豆粕鮮味肽的制備及純化脫苦研究

別朋宇，耿予歡

(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510641)

豆粕是大豆脫去油脂后的副產物，含有豐富的蛋白質和氨基酸，但是豆粕由于蛋白高溫變性后人體消化吸收率降低、多種抗營養因子等原因目前在食品領域的開發應用較少[1]。目前對豆粕的研究集中在利用微生物發酵提高飼料的消化利用率以及提取大豆肽兩方面，但是從中繼續分離純化鮮味肽研究較少，這是因為大豆蛋白分解后原本折疊在內部的苦味氨基酸暴露出來[2]，苦味閾值低，極大地影響口感，是制備豆源鮮味肽最大的難題。利用微生物法脫苦相比于β-環糊精掩蓋法、吸附法、酶解法，肽損失率低且成本低。李萍[3]對比β-環糊精掩蓋、黑曲霉酶液脫苦、復合蛋白酶脫苦效果分析，發現利用黑曲霉酶液中酸性蛋白酶不僅脫苦效果最好，多肽損失量也最低。李楊等[4]利用黑曲霉、米曲霉、毛霉混合蛋白酶液對大豆肽進行脫苦，效果顯著。

鮮味是酸、甜、苦、咸、鮮五大基本味覺之一，可以提高人的食欲和愉悅感。近年來，鮮味肽以其營養價值高、鮮味濃厚、易于吸收等特點而受到大家的青睞，也是復合鮮味調味品的重要組成部分[5-7]。范海茹等[8]通過內切酶中性蛋白酶和外切酶復合蛋白酶、風味蛋白酶連續酶解的方式從豆粕中分離出了類似I+G的鮮味肽，這為直接從豆粕中提取鮮味肽提供了可能，但是商業酶不適合工業化生產。本實驗將豆粕進行黑曲霉和米曲霉雙菌制曲酶解，然后通過乙醇分級、葡聚糖凝膠層析分離純化，聯合感官評價得到了鮮味較強的豆粕鮮味肽，探究豆粕鮮味肽的制備和苦味的脫除，為工業化生產提供了理論依據和實驗指導。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

豆粕曲料(米曲霉∶黑曲霉為3∶1雙菌制曲)：由廣東某調味品公司提供。

1.2 試劑

檸檬酸、蔗糖、L-亮氨酸、食鹽、味精(食品級感官評價標品)：廣州化學試劑廠；Sephadex G-15葡聚糖凝膠(色譜純)：美國GE公司；無水乙醇(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設備

HZ-9212BV真空冷凍干燥機 江蘇瑞宇實驗設備有限公司；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司；TG16-WS臺式高速離心機 上海精密科學儀器有限公司；Φ2.6 cm×60 cm玻璃層析柱 北京長流科學儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 曲料基本成分的測定

水分測定按照國家標準GB 5009.3—2016中“直接干燥法”進行檢測；灰分測定按照國家標準GB 5009.4—2016中“高溫灼燒法”進行檢測；蛋白質測定按照國家標準GB/T 5511—2008中“凱氏定氮法”進行檢測；脂質測定按照國家標準GB 5009.6—2016中“索氏提取法”進行檢測；總糖測定采用苯酚硫酸法，參照任曉晨[9]的方法，并做適當修改。

1.4.2 酶解曲料

根據前期探究最佳酶解條件進行酶解：曲料料液比為1∶2.1，酶解溫度為44.5 ℃，自然狀態下酶解5.1 d，所得酶解液經4層紗布過濾，90 ℃滅酶20 min，8 000 r/min離心20 min，取上清液備用。

1.4.3 醇沉分離

參照陳嘉輝[10]的方法，并做適當修改。將得到的酶解液通過旋轉蒸發儀濃縮至固形物含量為50%，取500 mL，加入269 mL食用級無水乙醇使得乙醇濃度為35%(體積比)，常溫下攪拌30 min，8 000 r/min離心15 min得沉淀物和上清液。沉淀物加水復溶、旋蒸、凍干得35%乙醇沉淀組分Ⅰ；根據剩余的上清液體積繼續加入無水乙醇，使其乙醇濃度達到60%，重復以上操作得到60%乙醇沉淀組分Ⅱ；以此類推得到85%乙醇沉淀組分Ⅲ，最后上清液旋蒸、凍干，命名為上清液組分Ⅳ。

1.4.4 感官評價分析

樣品感官評價：由本學院10名品評員(5男5女，味覺敏銳)在感官評價室對質量分數為1%的樣品溶液和不同濃度的標準品進行感官評價并打分，規定標準品為5分，評分范圍為5～10分，最后取其平均值記錄在雷達圖中。選取0.08%檸檬酸溶液、1%蔗糖溶液、0.5% L-亮氨酸溶液、0.7%食用鹽溶液、0.35%味精溶液依次作為酸、甜、苦、咸、鮮的標準品。

豆粕鮮味肽呈味閾值的測定：采用滋味稀釋分析法[11]測定豆粕鮮味肽的感官閾值，配制100～500 mg/L以50 mg/L為梯度增加的一系列稀釋液，按由低濃度到高濃度的順序對樣品的稀釋液依次評定，將某稀釋液剛好與純凈水差異被識別出來的濃度為此物質的呈味閾值，該結果取多位品評員的平均值。

豆粕鮮味肽復合鮮味增強效果測定：分別配制0.35%(質量分數，下同)味精溶液、1%豆粕鮮味肽溶液、0.7%食用鹽溶液、0.35%味精+1%豆粕鮮味肽復合溶液以及0.7%食用鹽溶液+1%豆粕鮮味肽溶液，以0.35%味精溶液為標準品，定為5分，分別對以上溶液打分并取其平均值。

1.4.5 葡聚糖凝膠分離純化

裝柱：將凝膠層析柱豎直固定在鐵架臺上，先向柱中加入少量蒸餾水排除下端氣泡，葡聚糖凝膠攪拌均勻后立即用玻璃棒引流(一次性沿壁勻速倒入)，待其自然沉降后用水壓實6 h，當凝膠和水面相切時開始進樣。

進樣：將醇沉分離得到的鮮味最強組分溶于水，配成濃度為50 mg/mL，過0.22 μm水系濾膜，通過AKTA蛋白純化儀分離純化，每次進樣量為2 mL，流速為1 mL/min，泵壓為0.40 MPa，在214 nm下每4 mL為一管分管收集，然后在同一峰下合并濃縮，凍干成粉，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.4.6 肽分子量測定

色譜條件：流動相：0.02 mol/L KH2PO4緩沖液；凝膠柱：TSK G-5000 PWXL柱(7.8～300 nm)與TSK G-3000 PWXL柱(7.8～300 nm)串聯使用；流速：0.6 mL/min；柱溫：35 ℃；儀器：Waters 2414示差檢測器與工作站GPC。

實驗方法：準確稱取4 mg樣品，溶于2 mL流動相中，用0.45 μm水系濾膜過濾待用。進樣量10 μL，運行時間45 min，利用葡聚糖標準品建立的標準曲線對樣品進行積分，可得分子量大小分布。

1.4.7 氨基酸組成測定

分別取200 mg樣品和50 mg磺基水楊酸加蒸餾水混勻定容到2 mL，于4 ℃冰箱中靜置1 h后以10 000 r/min離心15 min，去除沉淀后以同樣的條件再離心1次，用0.22 μm濾膜過濾后上機。

2 結果與討論

2.1 豆粕曲料中基本成分

檢測了豆粕曲料中主要成分的含量，結果見表1。

表1 曲料中主要成分Table 1 Main components of koji %

2.2 醇沉分離

2.2.1 醇沉分離各組分得率和組成

醇沉各組分得率依次為1.06%、10.99%、5.10%、4.30%，見圖1。組分Ⅱ得率最高，組分Ⅰ最低。各組分物質的組成見圖2。隨著乙醇濃度的升高，總糖含量由15%上升到25%，蛋白含量由66%逐漸下降到52%，水分含量隨著總糖含量的增加有輕微上升的趨勢，但基本維持在20%左右。隨著乙醇濃度的升高，分子量較大的蛋白最先被沉降下來，其次是分子量較小的蛋白和肽段，隨著沉降次數的增多，沉淀下來的蛋白含量也越來越少。但是發酵菌種產生的是一個復合酶系，除產生蛋白酶外還會產生糖化酶、淀粉酶等，也會將豆粕中的多糖進行分解進入酶解液中，乙醇降低水溶液介電常數，使多肽脫水聚集的同時也會使多糖沉淀，因此各組分含有一定量多糖。

圖1 醇沉各組分得率Fig.1 Yield of each component by alcohol precipitation

圖2 醇沉各組分物質組成Fig.2 Composition of each component by alcohol precipitation

2.2.2 醇沉分離各組分感官評價分析

醇沉各組分感官評價見表2。4個組分口感差異較大，其中組分Ⅰ具有顯著的醬油氣味，但是口感比較平淡，且最先被低濃度乙醇沉淀出來，可能主要為分子量較大的蛋白；組分Ⅱ酸味比較突出；組分Ⅲ鮮味突出但是后苦味也比較重；組分Ⅳ苦味很重。

表2 乙醇分離不同組分感官評價特性Table 2 Sensory evaluation characteristics of different components by ethanol separation

醇沉組分感官評價雷達圖見圖3。

圖3 醇沉組分感官評價雷達圖Fig.3 Sensory evaluation radar diagram of components by alcohol precipitation

2.2.3 醇沉分離各組分氨基酸組成

味覺重要的呈味基礎物質來源之一是游離氨基酸，游離氨基酸主要影響味覺受體產生不同的味覺。Kirimura等[12]將氨基酸主要分為3類：疏水性強的一般為苦味氨基酸，疏水性弱的一般為甜味氨基酸，側鏈為酸性基團的為酸性氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸，二者同時具有鮮味，也被稱為鮮味氨基酸。研究表明，目前已發現的鮮味肽中大多數都含有鮮味氨基酸，鮮味的強弱和鮮味氨基酸的含量密切相關[13-14]。醇沉分離各組分的氨基酸組成見表3，組分Ⅲ鮮味氨基酸和甜味氨基酸含量都最高，組分Ⅳ苦味氨基酸含量最高，這與感官評價結果一致。Lioe等[15]對比分析3種傳統日本醬油中超濾得到<500 Da的最鮮美的部分，發現含有大量的游離谷氨酸和引起甜味的氨基酸，且濃度高于其閾值。張佳男[16]研究也發現，甜味氨基酸對鮮味有較大促進作用，可以顯著提高鮮味的厚重味。但組分Ⅲ中苦味氨基酸含量也比較高，如果能將苦味脫除就可得到味道比較鮮的大豆肽。綜上，為了得到豆粕鮮味肽，后續將鮮味評分最高的組分Ⅲ進一步脫苦提鮮。

表3 醇沉分離各組分氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of each component separated by alcohol precipitation g/100 g

2.2.4 醇沉分離各組分肽分子量分布

醇沉分離各組分分子量分布結果見圖4。

圖4 醇沉分離不同組分肽分子量分布圖Fig.4 Molecular weight distribution of peptides of different components separated by alcohol precipitation注：不同標注表示有顯著性差異(P<0.05)。

由圖4可知，4個組分中分子量<5 000 Da都超過80%，說明最佳酶解條件下大豆蛋白已得到充分酶解。隨著乙醇濃度的升高，1 000～3 000 Da的含量逐漸上升，組分Ⅲ和組分Ⅳ中以1 000～3 000 Da的肽段為主，結合各組分感官評分分析，發現小分子肽含量越高，鮮味評分越高。研究表明，具有鮮味、苦味等口感主要為分子量在1 500 Da以下的小分子肽[17]；Rhyu等[18]發現大醬水提物中500～1 000 Da的小分子肽對其鮮味有顯著影響，這和本實驗結果一致。雖然組分Ⅳ中1 000～3 000 Da的含量比組分Ⅲ高，鮮味評分卻并不高，苦味非常突出，結合表3可能是因為其含有最高比例的苦味氨基酸，說明鮮味不僅與其分子量有關，還與其氨基酸組成密切相關。

2.3 葡聚糖凝膠分離純化

2.3.1 凝膠分離各組分得率及組成

將鮮味評分最高的醇沉組分Ⅲ通過Sephadex G-15葡聚糖凝膠得到的分離圖，見圖5。得率及各組分組成分別見圖6和圖7。

圖5 葡聚糖凝膠分離組分Ⅲ響應圖Fig.5 Response diagram of component Ⅲ by dextran gel separation

圖6 凝膠層析各組分得率Fig.6 Yield of each component by gel chromatography

圖7 凝膠層析各組分組成Fig.7 Composition of each component by gel chromatography

由圖5～圖7可知，組分Ⅲ經過葡聚糖凝膠Sephadex G-15被先后分離為4個組分，得率依次為0.94%、3.25%、0.47%、0.06%，其中Ⅲ-2得率最高，這是因為此分子量附近的多肽大量存在，短時間內被大量洗脫出來，組分Ⅲ-4雖然保留時間最長，但是此組分含量較少，得率較低。凝膠層析各組分多肽含量依次遞增，多糖含量依次遞減，水分含量基本維持在18%左右，其中組分Ⅲ-4多肽含量最高，為70%，組分Ⅲ-1和組分Ⅲ-2多糖含量較高，分別為29%和20%。

2.3.2 凝膠分離各組分感官評價分析

對凝膠分離各個組分進行感官評價，結果見表4。

表4 凝膠分離不同組分感官評價特性Table 4 Sensory evaluation characteristics of different components separated by gel

結合表2和表4感官評分綜合分析，經過凝膠分離，組分Ⅲ的鮮味和苦味被分開，鮮味主要集中在組分Ⅲ-2，鮮味評分由4.80提升到7.23，苦味主要集中在組分Ⅲ-3。因此，組分Ⅲ-2作為目標鮮味肽。

凝膠層析各組分感官評價見圖8。

圖8 凝膠層析各組分感官評價Fig.8 Sensory evaluation of each component by gel chromatography

2.3.3 凝膠分離各組分氨基酸組成

對凝膠分離各組分進行氨基酸分析，結果見表5。和醇沉各組分氨基酸含量相比，鮮味氨基酸由被分離組分Ⅲ的 8.685 g/100 g提升到組分Ⅲ-2的9.549 g/100 g，苦味氨基酸由被分離組分Ⅲ的10.060 g/100 g變為組分Ⅲ-3的18.541 g/100 g，結合感官評價結果，說明葡聚糖凝膠層析可以使大豆肽鮮味和苦味分離開，從而達到大豆肽脫苦提鮮的目的，此外，組分Ⅲ-2中鮮味氨基酸含量較高，對其鮮味有很大貢獻作用。雖然組分Ⅲ-3中苦味氨基酸含量約為組分Ⅲ-4的6倍，但是感官評價組分Ⅲ-4比組分Ⅲ-3的苦味更重，說明苦味的強弱除了與苦味氨基酸含量有關，還可能與其分子量或者空間結構有關。

表5 凝膠分離各組分氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of each component separated by gel g/100 g

2.4 豆粕鮮味肽呈味閾值及其復配提鮮效果

測定了豆粕鮮味肽鮮味閾值，并進行了豆粕鮮味肽分別與味精和食鹽復合后鮮味增強效果的測定，結果見表6。

表6 鮮味肽閾值及其復配鮮味評分Table 6 Threshold values of umami peptides and umami scores of their combination

由表6可知，豆粕鮮味肽和味精復合鮮味評分比兩者之和要高，味精雖鮮味較強，但缺乏營養、后味不足，并且過量食用將會引起鈉攝入過多，增大血壓升高等風險，豆粕鮮味肽和味精復合彌補了味精后味不足的缺點。鹽乃百味之王，只有在一定鹽濃度下鮮味、醇厚味等滋味才能更好地刺激味蕾受體[19]，與食鹽復配結果表明食鹽確實對豆粕鮮味肽的鮮味有增強效果，可能與鈉離子和游離谷氨結合形成谷氨酸鈉有關。

3 結論

通過醇沉分離和葡聚糖凝膠層析可以顯著降低大豆肽的苦味，從而制備出鮮味較強的豆粕鮮味肽，得率為3.25%，制備的豆粕鮮味肽含有較高比例的鮮味氨基酸和甜味氨基酸，其鮮味閾值為350 mg/mL，與味精和食鹽復配可顯著提高其鮮味和厚重味。以米曲霉和黑曲霉雙菌發酵制得的豆粕曲料為原料進而提取純化出豆粕鮮味肽，擴展了豆粕利用的途徑，此方法生產成本低，鮮味肽鮮味較強，為工業化生產鮮味肽提供了理論依據。