牡丹籽蛋白水解物對豬油貯藏期間質量的保護作用研究

李艷，李迎秋

(齊魯工業大學(山東省科學院) 食品科學與工程學院，濟南 250353)

食用油脂在貯藏過程中會發生氧化酸敗，不僅風味改變，營養價值下降，而且會產生有害物質，危害人類健康[1-2]。添加抗氧化劑可以防止油脂的氧化酸敗[3]。由于傳統的人工抗氧化劑如BHT、BHA、TBHQ等被證明會產生毒副作用，尋找天然的抗氧化劑來預防油脂的氧化酸敗逐漸成為研究的重點[4]。

很多天然產物已被證明是有效的抗氧化劑且沒有嚴重的副作用。陳莉華等[5]報道麥冬葉總黃酮對植物油和動物油的抗氧化活性強于VC和檸檬酸。郭澤美[6]報道添加0.02%的葡萄皮渣多酚可顯著抑制芝麻油過氧化值的提升，抑制效果強于BHT和TBHQ。頡宇[7]報道添加檸條籽肽顯著抑制了核桃油過氧化值的提升，降低了油脂氧化速率。多肽類由于良好的抗氧化性、安全性以及豐富的營養價值已經成為食品領域的研究熱點[8]。蛋白水解物是多肽的重要來源，由于動物中飽和脂肪酸含量以及畜牧業對環境的破壞性，植物源的蛋白水解物越來越受到人們的關注[9-10]。

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)，毛茛科芍藥屬植物，是我國著名的傳統花卉[11]。牡丹籽蛋白是一種重要的植物蛋白來源，具有良好的理化和功能特性[12]。Wang等[13]采用5種商業蛋白酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶)水解牡丹籽蛋白，表明堿性蛋白酶處理的牡丹籽蛋白水解物(AL-TPSPH)在體外具有最好的自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力以及還原力，顯示出良好的抗氧化活性。然而，目前還沒有關于AL-TPSPH及其超濾組分對油脂質量保護的研究。

因此，本實驗采用Schaal烘箱法,探究牡丹籽蛋白水解物AL-TPSPH及其超濾組分對貯藏期間的過氧化值、酸價、硫代巴比妥酸值、皂化值和碘值等質量指標的保護作用，以期為天然抗氧化劑和牡丹產業的發展提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹籽：由華瑞科技有限公司提供；堿性蛋白酶(alcalase)：購自北京索萊寶生物科技有限公司；冰乙酸；三氯甲烷；碘化鉀；硫代硫酸鈉；可溶性淀粉；95%乙醇；酚酞；氫氧化鉀；鹽酸溶液；環己烷；冰乙酸；韋氏試劑；三氯乙酸；乙二胺四乙酸二鈉；硫代巴比妥酸。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡丹籽蛋白的制備

參照高蕾蕾[14]的方法，采用傳統的堿溶酸沉法制備牡丹籽蛋白。取100 g脫脂的牡丹籽粉，加入1 000 mL蒸餾水并充分攪拌，用 NaOH溶液調節pH值至9.50，置于恒溫磁力攪拌器(50 ℃)上提取3.5 h，冷卻至室溫，離心(4 ℃，6 000 r/min，5 min)取上清，用 HCl溶液調節pH至3.60(等電點)，再次離心(4 ℃，6 000 r/min，5 min)得到沉淀，水洗沉淀3次并調節pH至中性，冷凍干燥后即可得到牡丹籽蛋白，存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 AL-TPSPH及其超濾組分的制備

參照王穎穎等[15]的方法并稍作修改。稱取5 g牡丹籽蛋白溶于 250 mL蒸餾水中，將pH調至8.0，加入1%的堿性蛋白酶，60 ℃酶解3 h，期間加入NaOH溶液來維持pH，隨后，將酶解液煮沸10 min滅酶。冷卻至室溫后，離心(4 ℃，8 000 r/min，20 min)取上清液，一部分上清液進行冷凍干燥即得AL-TPSPH，-20 ℃備用；另一部分上清液依次通過分子截留量為30，10，5 kDa的超濾膜。依次收集>30 kDa,10～30 kDa,5～10 kDa 和<5 kDa的截留液，冷凍干燥后于-20 ℃保存。

1.2.3 乳狀液的制備

AL-TPSPH為水溶性，因此，需要加入乳化劑降低表面張力來制備乳狀液。參照穆同娜[16]的方法并稍作修改：采用油水法進行乳狀液的制備，其中水、乳化劑和豬油的比例為49.5∶1∶49.5，乳化劑采用Span 80 (HLB=4.3)。稱取98 g豬油置于60 ℃水浴鍋中融化，加入1 g乳化劑和98 g水，采用高速均質機以10 000 r/min的轉速均質混合液3 min，制得乳狀液。

1.2.4 AL-TPSPH添加濃度的篩選及過氧化值(POV)的測定

采用Schaal烘箱法，取200 g AL-TPSPH添加量為0.02%、0.1%、0.2%、0.3%以及BHT添加量為0.02%的乳狀液于蜀牛瓶中。將乳狀液置于60 ℃的烘箱中強化保存，每隔24 h攪拌一次，并交換它們在烘箱中的位置。定期測定過氧化值(POV)篩選出合適的AL-TPSPH添加濃度。根據篩選的濃度添加不同分子量(>30 kDa, 10～30 kDa, 5～10 kDa 和<5 kDa)的AL-TPSPH制備乳狀液，置于60 ℃的烘箱中強化保存并定期測定油樣的質量指標。其中，過氧化值(POV)根據GB 5009.227-2016提供的方法進行測定。

1.2.5 硫代巴比妥酸值的測定

參考GB 5009.181-2016提供的分光光度法并進行了一定修改，具體如下：稱取4 g樣品于 50 mL離心管中，準確加入40 mL三氯乙酸溶液(10 g/L)。置于 60 ℃水浴鍋中保溫30 min，用漩渦振蕩器振搖5 min后，于4 ℃ 冰箱中冷藏2 h。用雙層濾紙慢速過濾，取5 mL濾液、三氯乙酸溶液(空白)于25 mL具塞試管中，加入5 mL硫代巴比妥酸水溶液(0.02 mol/L)，加塞，混勻，置于95 ℃水浴鍋中孵育40 min。冷卻至室溫后，用紫外分光光度計于532 nm處測定吸光度值，根據國標方法換算出硫代巴比妥酸值。

1.2.6 碘值的測定

根據GB/T 5532-2008提供的方法進行碘值的測定。

1.2.7 酸價的測定

根據GB 5009.229-2016提供的熱乙醇指示劑滴定法進行酸價的測定。

1.2.8 皂化值的測定

根據GB/T 5534-2008提供的方法進行皂化值的測定。

1.2.9 數據分析

所有實驗均為3個重復，數據均以“平均值±標準差”表示。所有圖形制作均使用Origin 8.0軟件(Microcal, USA)。此外，通過SPSS軟件(Version 23.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA)進行單因素方差分析，通過 LSD(Fisher 's least significant difference)法進行顯著性檢驗，P<0.05定義為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 AL-TPSPH濃度的篩選

圖1 不同濃度AL-TPSPH對豬油貯藏期間過氧化值的影響Fig.1 Effect of different concentrations of AL-TPSPH on peroxide values of lard during storage

過氧化值能夠反映油脂中脂質氫過氧化物的含量，是衡量油脂氧化程度的指標[17]。由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，豬油的過氧化值呈現出上升的趨勢。其中空白對照的過氧化值最高，在貯藏時間為25 d時達到0.859 6 mmol/kg，遠高于氧化的臨界值0.2 mmol/kg。與空白對照相比，AL-TPSPH的加入顯著降低了豬油的過氧化值，且隨著AL-TPSPH添加量的增加，過氧化值呈現降低的趨勢。當AL-TPSPH的添加量為0.2%時，對豬油過氧化值的抑制作用與0.02%的BHT相當。因此，選擇0.2%作為不同分子量AL-TPSPH的添加量。

2.2 AL-TPSPH對豬油貯藏期間過氧化值的影響

圖2 AL-TPSPH對豬油貯藏期間過氧化值的影響Fig.2 Effect of AL-TPSPH on peroxide value of lard during storage

由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，空白對照組的過氧化值顯著提升，貯藏時間為25 d時，過氧化值達到0.859 6 mmol/kg。加入BHT和AL-TPSPH對豬油的過氧化值有明顯的抑制作用，當貯藏時間為25 d時，過氧化值分別為0.024 5(BHT)，0.024 6(混合多肽)，0.082 7(>30 kDa)，0.276 3(10～30 kDa)，0.024 1(5～10 kDa)，0.066 4 (<5 kDa) mmol/kg。其中5～10 kDa的AL-TPSPH顯示出最好的抑制效果，且當貯藏時間為5，10,15 d時，過氧化值一直為0，顯示出最強的脂質氫過氧化物抑制能力。王穎穎[18]報道5～10 kDa的AL-TPSPH中含有最高含量的疏水性氨基酸(42.59%)，增強了清除自由基的能力，這可能是增強其抑制脂質氫過氧化物的重要原因。

2.3 AL-TPSPH對豬油貯藏期間酸價的影響

圖3 AL-TPSPH對豬油貯藏期間酸價的影響Fig.3 Effect of AL-TPSPH on acid value of lard during storage

酸價表示中和1 g游離羧基所需的氫氧化鉀的毫克數，是反映油脂酸敗程度的重要指標[19]。由圖3可知，新鮮的豬油酸價很低，僅為0.83 mg/g。隨著貯藏時間的延長，豬油的酸價整體呈現上升趨勢。當貯藏溫度為60 ℃，貯藏時間為25 d時，空白對照中的油樣酸價為2.77 mg/g，超過了食用油的酸價臨界值2.5 mg/g。加入抗氧化劑抑制了豬油酸價的提升，尤其是10～30 kDa組分的AL-TPSPH，當貯藏時間為25 d時，豬油的酸價僅為1.5 mg/g，強于BHT(1.88 mg/g)。這可能是因為與其他組的AL-TPSPH相比，10～30 kDa組分的AL-TPSPH中含有最高含量的酸性氨基酸(Asp和Glu)，抑制了豬油的酸敗[18]。然而添加>30 kDa 組分的AL-TPSPH時，酸價遠高于空白對照組，這可能是因為此組分含有較多的大分子肽、蛋白等，在貯藏過程中水解產生了較多的羧基基團。

2.4 AL-TPSPH對豬油貯藏期間硫代巴比妥酸值的影響

圖4 AL-TPSPH對豬油貯藏期間硫代巴比妥酸值的影響Fig.4 Effect of AL-TPSPH on thiobarbituric acid value of lard during storage

硫代巴比妥酸值可以反映不飽和脂肪酸的氧化產物醛類如丙二醛等的含量，也是衡量油脂氧化程度的重要指標[20]。由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，所有組的硫代巴比妥酸值均呈現上升趨勢。當貯藏時間為25 d時，空白對照組的硫代巴比妥酸值已顯著提升至0.944 5 mg/kg，而其他組的硫代巴比妥酸值分別為0.196 7(BHT)，0.182 7(混合多肽)，0.165 2(>30 kDa)，0.474 1(10～30 kDa)，0.184 2(5～10 kDa)，0.140 5(<5 kDa) mg/kg。結果表明，加入BHT和AL-TPSPH均對貯藏期間豬油硫代巴比妥酸值的提升有明顯抑制作用，且AL-TPSPH(混合物)，>30 kDa，5～10 kDa 以及<5 kDa 組分的AL-TPSPH的抑制作用與 BHT 相當。

2.5 AL-TPSPH對豬油貯藏期間皂化值的影響

油脂的皂化值可以反映其相對分子質量大小[21]。貯藏期間不同處理方式下豬油皂化值的變化情況見圖5。

圖5 AL-TPSPH對豬油貯藏期間皂化值的影響Fig.5 Effect of AL-TPSPH on saponification value of lard during storage

總體來看，豬油的皂化值在貯藏期間呈現先上升后下降的趨勢，但不同的處理方式之間無顯著性差異，表明AL-TPSPH和BHT對豬油的皂化值影響不大，所有處理組豬油的相對分子質量無明顯變化。

2.6 AL-TPSPH對豬油貯藏期間碘值的影響

碘值是反映油脂不飽和程度的指標。油脂被氧化后，碘值下降[22]。貯藏期間不同處理方式下豬油碘值的變化情況見圖6。

圖6 AL-TPSPH對豬油貯藏期間碘值的影響Fig.6 Effect of AL-TPSPH on iodine value of lard during storage

所有處理組豬油碘值均呈現下降趨勢，這說明所有組的豬油均發生了不同程度的氧化。當貯藏時間為25 d時，空白處理組豬油的碘值最低，為43.92 g/100 g。加入BHT和AL-TPSPH后一定程度上抑制了豬油碘值的下降，在貯藏時間為25 d時，碘值分別為48.78(BHT)，47.11(混合多肽)，48.8(>30 kDa)，47.97(10～30 kDa)，49.66(5～10 kDa)，46.65(<5 kDa) g/100 g。其中抑制作用最好的 5～10 kDa組分的AL-TPSPH與過氧化值一致。

3 結論

總的來說，添加0.2%的AL-TPSPH對豬油貯藏期間的過氧化值、酸價、硫代巴比妥酸值以及碘值等質量指標的改變顯示出強大的保護作用。其中，5～10 kDa組分的AL-TPSPH對豬油過氧化值提升和碘值下降的抑制作用最強，優于BHT。10～30 kDa組分的AL-TPSPH對豬油酸價的提升顯示出最好的抑制作用，優于BHT。除了10～30 kDa組分的AL-TPSPH外，所有組分的AL-TPSPH均對豬油硫代巴比妥酸值的提升顯示出良好的抑制效果，與 BHT 相當，而BHT和AL-TPSPH對豬油的皂化值無明顯作用。因此，牡丹籽蛋白水解物可以顯著抑制油脂的過氧化，尤其是5～10 kDa的超濾組分，為抗氧化劑的開發以及牡丹籽粕的綜合利用提供了更為廣闊的思路。