響應面法結合模糊數(shù)學優(yōu)化復合棗醋醋酸發(fā)酵工藝

王曉婧,楊倩,白博濤,趙泉

(山西工商學院，太原 030006)

壺瓶棗是山西省太谷縣的一大特色農產品,棗肉中的類黃酮、總酚等含量十分高[1]。壺瓶棗含糖量高,還原糖含量接近總糖含量的75%,可以很好地被酵母菌等發(fā)酵微生物利用[2]。由于壺瓶棗成熟后容易落果,雨天出現(xiàn)大量裂棗,不利于運輸儲存,造成很多浪費而影響收入,裂棗的開發(fā)利用成為研究熱點[3]。山西呂梁的沙棘占地面積廣,沙棘是一種落葉灌木或小樹[4],沙棘果實營養(yǎng)物質豐富,氨基酸是鹿茸的5倍；多酚類化合物是人參的4倍；維生素含量最高,是蘋果的200多倍,被稱為“VC之王”[5-6]。

壺瓶棗含糖量高,有利于酵母菌發(fā)酵,不需要添加糖類也可以達到發(fā)酵所需的糖度[7],而沙棘含糖量低,有機酸高,難以單獨發(fā)酵[8],因此可以將沙棘加入到棗漿中調節(jié)pH,將兩者的優(yōu)點集中在一起,進行酵母菌和乳酸菌混菌發(fā)酵后,進一步進行醋酸發(fā)酵,釀制成壺瓶棗沙棘復合果醋。

本試驗以壺瓶棗和沙棘為原料,通過酶解、酵母菌和乳酸菌混合酒精發(fā)酵以及醋酸發(fā)酵,制作出一款新型的壺瓶棗沙棘復合棗醋,該棗醋不僅具有壺瓶棗和沙棘果實的營養(yǎng),還具有果醋的功能。在單因素試驗的基礎上,通過模糊數(shù)學法對棗醋進行較為客觀的評價,并采用Box-Behnken試驗設計響應面分析,對壺瓶棗醋醋酸發(fā)酵階段的發(fā)酵條件進行工藝優(yōu)化,為壺瓶棗和沙棘的深加工提供最佳條件。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

壺瓶棗(裂棗);沙棘:太原市小店區(qū)美特好超市;安琪葡萄酒·果酒專用酵母RW:安琪酵母股份有限公司;保加利亞乳桿菌:西安綠騰生物科技有限公司;果膠酶:巧家女旗艦店;醋酸菌:山西工商學院食品質量與安全實驗室;鹽酸(HCl)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、乙酸鋅[Zn(CH3COO)2·2H2O]、冰乙酸(C2H4O2)、酚酞、無水乙醇:分析純,天津市風船化學試劑科技有限公司;亞甲藍(C16H18ClN3S·3H2O)、無水葡萄糖:分析純,天津市北辰方正化學試劑廠;酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6·4H2O):分析純,天津市凱通化學試劑有限公司;亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6·3H2O]:分析純,天津市申泰化學試劑有限公司;酵母浸粉:分析純,南京茂捷微生物科技有限公司;丙三醇:分析純,天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BCD-521WDPW 冰箱 青島海爾集團;JA2003電子天平 上海菁海儀器有限公司;HH-T600電熱恒溫水浴鍋 常州市雙舜儀器設備有限公司;JP12D-800多功能榨汁機 蘇泊爾集團有限公司;HH-S2數(shù)顯二孔恒溫水浴鍋、TS-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱、TGL-16GB高速臺式離心機 常州市金壇大地自動化儀器廠;萬用電爐、酒精計 北京科偉永興儀器有限公司;PHS-3C實驗室pH計 上海佑科儀器儀表有限公司;WZ-108折光儀 北京萬成北增精密儀器有限公司;YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-2FD超凈工作臺 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;101-1A恒溫鼓風干燥箱 天津利康實驗室設備有限公司;移液槍 上海求精儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合果醋的釀造工藝流程

壺瓶棗、沙棘→篩選→清洗→預煮→打漿→酶解(果膠酶)→壺瓶棗沙棘混合液→接種(酵母菌RW、保加利亞乳桿菌)→酒精發(fā)酵→發(fā)酵結束→接種醋酸菌→ 醋酸發(fā)酵→過濾→調配→殺菌→壺瓶棗沙棘復合醋。

1.3.2 操作要點

原料挑選:新鮮的壺瓶棗(半紅期至全紅期裂棗)、沙棘。

破碎、榨汁:破碎、去核,將果肉放入多功能榨汁機中,按質量比加入水打漿,再將棗漿與沙棘汁按4∶1 的比例混勻,得到混合液[9]。

酶解:將混合液升溫至55 ℃,并加入0.2%的果膠酶,恒溫酶解3.5 h,于90 ℃ 水浴鍋中滅酶5～10 min。

酒精發(fā)酵:在酶解完成的混合液中,接入0.2%安琪酵母和0.08%保加利亞乳桿菌,置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行48 h混合菌種的酒精發(fā)酵[10]。

醋酸菌培養(yǎng)、保藏與擴培:醋酸菌液體培養(yǎng)基:葡萄糖、酵母浸粉、蒸餾水按1∶1∶100的質量比配制液體培養(yǎng)基(pH 5.5),在高壓滅菌鍋中滅菌20 min,冷卻后加入4%的無水乙醇[11]。醋酸菌的培養(yǎng):超凈工作臺紫外殺菌30 min,向盛有50 mL液體的培養(yǎng)基中加入1.8 mL的無水乙醇,混勻,再將醋酸菌菌液吸取500 μL至液體培養(yǎng)基的三角瓶中混勻,用3層紗布封口(達到有氧條件),并在30 ℃、轉速200 r/min 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[12-13]。醋酸菌種的保藏:將培養(yǎng)完的菌液分裝入丙三醇和水按1∶1配制的甘油管中,并將其用封口膜封口,再將其冷凍保藏。醋酸菌的擴培:用第一次培養(yǎng)的醋酸菌菌液進行第二次菌種擴培,向200 mL液體培養(yǎng)基中加入8 mL的無水乙醇,再加入10 mL二次擴培的菌液,用3層紗布封口后,在200 r/min、30 ℃的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h,最終醋酸菌菌液酸度達到3.2 g/L。

過濾、殺菌:在醋酸發(fā)酵結束后,在發(fā)酵液中加入發(fā)酵液1.5%的食鹽,終止醋酸菌的活性[14],過濾后在85 ℃的條件下巴氏殺菌15 min。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 發(fā)酵溫度

按照1.3.2中酒精發(fā)酵的方法發(fā)酵,酒精度為6.1%,向其中接入6%的醋酸菌,分別放在28,30,32,34,36 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫振蕩發(fā)酵,每隔12 h取一次樣,并測其總酸,直到總酸穩(wěn)定,發(fā)酵結束,根據(jù)總酸確定最佳發(fā)酵溫度[15]。

1.3.3.2 醋酸菌接種量

按照1.3.2中酒精發(fā)酵的方法發(fā)酵,酒精度為6.1%,向其中分別接入2%、4%、6%、8%、10%的醋酸菌,均放置在32 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫振蕩發(fā)酵,每隔12 h取一次樣,并測其總酸,直到總酸穩(wěn)定,發(fā)酵結束,根據(jù)總酸確定最佳接種量。

1.3.3.3 發(fā)酵時間

按照1.3.2中酒精發(fā)酵的方法發(fā)酵,酒精度為6.1%,向其中接入8%的醋酸菌,放置在32 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫振蕩發(fā)酵,每隔12 h取一次樣,并測其總酸,直到總酸穩(wěn)定,發(fā)酵結束,根據(jù)總酸確定最佳發(fā)酵時間。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗設計

根據(jù)單因素試驗對發(fā)酵沙棘壺瓶棗復合棗醋進行結果分析,利用Box-Behnken試驗設計,確定響應面試驗的因素水平并建立回歸模型。響應面試驗見表1[16-18]。

表1 響應面試驗設計因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test design

1.3.5 模糊數(shù)學評價

以色澤、組織形態(tài)、香氣、滋味為4個評價因素集,其所占權重分別為0.2,0.3,0.2,0.3,得到因素權重集X={0.2,0.3,0.2,0.3}。將評語等級分為優(yōu)(90分)、良(75分)、差(60分),得到評語等級集T={90,75,60}。確定10位評價員按照事先制定好的評定方法和標準對不同單因素的復合棗醋進行感官評定[19]。感官評定標準見表2。

表2 壺瓶棗沙棘復合棗醋的感官評定標準表Table 2 The sensory evaluation standard table of Huping jujube and sea buckthorn compound jujube vinegar

通過統(tǒng)計的結果,利用模糊數(shù)學原理進行評價結果分析。首先將4個評價因素的3個等級得到的人數(shù)除以評價員總人數(shù)10,得到模糊數(shù)學關系矩陣R,由此可以確定模糊關系評價集Y=X×R,最后確定復合棗醋的模糊數(shù)學綜合評價總分Z=Y×T。

1.3.6 總糖、還原糖的測定

參考GB 5009.7-2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》。

1.3.7 酒精度的測定

參考GB 5009.225-2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》。

用蒸餾法蒸餾,取100 mL發(fā)酵液于500 mL圓底燒瓶中,加入50 mL蒸餾水,放4顆沸石在水浴鍋中蒸餾,將蒸餾出的溶液定容到100 mL量筒中,將酒精計放入量筒中,同時用溫度計測量溫度,靜置5 min,讀取刻度線數(shù)值,記錄溫度,將讀取的數(shù)據(jù)按附錄進行溫度校正,得到20 ℃時發(fā)酵液的酒精度[20-21]。

1.3.8 總酸的測定

參考GB 12456-2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 發(fā)酵溫度對總酸的影響

根據(jù)1.3.3.1單因素試驗中的方法,不同溫度下隨著發(fā)酵時間的變化測定的總酸變化情況見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對總酸的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on total acid

由圖1可知,在不同發(fā)酵溫度條件下,總酸均在72 h時達到最高值,表明發(fā)酵結束。32 ℃時,其總酸最高,為14.19 g/L。當溫度高于32 ℃時,整個發(fā)酵過程中總酸都較低，原因可能是醋酸菌處在高溫的環(huán)境中,使醋酸氧化生成了二氧化碳和水,從而降低了酸度。在28 ℃時總酸較低，原因可能是醋酸菌所處環(huán)境溫度過低,從而抑制了醋酸菌的生長活性。從整體變化上看,溫度過低或過高都不利于醋酸菌的生長繁殖,使其產酸能力下降。

2.1.2 醋酸菌接種量對總酸的影響

根據(jù)1.3.3.2單因素試驗的方法,不同醋酸菌接種量在32 ℃時測定的總酸變化情況見圖2。

圖2 醋酸菌接種量對總酸的影響Fig.2 Effect of inoculation amount of acetic acid bacteria on total acid

由圖2可知,不同接種量的總酸都隨著發(fā)酵時間的延長而呈逐漸上升的趨勢,均在72 h時達到最大值,表明發(fā)酵結束。當接種量為8%時,其總酸最高,為15.18 g/L。當接種量小于8%時,總酸都較低，原因可能是醋酸菌菌種的添加量較少,使其產酸較少,導致總酸降低。當接種量為10%時,可能由于醋酸菌的添加量過多,使其大量生長繁殖，反而造成發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質不斷損耗,最終導致總酸降低。

2.1.3 發(fā)酵時間對總酸的影響

根據(jù)1.3.3.3單因素試驗的方法,在32 ℃、接種量8%時,總酸隨時間延長的變化情況見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對總酸的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total acid

由圖3可知,隨著時間的延長,總酸不斷升高。最終在72 h時總酸達到最大值15.18 g/L。

2.2 模糊數(shù)學評價結果

通過模糊數(shù)學綜合評價方法,參照表2的感官評價標準對不同參數(shù)條件下的復合棗醋進行感官評價,評價結果見表3。

表3 復合棗醋的感官評分結果Table 3 The sensory scoring results of compound jujube vinegar

從10位評價人員的評價結果的差異性中，可以建立出模糊矩陣。例如，1號樣品的評價結果，色澤方面：優(yōu)5人，良2人，差3人；組織狀態(tài)方面：優(yōu)7人，良2人，差1人；香氣方面：優(yōu)4人，良5人，差1人；滋味方面：優(yōu)5人，良2人，差3人。

同理，可得到評價結果集，見表4。

表4 復合棗醋的評價結果集Table 4 The evaluation result set of compound jujube vinegar

續(xù) 表

由表4可知,樣品12號、10號、16號的感官評分較高,分別為87.3,86.6,86.6分。

2.3 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理,進行三因素三水平試驗,設計了17組試驗,試驗設計及結果見表5[22-23]。

表5 響應面試驗的設計及結果Table 5 The design and results of response surface test

表6 總酸的回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 6 Regression model variance analysis and significance test of total acid

續(xù) 表

根據(jù)表5中總酸的試驗數(shù)據(jù)對其進行二次多項回歸擬合，可以得到回歸方程：Y=15.17-0.39A+0.32B+0.73C+0.33AB+0.018AC-1.10BC-1.46A2-0.35B2-1.95C2。

由表6可知,在總酸方面,該模型的P值<0.01,說明模型具有極顯著性。發(fā)酵時間(A)和醋酸菌接種量(B)兩因素的交互作用具有顯著性,醋酸菌接種量(B)與發(fā)酵時間(C)二者的交互作用具有極顯著性。RAdj2和RPred2之間的差值<0.2,說明模型和變異系數(shù)較高,模型的準確性較高。失擬項的P>0.05,不顯著,表明擬合程度好。R2=0.987 8,說明建立的模型可以解釋98.78%的響應值。F值表明對總酸的影響,F值越大,其對總酸的影響越大,所以,各因素對復合棗醋總酸的影響作用大小為發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>醋酸菌接種量。

a

由圖4中的等高線圖和3D 響應曲面圖可以得出3個單因素對總酸的影響,因素之間交互作用的強弱可以通過分析等高線圖中的線條和形狀來判斷,線條越密集越多、形狀越趨于橢圓形,其影響作用越大;在3D圖中的坡度越陡,其交互作用影響越大;反之對因素的影響越小。由圖4中a和b可知,因素A發(fā)酵溫度比因素B醋酸菌接種量的線條更密集,發(fā)酵溫度的響應曲面圖的坡度更陡,證明發(fā)酵溫度較醋酸菌接種量對交互作用的影響更大。同理,分析圖4中c, d, e, f 可知,發(fā)酵時間較發(fā)酵溫度、醋酸菌接種量的影響作用更強。綜上可知,3個因素對復合棗醋總酸的影響大小順序為發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>醋酸菌接種量,該響應面圖的分析結果與回歸模型的方差分析結果一致。

以總酸為指標的響應面優(yōu)化試驗預測得出最佳工藝為發(fā)酵溫度31.79 ℃、醋酸菌接種量8.44%、發(fā)酵時間73.49 h,總酸為15.26 g/L。對其進行驗證試驗和模糊數(shù)學感官評價,總酸為15.29 g/L,與響應面預測值相近,感官評分為87.41分。

表7 感官評分的回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 7 Regression model variance analysis and significance test of sensory score

根據(jù)表7中對感官評分的回歸模型方差分析，可以得到二次回歸方程：Y=86.34-0.96A+0.86B+1.67C+1.84AB-0.38AC-2.21BC-3.38A2-2.22B2-3.38C2。

由表7可知,該模型的P值為0.000 1,表明該試驗的感官評價得到的二次多項模型差異具有極顯著性。依據(jù)顯著性分析可得,交互項AB、BC的P值均小于0.01,說明二者的交互作用對感官評分的影響都極顯著。失擬項的P>0.05,不顯著,說明模型與試驗數(shù)據(jù)擬合度良好。通過對比分析各因素對響應值的影響,可知復合棗醋感官評分的影響作用大小為發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>醋酸菌接種量[24]。

a

由圖5可知,3個因素間交互作用對感官評分的影響大小同對總酸的作用影響分析方法相同,感官評分方面:發(fā)酵溫度的影響比醋酸菌接種量更大,發(fā)酵時間的影響比醋酸菌接種量更大。綜上可知,發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>醋酸菌接種量,該結果與方差分析所得結果一致[25]。

以感官評分為指標進行響應面優(yōu)化試驗預測得出最佳工藝條件為發(fā)酵溫度31.69 ℃、醋酸菌接種量8.01%、發(fā)酵時間75.05 h,該條件下感官評分為86.627 4分。該預測值與模糊數(shù)學評價結果相近,說明該模型的擬合程度較好。

2.4 響應面結果驗證試驗

為了驗證響應面預測結果的準確性,以感官評分為評價指標,在最佳條件下做3次平行試驗,工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度31.69 ℃、醋酸菌接種量8.01%、發(fā)酵時間75.05 h,此條件下的總酸為15.31 g/L,感官評分為86.7分,與響應面的理論預測值相近。在總酸的響應面驗證試驗中,其最優(yōu)工藝評分為85.5分,說明不能直接由總酸判斷棗醋的風味品質。

3 結論

通過以壺瓶棗沙棘復合棗醋的總酸和感官評分為指標進行響應面優(yōu)化,在進行驗證試驗后,確定制備該復合棗醋的最佳條件為發(fā)酵溫度31.69 ℃、醋酸菌接種量8.01%、發(fā)酵時間75.05 h,此條件下總酸為15.31 g/L,感官評分為86.7分。發(fā)酵的復合棗醋的棗醋味濃郁同時伴有沙棘醋味,呈澄清明亮的淺琥珀色,香味柔和。