微生物源乳酸鏈球菌素(Nisin)及在食品中應用研究進展

姚文俊，楊勇，劉希，童星*

(1.廣東海天創(chuàng)新技術有限公司,廣東 佛山 528000;2.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司,廣東 佛山 528511)

食品在生產(chǎn)及使用儲存過程中,面臨著微生物污染導致的食品腐敗、貨架期縮短等問題,而傳統(tǒng)的化學防腐劑已難以滿足人們追求綠色、健康、環(huán)保的食品消費觀念。因此,天然抑菌劑成為各個食品公司追求的熱點,越來越多的食品都向著天然健康、不含化學防腐劑的方向發(fā)展。乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種天然、高效、無毒的抑菌物質(zhì),在食品中得到廣泛的應用。本研究結合國內(nèi)外的研究進展,對Nisin的結構、生物合成及其在食品中的防腐、保鮮、提質(zhì)、可降解包材等作用方面的應用研究進展進行綜合論述,為后續(xù)研究提供參考。

1 乳酸鏈球菌素(Nisin)概述

1.1 乳酸鏈球菌素(Nisin)的結構

細菌素是由革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)化合物。1928年研究人員首次發(fā)現(xiàn)了乳酸菌產(chǎn)生的細菌素。隨后該細菌素于1971年被鑒定命名為乳酸鏈球菌素(Nisin)。

乳酸鏈球菌素(Nisin)屬于Ⅰ型羊毛硫菌素,由5個硫醚環(huán)狀結構和34個氨基酸構成,分子量約為3 500 Da,結構中主要包含多個特征氨基酸,如羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、脫氫丙氨酸(位置5 和33)、脫氫丁氨酸(位置2)、氨基丁酸。賴氨酸和異亮氨酸分別位于C端和N 端[1]。C端和N 端為兩個特征結構域,C端由D和E 2個硫醚環(huán)組成,D端由A、B、C 3個硫醚環(huán)組成,C端和D端之間由一條柔韌的鉸鏈區(qū)銜接,構成其獨特的結構特征,該結構及氨基酸分布導致Nisin具有高等電點(pH 9)及在寬范圍的pH 條件下都帶正電荷,pH 越高,溶解性越低,其抑菌活性越低[2]。

天然的乳酸鏈球菌素含有多個異構體,主要為Nisin A,具體結構見圖1。

圖1 Nisin A結構Fig.1 Structure of Nisin A

不同的異構體之間存在的某一位或者某幾位的氨基酸殘基不同,導致其部分功能活性也不同。如Nisin A與Nisin Z之間的不同在于第27 位氨基酸殘基,Nisin A 為組氨酸殘基,而Nisin Z的27位為天冬氨酸殘基[3]。但是Nisin Z相比于Nisin A 具有更好的擴散性及更高的溶解性[4]。Laridi等[5]研究發(fā)現(xiàn)針對抑制梭狀芽孢桿菌,Nisin A 的MIC(最小抑菌濃度)為0.8 μg/mL,遠低于Nisin Z 的MIC。Nisin Q 由于僅存在一個甲硫氨酸殘基,相比于Nisin A,具有更高的抗氧化活性[6]。Nisin的各個異構體之間的氨基酸序列區(qū)別[7]見表1。

表1 天然細菌素Nisin的異構體及氨基酸序列Table 1 Isomers and amino acid sequences of the natural bacteriocin Nisin

1.2 乳酸鏈球菌素(Nisin)的抑菌機理

Nisin表現(xiàn)出對革蘭氏陽性菌廣泛的抑制作用,在較低的納摩爾濃度范圍內(nèi)對許多革蘭氏陽性菌包括腐敗和食源性病原體都具有有效抑制及殺死細胞的作用,如葡萄球菌、桿菌、肉毒梭菌、單增李斯特菌和多種抗藥性細菌。

乳酸鏈球菌素發(fā)揮其抗菌作用,主要有兩個步驟：第一步,Nisin屬于陽離子肽[8],通過疏水或靜電相互作用作用于細胞壁上的磷壁酸和脂磷壁酸、酸性多糖或磷脂等陰離子成分。一旦接觸到作用細胞的細胞膜,便開始進行與細胞的相互作用,殺滅細菌[9]。第二步,通過細胞膜孔的形成,Nisin的N末端區(qū)域?qū)毎诘幕厩绑w物質(zhì)脂質(zhì)Ⅱ具有高度選擇性[10],組裝成一個總計由4個Nisin分子和8個脂質(zhì)Ⅱ分子構成強有力的“打孔器”,在目標細菌的細胞膜上形成結構非常穩(wěn)定的孔洞,從而抑制細胞壁的合成。這種結合在細胞膜中形成孔隙,導致離子和細胞質(zhì)溶液快速流出,受損的細胞不能像重要的大分子一樣產(chǎn)生能量,最終導致細胞死亡,除了作用于脂質(zhì)Ⅱ的介導方式外,還可使細胞壁裂解而導致細胞死亡[11],作用機制圖見圖2[12]。值得注意的是,脂質(zhì)Ⅱ也是糖肽抗生素萬古霉素的靶點。但是,由于Nisin在不同于萬古霉素的部位結合脂質(zhì)Ⅱ,因此它保留了對萬古霉素耐藥的革蘭氏陽性病原菌的活性[13]。

圖2 Nisin抑菌作用機制圖Fig.2 Antibacterial action mechanism of Nisin

2 乳酸鏈球菌素(Nisin)的生物合成

2.1 乳酸鏈球菌素(Nisin)的生物合成基因簇

近年來,天然產(chǎn)物肽的生物合成無論是基因編碼的還是非核糖體起源的,均受到廣泛關注。Nisin的生物合成基因簇大小為15 kb左右。

一個成熟的Nisin 分子的合成主要包括編碼Nisin前體的結構基因NisinA,對Nisin前體進行后修飾的蛋白基因NisinB和NisinC,前體修飾后的分泌基因NisinT,自身的免疫基因NisinIFEG,酶解釋放基因NisinP,雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因NisinKR。以最具典型的Nisin A的生物合成基因簇為例,其合成基因簇見圖3。

圖3 Nisin A生物合成基因簇的結構Fig.3 Structure of Nisin A biosynthetic gene cluster

2.2 乳酸鏈球菌素(Nisin)的生物合成順序

第一步,誘導信號通過雙組分信號通路激活負責表達Nisin操縱子的啟動子,細胞中的核糖體負責合成乳酸鏈球菌素的前體肽Nisin A,Nisin A 沒有活性,結構包括N 端先導肽以及C-末端前肽[14]。

第二步,前體修飾蛋白基因NisinB催化1個絲氨酸和4個蘇氨酸殘基脫水,生成相應的脫氫丙氨酸Dha和Z-脫氫氨基丁酸殘基Dhb[15]。

第三步,前體修飾蛋白基因NisinC催化分子內(nèi)Michael加成反應[16],將半胱氨酸的巰基和脫氫丙氨酸或脫氫氨基丁酸殘基的雙鍵進行加成,生成羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸的硫醚交聯(lián)產(chǎn)物。由于羊毛硫肽含有大量的絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸殘基,在此過程中底物Ser/Thr殘基的α-碳在立體化學上被轉(zhuǎn)變?yōu)镈構型[17]。因此終產(chǎn)物是多環(huán)結構,構成5個環(huán)硫醚,此過程顯示出顯著的結構多樣性。

第四步,含有前導肽的Nisin隨后通過專門的轉(zhuǎn)運子分泌基因NisinT運輸,然后在N端前導序列被特殊的胞外絲氨酸蛋白酶NisinP水解,此時的Nisin才具有生物活性被分泌釋放。

乳酸鏈球菌素在生物合成過程中,由于其具有抗菌性質(zhì),在合成過程中通過不同的系統(tǒng)組成的脂蛋白NisinI和ABC轉(zhuǎn)運子NisinFEG構成自身免疫系統(tǒng)[18],在合成與免疫之間通過組氨酸激酶NisinK和轉(zhuǎn)錄反應調(diào)節(jié)因子NisinR組成的雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)以維持在生產(chǎn)和免疫之間的適當平衡[19]。具體合成順序見圖4[20]。

圖4 Nisin A的生物合成過程Fig.4 Biosynthesis process of Nisin A

3 高產(chǎn)乳酸鏈球菌素(Nisin)的選育方法

3.1 誘變育種

目前誘變選育的方法主要有化學誘變和物理誘變,化學誘變采用亞硝酸鹽、硫酸二乙酯等誘變劑,該方法誘變效果明顯,如徐文生等[21]采用亞硝酸協(xié)調(diào)紫外照射方法處理乳酸鏈球菌,產(chǎn)量較處理之前提高了1.72倍。但是本身的化學誘變劑含毒性高,受到了應用限制。物理誘變?nèi)缱贤庹丈?、等離子注入誘變等,其中等離子誘變因無毒、快速、高效等特點受到科研人員追捧。張拴力等[22]采用等離子誘變選育乳酸鏈球菌,Nisin產(chǎn)量提高近6倍。

3.2 基因修飾

誘變選育雖然簡單、快速,但是誘變選育結果為隨機性,工作量大。采用基因工程對菌株進行針對性改造,成為提升Nisin產(chǎn)量的有效方法?；蛐揎椫饕袃煞N方向：一種是對環(huán)境相關基因修飾,修飾某個與環(huán)境相關的基因,通過增強Nisin生產(chǎn)菌株在發(fā)酵條件中的耐受性和抗逆性來增加其產(chǎn)量。Hao等[23]針對Nisin生產(chǎn)菌株的D-天冬氨酸酰胺化相關基因修飾使其過表達,提高菌株在酸性條件下的存活能力,繼而提升菌株的Nisin產(chǎn)量。另一種是對生產(chǎn)Nisin表達相關基因修飾,增強其Nisin生產(chǎn)的代謝途徑能力。黃碩[24]采用電場強度10 kV/cm、頻率1500 Hz、電擊時間5 s進行電轉(zhuǎn)化,將Nisin的前體基因NisinA克隆構建質(zhì)粒,構建的工程菌Nisin 產(chǎn)量較之前提高至25%。

4 乳酸鏈球菌素(Nisin)在食品中的應用進展

食品因富含各種蛋白、氨基酸、糖等營養(yǎng)物質(zhì),在使用過程中和儲藏過程中很容易遭受微生物污染。目前在食品生產(chǎn)中,常采用化學防腐劑來保持食品的安全品質(zhì)。隨著生活水平的日益提高,天然防腐劑Nisin 在食品中的應用越來越廣。有直接添加Nisin用于抑菌,也有在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中采用相應菌株進行直接發(fā)酵產(chǎn)Nisin。此外,Nisin應用于食品中已不僅僅是作為防腐劑使用,還存在多種功能,以下歸納了Nisin在食品中的功能應用進展。

4.1 產(chǎn)品防腐抑菌

Nisin在成品中添加能有效地提升產(chǎn)品的防腐能力。目前Nisin用于防腐抑菌,隨著應用范圍變廣,使用的形式也在向著更穩(wěn)定、抑菌能力更強、更適應產(chǎn)品體系的方向發(fā)展,以下歸納了Nisin作為天然的防腐劑應用于食品中的進展。

4.1.1 單獨添加

Nisin本身具有抑菌范圍廣等特點,單獨添加是最經(jīng)濟和簡單的添加方式。如劉月琴等[25]研究表明，在啤酒生產(chǎn)過程中加入Nisin可有效抑制腐敗菌生長。張二康等[26]將Nisin添加于發(fā)酵辣椒中,在長期發(fā)酵和保藏期間,可以控制產(chǎn)品持續(xù)發(fā)酵不受微生物污染。此外,單獨添加還可以輔助物理加工手段,提升Nisin的抗菌性能,Costello等[27]在加工過程中以超聲輔助強化了Nisin對李斯特菌和大腸桿菌的殺滅能力。此方式針對某類微生物的抑菌作用,但單獨使用抑菌范圍較小,在食品應用中存在諸多限制。

4.1.2 混合復配

隨著Nisin的進一步應用,Nisin的局限性也隨之放大,Nisin對陰性菌有較強的抑制作用,但是針對真菌抑菌能力較差。因此,越來越多的企業(yè)尋求與其他抑菌物質(zhì)復配使用,進一步擴大抑菌范圍和抑菌能力。與常規(guī)添加劑復配:遲明梅等[28]采用Nisin與脫氫乙酸鈉等復配應用于鹵豆干中,能有效抑制鹵豆干菌落總數(shù)的增殖；與其他微生物源抑菌劑復配:李惠等[29]采用Nisin和納他霉素復配,能有效抑制番茄醬中的微生物,延長保質(zhì)期；與天然植物復配:鞠健等[30]將Nisin與茶多酚、迷迭香復配,延長了冷藏鱸魚的貨架期?；旌蠌团渫貙捔薔isin的應用范圍。

4.1.3 復配改性

隨著技術的發(fā)展和生活水平的提升,食品的品質(zhì)越來越被看重,針對Nisin的應用要求也越來越高,除了抑菌的能力,在產(chǎn)品的保藏期間,對抑菌的穩(wěn)定性要求越來越嚴格,相比于簡單物理混合復配,采用物理手段或者化學反應等進行復配結合,提升Nisin 在產(chǎn)品中抑菌的穩(wěn)定性,擺脫產(chǎn)品的環(huán)境因素、Nisin 自身易被降解等因素導致的抑菌穩(wěn)定性差等困擾。鄭曉杰等[31]采用美拉德反應制備殼寡糖-Nisin共價復合物,對比簡單的混合,殼寡糖-Nisin共價復合物具有抑菌能力更強、穩(wěn)定性更好的優(yōu)勢。張舒雯等[32]通過皮克林乳液將Nisin與肉桂醛進行包埋制備,抑菌效果不僅高于簡單的復合,而且提升了產(chǎn)品保質(zhì)期期間防腐的穩(wěn)定性。Qian等[33]采用果膠和殼聚糖復合包埋Nisin制備微膠囊,能極大地提升Nisin在加工過程中被降解的風險,提升了抑菌的穩(wěn)定性及抗逆性。Luo等[34]采用大豆可溶性多糖包裹Nisin和姜黃素制備成納米粒子,提升了Nisin的溶解度、分散性和穩(wěn)定性。

4.2 改善食品品質(zhì)

Nisin不僅有防腐抑菌的功能,而且可以改善產(chǎn)品的品質(zhì)。將產(chǎn)Nisin的乳酸鏈球菌應用到白酒發(fā)酵中,可抑制有害微生物,白酒的口感也得到提升[35]。孫文佳[36]添加0.15 g/kg的Nisin于豆瓣醬中,在有效提升防腐能力的同時,還能降低食鹽的使用。李繼勝在醬醪發(fā)酵時添加0.4%的Nisin發(fā)酵液,醬醪氨基酸態(tài)氮含量提升24.7%。李增利等[37]研究發(fā)現(xiàn)在醬油處理過程中添加Nisin,可以減少醬油的滅菌時間,使醬油中的營養(yǎng)成分有效保持,且能提升醬油的色澤、風味。焦宇知[38]在泡菜發(fā)酵過程中添加Nisin,在抑菌的同時,還可以改善泡菜的氨基酸,更符合營養(yǎng)配比,同時降低了泡菜中的亞硝酸鹽含量。

4.3 生鮮保鮮

如何提升生鮮保質(zhì)期和降低存儲期間營養(yǎng)流失,是企業(yè)一直探索的問題。隨著對Nisin的研究深入,Nisin在生鮮食品中的應用保鮮也越來越廣。李晨等[39]采用明膠和殼聚糖為基料與Nisin等制備復合保鮮劑涂抹于鱸魚魚糜,能有效減緩魚糜蒸煮過程中的營養(yǎng)損失,同時使Nisin更加穩(wěn)定,降低微生物污染。Cen等[40]研究發(fā)現(xiàn),Nisin結合殼聚糖及海藻酸鈉處理南美白對蝦,可以有效延長其冷藏保質(zhì)期,與未處理的南美白對蝦相比,感官評分更高。張曉虎等[41]用Nisin與黃芩苷制備保鮮液,可有效延長香蕉的儲存期、維持水分不變、緩解褐變、增強硬度等。

4.4 抑菌可降解包裝材料

隨著Nisin的應用擴展,Nisin已不再局限于應用于產(chǎn)品中。Nisin由于具有抑菌性能及可以生物降解的優(yōu)勢,目前研究人員已經(jīng)開始大量研究Nisin與其他可降解物質(zhì)結合,制備具有抑菌功能的可降解生物基材料,用于食品包裝。Leelaphiwat等[42]研究發(fā)現(xiàn),Nisin與乙二胺四乙酸(EDTA)混合物和熱塑性淀粉混合物(PBAT/TPS)通過吹塑復合而成的一種可生物降解薄膜應用于豬肉包裝中,可保持豬肉的品質(zhì),延長儲存期。Jiang等[43]采用Nisin制成納米粒子,與聚乙烯醇和聚丙烯酸鈉復合制成可降解的納米纖維膜,能有效抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。Yang等[44]通過將Nisin與甘蔗渣納米纖維素進行復合制備納米纖維膜,將其應用于即食火腿的包裝,可有效抑制李斯特單胞菌的污染。Wang等[45]將Nisin與紫蘇精油復配,與N-琥珀殼聚糖制備抗菌薄膜,具有生物降解等環(huán)保性能,還提升了常規(guī)保鮮薄膜的機械性能、水蒸氣阻隔性能及光學性能,將其應用于草莓包裝,延緩了草莓的腐爛。

5 展望

食品的安全性如保質(zhì)期安全、食品添加劑安全、食品包裝環(huán)保等一直是社會關注的焦點,也是一直存在的亟待解決的問題。如何在大眾追求綠色健康環(huán)保、無化學防腐劑的食品潮流下,提高食品的保質(zhì)期和品質(zhì),是食品企業(yè)需要長期探索的問題。微生物源抑菌劑Nisin因具有無毒、綠色的特點,一直受到食品企業(yè)的青睞,但Nisin也因產(chǎn)量低、提取繁瑣等問題導致成本較化學防腐劑高,一直未大范圍使用,此外,Nisin 抑菌范圍有限,也需搭配其他抑菌劑復配使用,發(fā)揮其最大作用。本文從分子水平闡述了Nisin的結構及生物合成途徑,綜述了Nisin在食品中抑菌、保鮮、提質(zhì)、生物降解包裝等作用的研究進展,旨在為今后提高Nisin 的開發(fā)價值及挖掘更多的微生物源抑菌劑提供理論參考。只有更多的微生物源抑菌劑面世,才能進一步推動綠色健康食品的發(fā)展。