的DNA樣品經純化、PCR擴增、電泳檢測、Image J 軟件定量、混樣過柱純化、切膠回收等過程完成文庫構建，對構建好的文庫使用Illumina NovaSeq 6000(NovaSeq 6000，Illumina)進行上機測序。宏基因測序在百邁客生物科技股份有限公司進行。

1.3.5 數據處理

將GC-MS所得的揮發性風味物質與標準質譜庫NIST 11 Library匹配，選取相似度大于50的物質進行分析。同時對總離子流色譜圖用峰面積歸一化法定量，計算出各組分的相對百分含量[5]。采用Origin 2018繪圖，SPSS軟件和R語言進行相關性分析[6]。

2 結果與分析

2.1 揮發性風味物質的變化

2.1.1 發酵過程中揮發性風味物質的測定

通過HS-SPME-GC-MS從竹筍發酵過程中共分離鑒定出88種揮發性風味物質，其中包含醇類17種、酯類20種、胺類2種、醛類8種、酮類7種、烷烴類13種、烯烴類4種、酸類5種、醚類7種、酚類5種，其中酚類、醇類和酯類物質為主要揮發性成分。

發酵1 d的酸筍中共鑒定出31種揮發性成分，相對含量為55.75%。主要有胺類1種(43.913%)，醇類8種(1.472%)，酯類3種(0.438%)，醛類3種(0.736%)，酮類1種(0.377%)，烷烴類7種(1.757%)，烯烴類3種(0.254%)，醚類5種(6.805%)。胺類物質相對含量明顯高于其他發酵時間的樣品，其中胺類化合物為二甲胺，具有刺激性氣味。發酵15 d的酸筍中共鑒定出34種揮發性成分，相對含量為82.81%。主要有胺類1種(0.025%)，醇類5種(0.898%)，酯類12種(2.219%)，醛類2種(0.41%)，酮類4種(0.681%)，烷烴類2種(0.484%)，酸類3種(13.726%)，醚類1種(0.293%)，酚類4種(64.074%)。酚類物質出現且含量高，其中主要酚類化合物為對甲酚(44.265%)，具有刺激性氣味。發酵30 d的酸筍中共鑒定出23種揮發性成分，相對含量為89.954%。主要有醇類4種(0.344%)，酯類6種(0.294%)，醛類3種(0.7%)，酮類3種(0.145%)，烷烴類2種(0.074%)，酸類2種(12.159%)，酚類3種(76.238%)等。酸類物質中主要為酮丙二酸(7.123%)和乙酸(5.036%)，對甲酚含量進一步增加，達到72.359%。發酵45 d的酸筍中共鑒定出30種揮發性成分，相對含量為84.056%。主要有醇類6種(1.694%)，酯類6種(0.993%)，醛類3種(0.139%)，酮類2種(0.146%)，烷烴類4種(0.247%)，烯烴類1種(0.16%)，酸類2種(5.448%)，醚類3種(6.539%)，酚類3種(68.69%)等。在發酵后期，酚類物質是酸筍揮發性物質中測得的含量最高的一類物質，主要是對甲酚、苯酚、2-甲氧基-5-甲基苯酚等。酚類物質常會產生刺激性氣味，且閾值較低，對酸筍的風味產生重要影響。發酵過程中1-辛烯-3-醇含量不斷增加，1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香氣。胺類隨著發酵的進行逐漸減少，酸類在發酵后期產生了乙酸和乳酸，乙酸有刺鼻的醋酸味，對酸筍氣味有一定影響。

表1 竹筍自然發酵過程中含量增加的揮發性成分Table 1 Volatile components with increased content during natural fermentation of bamboo shoots

續 表

表2 竹筍自然發酵過程中含量減少的揮發性成分Table 2 Volatile components with reduced content during natural fermentation of bamboo shoots

續 表

表3 竹筍自然發酵過程中先出現后消失的揮發性成分Table 3 Volatile components that appear first and then disappear during natural fermentation of bamboo shoots

續 表

由表1～表3可知，在發酵過程中新出現或含量增加的物質共有24種，其中有4種醇類、6種酯類、2種醛類、1種酮類、4種烷烴類、1種烯烴類、2種酸類、2種醚類、2種酚類。環庚醇、環辛醇、乙酸、對甲酚等都是在發酵過程中產生的，且含量較高；隨著發酵過程的進行，含量減少或消失的物質共有29種，其中有7種醇類、3種酯類、1種胺類、3種醛類、1種酮類、7種烷烴類、3種烯烴類、4種醚類。發酵過程中胺類物質大量減少，醇類物質中，正己醇含量明顯減少，反式-2-辛烯醛也呈現下降趨勢，烷烴類含量減少明顯；在發酵中期先出現又消失的物質共有32種，其中有6種醇類、11種酯類、1種胺類、3種醛類、4種酮類、2種烷烴類、3種酸類、2種酚類。主要物質有酮丙二酸、4-甲氧基苯酚等，發酵中期產生多種酯類物質，如甘油亞麻酸酯、異別膽酸乙酯等。二甲醚、苯酚等物質含量變化無明顯規律。

2.1.2 竹筍發酵過程中各類揮發性風味物質的變化

發酵過程中各類揮發性風味物質相對含量的變化情況見圖1。

圖1 麻竹筍不同發酵時間的揮發性風味物質的相對含量Fig.1 Relative content of volatile flavor substances in Dendrocalamus latiflorus at different fermentation time

對比可知，竹筍在發酵過程中揮發性風味物質的相對含量存在差異，其中酚類、酸類和醇類占主導地位。

在整個發酵過程中，共鑒定出5種酚類，占總揮發性風味物質的60%以上。發酵15 d時酸筍樣品有酚類4種，相對含量高達64.074%，發酵30 d時酸筍樣品有酚類3種，相對含量增加到76.238%。發酵45 d時酚類含量略有降低。乳酸菌具有去羧基、去酯化、去甲基化和去糖基化的能力，不同乳酸菌能產生特定酶(例如,淀粉酶、木聚糖酶、單寧酶和蛋白酶[7])，然后通過脫羧反應等轉化為鄰酚類物質。酚類中對甲酚的占比最高，其次是苯酚和2-甲氧基-5-甲基苯酚。對甲酚具有刺激性氣味、焦皮臭、動物臭且閾值較低，為0.047 mg/kg，在整個發酵過程中相對含量較高，對風味影響較大。蔡玥等[8]利用GC-MS也在發酵酸筍中檢測出了大量對甲酚。朱照華[9]研究表明，竹筍原材料中含有大量的酪氨酸，在發酵過程中酪氨酸大量降解，則酪氨酸有極大可能性轉化為對甲苯酚，成為影響酸筍風味的重要揮發性物質。苯酚具有特殊的臭味和燃燒味，但其閾值較高，為5.9 mg/kg，對風味影響不大。

酸類的相對含量僅次于酚類，種類有5種，閾值普遍較低，對發酵酸筍的整體風味影響較大。在整個發酵過程中相對含量先升高后降低，發酵15 d時檢測到的酸類相對含量最高，為13.726%。其中相對含量最高的是酮丙二酸，發酵30 d時其他相對含量較高的物質還有乙酸(5.036%)，發酵45 d時還產生了少量乳酸。

醇類物質共有19種，在整個發酵過程中相對含量先減少后增加。醇類物質具有令人愉悅的香味。其中正己醇和1-辛烯-3-醇含量較多，正己醇有淡青的嫩枝葉氣息，微帶酒香、果香和脂肪氣息，閾值為0.05 mg/kg。1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草和干草香氣，其閾值較低，為0.002 mg/kg[10]。發酵前期含有較多順-2-甲基環戊醇，發酵后期產生環庚醇和環辛醇。

具有復合香味的酯類在整個發酵過程中相對含量較少但種類較多。其中辛酸乙酯在發酵前期含量較多，具有水果香氣和白蘭地的酒香味，閾值較低，為0.65 mg/kg。苯甲酸乙酯和棕櫚酸乙酯在發酵中、后期含量較多，均呈現先減少后增加的趨勢，苯甲酸乙酯稍有水果氣味，閾值為0.06 mg/kg，棕櫚酸乙酯呈微弱蠟香、果爵和奶油香氣，但由于其閾值較大，大于2 mg/kg，對酸筍風味的影響不大。苯丙酸乙酯在發酵后期產生，也具有水果類香氣。

醛類物質的氣味閾值普遍較低，對酸筍風味的形成具有較為重要的影響。己醛有豆類香氣[11]，識別閾值為0.21 mg/kg，可能對酸筍風味有一定貢獻。反式-2-辛烯醛呈脂肪和肉類香氣，并有黃瓜和雞肉香味，香味閾值較低。

此外，2-戊基呋喃在整個發酵過程中的相對含量較高，具有蔬菜芳香[12]，閾值較低，為0.004 8 mg/kg[13]；發酵前期二甲胺含量高，后期二甲胺不再檢測出來，由此可以推斷，發酵可以降低二甲胺等有害物質的含量。

2.2 微生物多樣性變化

在細菌菌群結構分析(見表4)中，發酵初期樣品中的優勢細菌包括乳球菌屬(35.395%)、魏斯氏菌屬(23.330%)、腸桿菌科(2.279%)；發酵15 d樣品中的優勢細菌有乳桿菌屬(52.350%)、乳球菌屬(41.246%)；發酵30 d樣品中的優勢細菌有片球菌屬(2.262%)、魏斯氏菌屬(28.190%)；發酵末期酸筍樣品中的優勢細菌主要為乳桿菌(66.665%)。腸桿菌科隨著發酵時間的推移逐步減少，這是由于乳酸菌發酵產酸，抑制了腸桿菌的生長。乳桿菌多為兼性厭氧菌，具有較強的耐酸能力，更適合在發酵中、后期的低氧環境下生長代謝[14]。

表4 竹筍自然發酵過程不同階段細菌菌群結構分析Table 4 Analysis of bacterial community structure at different stages of natural fermentation of bamboo shoots

根據菌群結構分析結果，從中篩選出相對豐度較高的4個屬水平分類群，分別為乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)和片球菌屬(Pediococcus)，其在不同樣品中的相對豐度見圖2。通過比較發現，1 d時乳球菌屬含量最高，15 d和45 d時占比最高的為乳桿菌屬，30 d時魏斯氏菌屬含量最高。在整個發酵過程中，乳桿菌屬整體含量上的趨勢為先上升后下降再上升，1 d時幾乎沒有，15 d時為52.45%，30 d時為25.35%，45 d時為66.6%；乳球菌屬整體含量上的趨勢為先上升后下降，1 d時占 35.4%，15 d時占41.2%，后期降至10%～20%；魏斯氏菌屬在發酵過程中在0%～30%之間變動，且無明顯規律;片球菌屬含量在發酵前期幾乎沒有，30 d時出現且含量為2.3%。由以上規律可推測，泡菜發酵過程中起主導作用的是乳桿菌屬;在發酵初期作用顯著的是乳球菌屬和魏斯氏菌屬。這與佟婷婷等[15]提出的魏斯氏菌屬在此發酵過程中起到了啟動菌的作用的猜想符合。而整體的乳酸菌含量呈現先增加后減少的趨勢，這與文獻[16]中的結果一致。

圖2 發酵過程中乳酸菌屬水平之間的相對豐度比較Fig.2 Comparison of relative abundance of Lactobacillus during fermentation

2.3 微生物與揮發性風味物質

酸筍中揮發性風味物質的變化受竹筍種類、地域、發酵條件和微生物種群等多種因素的影響，微生物種群可能是酸筍中揮發性風味物質形成的關鍵因素[17-20]。如Yang等[21]研究認為明串珠菌能顯著提高泡菜中揮發性風味物質丁酸乙酯、4-異硫氰基-1-丁烯和2-庚酮的含量。還有研究認為不同菌株之間的代謝互補，會產生一些單菌株無法產生的新的揮發性化合物，并且還會增加揮發性化合物的含量，從而提高泡菜香氣的復雜度[22]。而植物乳桿菌和戊糖片球菌共接種發酵可增加醇類、酯類、醛類、烴類和腈類化合物[23]。

由表5可知，乳桿菌屬和乳球菌菌屬與發酵過程中的揮發性風味物質大多呈正相關；糖單胞菌、嚴格梭狀芽孢桿菌、葡萄球菌等在發酵過程中與大多數揮發性風味物質呈負相關。乳桿菌屬與F5(苯甲酸乙酯)、F6(苯丙酸乙酯)、F7(棕櫚酸乙酯)、F10(大馬酮)、F17(苯酚)都呈正相關，且相關系數較大；乳球菌屬與F4(辛酸乙酯)、F9(反式-2-辛烯醛)、F11(3-乙基-5-(2-乙基丁基)十八烷)呈正相關，與F13(乙酸)、F20(2-甲氧基-5-甲基苯酚)呈顯著負相關；魏斯氏菌屬與F17(苯酚)呈顯著負相關。在發酵酸筍中含量最高的特征風味物質F18(對甲酚)與糖單胞菌、嚴格梭狀芽孢桿菌、片球菌屬、明串珠菌屬、葡萄球菌屬等都存在相關性。

3 結論

本研究以麻竹筍為原料，采用HS-SPME-GC-MS聯用技術對麻竹筍自然發酵中揮發性成分進行分析，結果表明，在整個發酵過程中共檢測出88種揮發性化合物，含量較多的為酚類、醇類、酯類、酸類、醚類；酮類、烷烴類、烯烴類、醛類比較少。對甲酚是酸筍中特殊味道的主體成分，同時，在研究過程中也發現，二甲胺等有害物質隨著發酵過程的進行而消失。環辛醇、環庚醇、乙酸、乳酸、苯酚等物質在發酵中、后期形成。

通過高通量測序對自然發酵過程不同時期的菌群結構分析發現，在竹筍發酵的初期、中期和末期菌群結構多樣性顯著改變。發酵初期優勢細菌菌群主要有乳球菌屬、魏斯氏菌屬和腸桿菌屬等；中期優勢細菌菌群主要有明串珠菌屬和片球菌屬；末期優勢細菌菌群主要是乳桿菌屬等。

菌群與特征揮發性風味物質的相關性分析發現，乳桿菌屬和乳球菌菌屬與發酵過程中的揮發性風味物質大多呈正相關；糖單胞菌、嚴格梭狀芽孢桿菌、葡萄球菌等在發酵過程中與大多數揮發性風味物質呈負相關。在發酵酸筍中含量最高的特征風味物質對甲酚與糖單胞菌、嚴格梭狀芽孢桿菌、片球菌、明串珠菌、葡萄球菌等都存在相關性。研究結果闡明了麻竹筍自然發酵過程中揮發性物質形成與微生物菌群之間的關系，為酸筍中優勢功能菌株的篩選和定向發酵提供了基礎數據。

表5 麻竹筍自然發酵過程優勢菌群與揮發性風味物質的相關性數據Table 5 Correlation data of dominant microbial community and volatile flavor substances during natural fermentation of Dendrocalamus latiflorus

續 表