富順香辣醬主要原輔料中食源性致病細菌的分離鑒定

袁先鈴，張洲銪，袁玉梅，汪創，王俊丁，雷鳴

(1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000;2.四川省遠達集團富順縣美樂食品有限公司，四川 自貢 643200)

富順香辣醬是以干辣椒和花椒為主要原輔料的一種半固態復合調味料，屬于非發酵類辣椒醬，于2010年被列入國家地理標志產品。香辣醬除了具有紅油鮮亮、醬體醇厚、濃郁鮮香、營養豐富的特點外，還具有促進食欲、改善消化的保健功效[1]。

辣椒屬熱帶漿果類蔬菜，如今中國已是辣椒生產和消費的大國[2]。新鮮辣椒經過自然晾曬或人工烘烤脫水得到干辣椒，干辣椒作為我國傳統的調味佳品[3]，被廣泛應用于調味的食品添加劑和食品配料[4]，賀稚非等[5]研究發現鮮辣椒表面的微生物以細菌最多，而酵母菌和霉菌較少；張曉玲[6]的研究表明，在重慶市售的10種干辣椒樣品中分離得到13種細菌。花椒分布在中國大部分地區，是川菜烹飪中必不可少的調味料，董丹等[7]研究發現市售花椒粉中菌落總數達到5.4×105CFU/g，而大腸菌群數則達到2.1×105MPN/100 g。八角是中國傳統的藥食同源性的香料[8]，因其含有反式茴香腦等多種有效抑菌成分，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等常見致病菌具有較高抑菌活性[9]。2012年湖南省質監局抽查發現永豐辣醬有限公司生產的永豐辣醬菌落指數超標23.5倍[10]。

目前關于香辣醬的研究主要集中于發酵辣椒醬的生產工藝、貨架期、農藥殘留以及微生物分析方面[11-16]，對于非發酵辣椒醬的研究主要集中于生產工藝方面[17-19]，微生物分析方面的研究相對較少。由于原輔料本身帶有大量的微生物，導致香辣醬產品質量不穩定，因此針對香辣醬主要原輔料中的食源性致病菌進行檢測，確定具有相對優勢的食源性致病細菌，并進行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

香辣醬及其原輔料干辣椒、花椒、八角：由四川省遠達集團富順縣美樂食品有限公司提供。

1.2 試劑

氧化鈉(分析純)：天津市福晨化學試劑有限公司；結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBGA)、緩沖蛋白胨水(BPW)、營養瓊脂(NA)、改良胰蛋白胨大豆肉湯、哥倫比亞CNA血瓊脂、哥倫比亞血瓊脂、李氏增菌肉湯、PALCAM瓊脂、李斯特氏菌顯色平板、四硫磺酸鈉煌綠增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、氯化鈉堿性蛋白胨水、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖(TCBS)瓊脂：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.3 主要儀器與設備

YXQ-75SII 立式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2FD 凈化工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；PH100-2A41L-EP 生物顯微鏡 深圳市潤興光學儀器有限公司；GZX-9140MBE 電熱鼓風干燥箱 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；電子天平 慈溪市天東衡器廠；SPX-100B-Z 生化培養箱 上海培因實驗儀器有限公司；3730XL測序儀、2720 Thermal Cycler PCR儀 美國ABI公司；JY04S-3C 凝膠成像儀 北京君意東方電泳設備有限公司；Legend Micro 17離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 常見食源性致病菌檢測方法

根據GB 4789.4-2016[20]、GB 4789.10-2016[21]、GB 4789.41-2016[22]、GB 4789.30-2016[23]、GB 4789.7-2013[24]、GB 4789.11-2014[25]，對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌科、單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、β型溶血性鏈球菌進行處理及檢測。

1.4.2 腸桿菌科疑似菌生理生化鑒定方法

對篩選出的食源性致病細菌疑似菌進行革蘭氏染色、乙酰甲基甲醇(V.P.)、甲基紅(M.R.)、糖發酵、吲哚、明膠液化、接觸酶、尿素水解等生理生化實驗，以判斷菌的屬[26]。

1.4.3 腸桿菌科疑似菌分子生物學鑒定方法

操作步驟：基因組DNA 提取：按DP336 試劑盒提取；PCR 擴增；凝膠電泳：1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 20 min 電泳觀察；純化回收：PCR 產物的電泳條帶切割所需DNA靶帶，純化后的PCR產物直接用前體物測序。

將純化后的菌株送到擎科生物有限公司進行16S rDNA測序；將得到的序列用BLAST軟件進行對比分析[27]，在NCBI數據庫中進行比較；根據比對的結果再結合生理生化實驗確定鑒定的菌種。利用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹。

1.5 數據處理和分析

利用Excel 2016統計分析數據。

2 結果與分析

2.1 常見食源性致病細菌檢測結果

富順香辣醬及主要原輔料中食源性致病細菌檢測結果見表1。

表1 富順香辣醬及主要原輔料中食源性致病細菌檢測結果Table 1 Detection results of foodborne pathogenic bacteria in Fushun spicy sauce and its main raw and auxiliary materials

續 表

由表1可知，干辣椒和花椒中均檢出腸桿菌科疑似菌、沙門氏菌疑似菌、金黃色葡萄球菌疑似菌、副溶血性弧菌疑似菌和β型溶血性鏈球菌疑似菌，與Doren等[28]在辣椒等香料中檢測出包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、坂崎克羅諾桿菌、梭狀芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的結果基本吻合；八角中未檢出上述致病菌，可能是因為八角中的茴香油對食品常見細菌有明顯的抑制作用[29]；在成品中也未檢出上述6類致病菌，說明在后續工藝過程中能夠殺滅上述食源性致病細菌。花椒中金黃色葡萄球菌數量較少，可能是因為花椒提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌效力遠大于辣椒提取液[30]。干辣椒中的腸桿菌科疑似菌和金黃色葡萄球菌疑似菌的數量比花椒中多，與姜太玲等[31]研究得出花椒籽蛋白抗菌肽對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用的結果相符；Wang等[32]研究出花椒精油對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和單核增生乳桿菌)的抑菌圈大于革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的結果與本研究腸桿菌科疑似菌的數量明顯大于金黃色葡萄球菌疑似菌和單增李斯特氏菌的數量相符。干辣椒和花椒中腸桿菌科疑似菌的數量多于金黃色葡萄球菌疑似菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，腸桿菌科為革蘭氏陰性菌，可能是因為辣椒和花椒中的抑菌成分通過影響細胞壁的結構從而達到抑制效果[33-34]。

原輔料中各食源性致病細菌菌落形態特征見表2。

表2 富順香辣醬主要原輔料中食源性致病細菌部分疑似菌菌落形態Table 2 Colonial morphology of some suspected foodborne pathogenic bacteria in the main raw and auxiliary materials of Fushun spicy sauce

續 表

由表2可知，從數量和種屬分類上推測腸桿菌科菌為富順香辣醬主要原輔料中的相對優勢致病菌，研究結果與賀稚非等[35]研究的辣椒中的革蘭氏陰性桿菌多數是腸桿菌科菌，劉會平等研究的未經輻照處理的花椒粉的大腸菌群數處于較高水平結果相一致。因此，擬定對腸桿菌科疑似菌進行進一步的分離純化、生理生化和分子生物學的鑒定分析。

2.2 腸桿菌科疑似菌鑒定結果

2.2.1 腸桿菌科疑似菌生理生化鑒定結果

從主要原輔料干辣椒中分離出腸桿菌科疑似菌11株，花椒中分離出腸桿菌科疑似菌8株，其生理生化鑒定結果見表3。

表3 富順香辣醬原輔料中腸桿菌科疑似菌生理生化鑒定結果Table 3 Physiological and biochemical identification results of suspected Enterobacteriaceae in raw and auxiliary materials of Fushun spicy sauce

2.2.2 分子生物學鑒定結果

圖1 部分代表性腸桿菌科疑似菌16S rDNA序列PCR擴增序列電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified sequence of 16S rDNA sequence of some representative suspected Enterobacteriaceae bacteria

圖1中序號與表3中菌株編號相對應。由圖1可知，6條泳道在1 500 bp左右位置都出現了均一亮條，且無特異性擴增，符合測序要求。將條帶清晰的PCR 擴增產物進行測序，測序結果經BLAST比對，選取相似度大于99%且比對分數最高的序列，確定種屬。

利用聚類分析軟件MEGA 6.0將原輔料中的腸桿菌科疑似菌的拼接序列進行聚類分析，采用鄰位相連法(Neighbor-Joining)建立系統發育樹，見圖2。原輔料中腸桿菌科疑似菌鑒定結果見表4。

圖2 香辣醬原輔料中腸桿菌科疑似菌系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of suspected Enterobacteriaceae in the raw and auxiliary materials of spicy sauce

表4 富順香辣醬原輔料中腸桿菌科疑似菌分子生物學鑒定結果Table 4 Molecular biological identification results of suspected Enterobacteriaceae in raw and auxiliary materials of Fushun spicy sauce

續 表

結合生理生化和分子生物學鑒定結果可知，從富順香辣醬原輔料干辣椒和花椒中鑒定出腸桿菌科致病菌13株。其中干辣椒中有6株腸桿菌科致病菌，分別為大腸桿菌(Escherichiacoli)、克羅諾桿菌(Cronobacterzurichensis)、Enterobacterbugandensis、弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、腸桿菌屬(Enterobactersp.)、成團泛菌屬(Pantoeaagglomerans)。花椒中有7株腸桿菌科致病菌，分別為歐文氏菌屬(Erwiniasp.)、阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、塔斯馬尼亞歐文氏菌(Erwiniatasmaniensis)、桃色歐文氏菌(Erwiniapersicina)、致癌腸桿菌(Enterobactercancerogenus)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)。

3 結論

本研究通過檢測香辣醬原輔料中幾種常見食源性致病菌，確定相對優勢食源性致病細菌，并對該相對優勢食源性致病細菌進行分離純化，對純化后的菌落進行生理生化實驗和16S rDNA鑒定分析，研究結果表明，干辣椒和花椒中腸桿菌科疑似菌的數量相對較多，從鑒定結果的數量和種屬分類上可以確定，在富順香辣醬主要原輔料中腸桿菌科菌為常見食源性致病細菌(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌科、單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、β型溶血性鏈球菌)中相對優勢的致病性細菌。干辣椒和花椒中共檢測出19株腸桿菌科疑似菌，結合生理生化和16S rDNA分子測序鑒定出腸桿菌科菌13種。針對富順香辣醬主要原輔料中食源性致病細菌的檢測、分離與鑒定，能夠了解富順香辣醬原輔料和產品中致病性細菌情況，為香辣醬生產過程的安全控制提供一定的理論基礎。