改性乳清蛋白對(duì)凝固型酸奶品質(zhì)及膽酸鹽結(jié)合能力的影響

任浩杰，鄧康艷，陸永存，哈傳志，梅 瀅，劉雅卿，吳辰樂(lè)，曹亞玲，黃 松，梅 林

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥 230036）

隨著經(jīng)濟(jì)、社會(huì)的不斷發(fā)展，因壓力及不健康的生活習(xí)慣造成的高膽固醇癥已成為心血管疾病死亡的主要因素。降膽固醇藥物產(chǎn)生的高額醫(yī)療費(fèi)用和不良副作用使得人們對(duì)食品源降膽固醇產(chǎn)品的需求越來(lái)越迫切。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇與高脂血癥、動(dòng)脈高血壓和高血糖等有關(guān)，是引起心血管疾病的重要危險(xiǎn)因子，已經(jīng)嚴(yán)重影響了人類(lèi)的身體健康[1]。

乳清是干酪產(chǎn)品在加工過(guò)程中產(chǎn)生的一種副產(chǎn)品，富含乳清蛋白（Whey protein isolate，WPI）、維生素、磷脂、乳糖及礦物質(zhì)等成分[2]。其中乳清蛋白由于其重要的功能和生物學(xué)特性，近年來(lái)受到食品和保健品行業(yè)的廣泛關(guān)注。很多研究學(xué)者將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了乳清蛋白降膽固醇肽的制備、作用機(jī)制及應(yīng)用。乳清蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白，可通過(guò)對(duì)其加工改性有針對(duì)性地提高某些功能性質(zhì)，通過(guò)對(duì)乳清蛋白進(jìn)行改性處理能夠改變其疏水基團(tuán)分布、空間排列構(gòu)象以及氨基酸的組成等，進(jìn)而改善乳清蛋白的功能性質(zhì)或開(kāi)發(fā)新的功能特性[2]。1991年，Nagaoka等[3]在小鼠生物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白酶解產(chǎn)生的活性肽在降低血液中膽固醇方面比大豆蛋白和酪蛋白更強(qiáng)。2001年，Nagaoka等[4]使用胰蛋白酶酶解β-Lg后分離出一種降膽固醇活性比藥物（β-谷甾醇）更強(qiáng)的活性肽Lactostatin，并測(cè)定其氨基酸序列（Ile-Ile-Ala-Glu-Lys）。在乳清蛋白的酶解優(yōu)化過(guò)程中，高學(xué)飛[5]分離純化得到一種在抑制HMG-CoA還原酶方面表現(xiàn)出較強(qiáng)活性的乳清蛋白濃縮物（whey protein concentrate, WPC），并鑒定到發(fā)揮降膽固醇作用的是分子量介于2～12 kDa的活性肽。孫丹丹[6]在雙酶水解乳清蛋白實(shí)驗(yàn)中，確定了最佳的酶解條件，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了所制備的活性肽具有較高的降膽固醇活性。

發(fā)酵乳制品作為一種健康食品被廣泛消費(fèi)，WPI可以作為功能性的添加成分來(lái)強(qiáng)化酸奶的主要成分，同時(shí)減少乳清分離，增加酸奶穩(wěn)定性、改善口感。Remeuf等[7]發(fā)現(xiàn)，在酸奶中加入乳清蛋白會(huì)促進(jìn)二者的高度交聯(lián)，對(duì)其持水力和粘度的提高具有重要意義。Gyawali等[8]關(guān)于凝固型酸奶的研究結(jié)果，顯示W(wǎng)PI替代對(duì)其粘度、脫水收縮作用和持水力有顯著影響，并且增強(qiáng)了凝固型酸奶的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。有研究指出[9]，在酸奶中添加低乳糖的乳清蛋白，在提高蛋白含量的同時(shí)，也可以實(shí)現(xiàn)不增加乳糖的含量，從而生產(chǎn)出適合低糖攝入者的酸奶。另外，在酸奶中加入一些具有特殊功能性的水解物，不僅可以在品質(zhì)方面有所改善，而且對(duì)于乳酸菌生長(zhǎng)和酸奶發(fā)酵有明顯的促發(fā)酵作用，也能夠使酸奶提供更多的關(guān)于健康方面的作用，例如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、防止骨質(zhì)疏松等。曾羲[10]使用胰蛋白酶和堿性?xún)?nèi)切蛋白酶處理得到的大豆蛋白酶解物可以促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)和酸奶發(fā)酵。李晶晶[11]在添加乳酸菌的凝固型酸奶中加入蕎麥水解液，表明添加蕎麥水解液的凝固型酸奶具有較強(qiáng)的自由基清除能力。張國(guó)柱等[12]在酸奶中加入4%的乳清蛋白酶解液，在不降低品質(zhì)的基礎(chǔ)上提高了酸奶的抗氧化性。可見(jiàn)，乳清蛋白可以作為功能性的添加成分，在乳制品尤其是發(fā)酵乳制品中具有良好前景。

本研究前期已利用復(fù)合改性技術(shù)獲得較高降膽固醇能力WPI[13]，通過(guò)探究其結(jié)構(gòu)與功能特性的關(guān)系，已初步揭示出改性WPI膽鹽結(jié)合機(jī)制。但改性后WPI在應(yīng)用過(guò)程中，對(duì)凝固型酸奶品質(zhì)、結(jié)構(gòu)、凝膠特性及膽酸鹽結(jié)合能力的影響尚未清晰。因此，本研究利用酶結(jié)合有機(jī)酸改性獲得的具有膽鹽結(jié)合功能WPI，考察改性功能性乳清蛋白作為凝固型酸奶天然品質(zhì)改良劑的應(yīng)用效應(yīng)，為改性降膽固醇WPI在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用，為食品行業(yè)開(kāi)發(fā)具有降膽固醇功效的食品奠定數(shù)據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白（WPI，蛋白含量90%） 美國(guó)Hilmar公司；全脂奶粉 市售；植物乳桿菌FQR 保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2 021228；酒石酸 上海振企化學(xué)試劑有限公司；DL-蘋(píng)果酸（MA） 安徽雪郎生物科技股份有限公司；無(wú)水檸檬酸 濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；膽酸鈉（SC）、脫氧膽酸鈉（SDC）、牛磺膽酸鈉（STC） 上海Macklin生化科技有限公司；中性蛋白酶（100 U/mg）、胰蛋白酶（1500 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；Tris 北京Solarbio科技有限公司；甘氨酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、尿素、5,5'二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、三氯乙酸（TCA）、三（羥甲基）甲基甘氨酸、考馬斯亮藍(lán) 上海Macklin生化科技有限公司；冰乙酸 西隴化工股份有限公司；MRS肉湯 杭州Basebio技術(shù)有限公司。

BS 224 S分析電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DGT-G-C電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；WTL-10K/WTL10K微型離心機(jī) 湖南湘潭湘儀儀器有限公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter有限公司；Lambda 35紫外分光光度計(jì)、DSC 8000差式掃描量熱儀、LS 55熒光分光光度計(jì) 美國(guó)PerkinElmer公司；Multiskan GO Thermo酶標(biāo)儀 北京彭昆博遠(yuǎn)科貿(mào)發(fā)展有限責(zé)任公司；Discovery HR-1旋轉(zhuǎn)流變儀 上海沃特世科技有限公司；Mastersizer 2000激光粒度儀

英國(guó)Malvern儀器有限公司；SPX-150B-Z恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶結(jié)合蘋(píng)果酸復(fù)合改性乳清蛋白制備方法根據(jù)Mei等[13]報(bào)道的方法，配制底物濃度7%（w/v）的WPI溶液，4 ℃低溫水合12 h后，用1.0 mol/L NaOH維持pH在8.0，以加酶總量為6%（w/v），胰蛋白酶：中性蛋白酶比例為4:1（m/m）分段加入。首先，在45 ℃水浴8 h進(jìn)行胰蛋白酶的水解，隨后通過(guò)90 ℃高溫10 min滅酶來(lái)終止酶解反應(yīng)，冰浴冷卻至室溫后，用1.0 mol/L的HCl將調(diào)節(jié)酶解液的pH至7.0；再置于50 ℃水浴2 h進(jìn)行中性蛋白酶的酶解，隨后通過(guò)90 ℃高溫處理10 min以終止最后的酶解反應(yīng)。冰浴冷卻的酶解液在4500 r/min離心10 min，收集上清液酶改性乳清蛋白（WPI-E），進(jìn)行第二次不同的變性處理。

蘋(píng)果酸變性處理：將上述所得WPI+E上清液加入2.5%（w/v）蘋(píng)果酸，混勻置于磁力攪拌器在1500 r/min條件下常溫?cái)嚢?0 min。最后置于冷凍干燥機(jī)凍干，保存在4 ℃冰箱，獲得酶結(jié)合蘋(píng)果酸復(fù)合改性乳清蛋白（WPI-E+MA）。

1.2.2 凝固型酸奶的制作工藝 在冷卻至45 ℃的熱水中加入10%全脂奶粉、不同濃度的WPI-E+MA（0%、2%、4%、6%、8%）和5%白砂糖于90～95 ℃溫度條件下，殺菌5 min后冷卻至42 ℃，接種植物乳桿菌 FQR，接種量為2%于42 ℃發(fā)酵4 h，最后置于4 ℃冷藏后熟18 h，制成成品[14]。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 配制5 mg/mL不同濃度的發(fā)酵樣品，用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定凝固型酸奶的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 持水力的測(cè)定 持水力（Water hold capacity,WHC）的測(cè)定根據(jù)李榮華[15]給出的方法進(jìn)行修改。將凝固型酸奶置于室溫下平衡20 min后進(jìn)行測(cè)定。記錄每一只離心管的質(zhì)量，為M0。在離心管中放入2 mL酸奶，并稱(chēng)重記為M1，設(shè)置離心機(jī)的轉(zhuǎn)數(shù)為10000 r/min，4 ℃離心10 min，倒掉上清液并稱(chēng)重，記為M2，通過(guò)公式計(jì)算凝膠的持水力，每個(gè)樣品測(cè)定3次。計(jì)算公式：

式中：M0為每一只離心管的質(zhì)量，mg；M1為離心管中2 mL發(fā)酵樣品質(zhì)量，mg；M2為去掉上清液后的質(zhì)量，mg。

1.2.5 游離巰基含量、總巰基含量的測(cè)定 根據(jù)Beveridge等[16]報(bào)道的方法測(cè)定添加了WPI-E+MA的凝固型酸奶中游離巰基含量，稀釋添加不同濃度WPI-E+MA的凝固型酸奶至濃度為5 mg/mL，取其0.5 mL置于離心管中，再加入2.5 mL緩沖溶液2和0.02 mL Ellman試劑混合均勻，25 ℃保溫5 min，在412 nm下測(cè)定吸光值。空白以蒸餾水替代蛋白樣品。

總巰基含量的測(cè)定參考Shen等[17]的方法，稀釋添加了不同濃度WPI-E+MA的凝固型酸奶至濃度為5 mg/mL，取其0.2 mL置于離心管中，再加入1 mL緩沖溶液3和0.02 mLβ-巰基乙醇混合均勻，于25 ℃反應(yīng)1 h，加入10 mL 12% TCA（三氯乙酸），25 ℃反應(yīng)1 h，5000 r/min離心15 min，去上清，用5 mL 12% TCA懸浮，5 000 r/min離心10 min，如此2次。去上清，加入3 mL緩沖溶液2和0.03 mL Ellman試劑，5 min后使用酶標(biāo)儀測(cè)定412 nm處的吸光值。計(jì)算公式：

式中：A412為412 nm處吸光值；D為凝固型酸奶樣品的稀釋倍數(shù)，在游離巰基中D=6.04，在總巰基中D=15.15；C為蛋白濃度，mg/mL。

1.2.6 傅里葉紅外變換光譜的測(cè)定（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR） 參考Liu等[18]方法，將添加不同濃度WPI-E+MA的凝固型酸奶凍干樣品與溴化鉀研磨得到的粉末進(jìn)行壓片，并以空白溴化鉀薄片為參比，采用傅里葉紅外變換光譜儀進(jìn)行掃描測(cè)定。掃描波數(shù)范圍4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。使用OMNIC （Thermo 8.2）和PeakFit （Sea-Solve 4.12）軟件對(duì)酰胺I帶（1600～1700 cm-1）進(jìn)行譜圖的處理和曲線的分峰擬合，并計(jì)算與二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的峰面積比例。

1.2.7 掃描電鏡（Scanning electron microscopy，SEM）觀察微觀結(jié)構(gòu) 將凍干后的添加不同濃度WPIE+MA的凝固型酸奶粉末用導(dǎo)電膠帶固定在樣品臺(tái)上，并在樣品表面蒸鍍一層導(dǎo)電膜，然后采用SEM觀察樣品的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，獲取圖像。

1.2.8 平均粒徑的測(cè)定 通過(guò)激光粒度儀來(lái)測(cè)量凝固型酸奶粒徑大小，設(shè)置的測(cè)量參數(shù)參考Hu等[19]的方法：將添加不同濃度WPI-E+MA的凝固型酸奶樣品分散在蒸餾水中制備5%（w/v）的蛋白溶液，顆粒折射率為1.45，顆粒吸收率為0.001，分散劑為水，分散劑折射率為1.33。使用體積平均直徑D（4,3）表示平均粒徑。

1.2.9 流變學(xué)特性的測(cè)定 參照Hemar等[20]的方法，測(cè)試前先將各凝固型酸奶樣品用玻璃棒沿同一方向緩慢攪拌，再滴至夾具內(nèi)，在0.01～100 S-1的剪切速率條件下測(cè)定凝固型酸奶的靜態(tài)流變學(xué)特性。

配制濃度為500 mg/mL酸奶溶液。選用直徑為40 mm的平板，平行板間距為1 mm，測(cè)定溫度為20 ℃，應(yīng)變?yōu)?0%（確保在線性粘彈范圍內(nèi)進(jìn)行角頻率的掃描），角頻率ω為0.1～100 rad/s。在此條件下對(duì)凝固型酸奶的動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定分析。所得掃描結(jié)果以角頻率（rad/s）為橫坐標(biāo)，儲(chǔ)能模量（G'）和損耗模量（G''）為縱坐標(biāo)作圖。

掃描頻率的條件設(shè)定為0.1～10 Hz。所得掃描結(jié)果以掃描頻率（Hz）為橫坐標(biāo)，儲(chǔ)能模量（G'）和損耗模量（G''）為縱坐標(biāo)作圖。

1.2.10 凝固型酸奶的膽酸鹽結(jié)合能力測(cè)定 參考Yoshie-Stark等[21]的方法，分別取1 mL不同濃度的WPI-E+MA和1 mL不同濃度的凝固型酸奶于離心管中，再加入4 mL膽酸鹽溶液（0.4 mmol/L STC、SD和SDC，PBS溶液配制），放入37 ℃培養(yǎng)箱中振蕩2 h后，于離心機(jī)離心20 min（4000 r/min）。取2.5 mL上清液和7.5 mL H2SO4溶液（60%，v/v）混勻，70 ℃水浴保溫20 min，取出后迅速放入冰水冷卻，使用酶標(biāo)儀測(cè)定387 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算溶液的膽酸鹽濃度。計(jì)算公式：

式中：C0為空白對(duì)照溶液的膽酸鹽濃度，mmol/L；C1為樣品上清液中的膽酸鹽濃度，mmol/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。使用Excel軟件（Microsoft 2016）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，并使用SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 22）進(jìn)行分析。方差分析采用LSD多重比較法。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。使用Origin 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性WPI對(duì)凝固型酸奶蛋白質(zhì)濃度的影響

添加了不同濃度WPI-E+MA的凝固型酸奶，其蛋白濃度變化見(jiàn)表1。從表中可以看到添加WPIE+MA的酸奶蛋白濃度呈現(xiàn)出不同程度的降低，可能是由于WPI-E+MA對(duì)乳酸菌的促發(fā)酵作用使得乳酸菌快速生長(zhǎng)繁殖，新陳代謝旺盛，原料奶中的蛋白質(zhì)降解程度高，進(jìn)而降低了凝固型酸奶蛋白濃度[22]。

表1 不同濃度的WPI-E+MA的凝固型酸奶的蛋白濃度變化Table 1 Changes of protein concentration in fermented yoghurt with different concentrations of WPI-E+MA

2.2 改性WPI對(duì)凝固型酸奶持水力的影響

酸奶的持水力是表征結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[22]，是酸奶在高速離心后，對(duì)體系中的各種小分子物質(zhì)的保持能力。圖1為不同濃度的WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶持水力的影響。

圖1 不同濃度的WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶持水力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of WPI-E+MA on holding water capacity of fermented yogurt

由圖1可知，WPI-E+MA的添加會(huì)導(dǎo)致凝固型酸奶的持水力增加，并且隨著WPI-E+MA添加量的增加而增大，可能是由于WPI-E+MA本身具有較強(qiáng)的持水力，添加至酸奶后，降低了酪蛋白與WPI的比例，在酸化過(guò)程中與酪蛋白的相互作用促進(jìn)了均勻多孔結(jié)構(gòu)的形成，大量的液態(tài)水被固定和截留在這種緊致均勻的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中，降低了乳清析出量，從而增加了凝固型酸奶的持水力[23-24]。8% WPI-E+MA添加組凝固型酸奶的持水力顯著高于0%、2%、4%和6%（P＜0.05），達(dá)到最大值，為52.39%±1.42%，比未添加組（0%）提高了43.54%。8% WPI-E+MA添加組表現(xiàn)出的高持水力可能與膠束體系的高溶劑化和分支化的凝固型酸奶微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)，在離心力的作用下，更不容易失水[25]。研究表明[7]，增加乳基中WPI的比例可以提高凝固型酸奶凝膠的水結(jié)合能力。Guzmán-González等[26]也證實(shí)了這一點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)用WPI部分替代脫脂牛奶，凝固型酸奶的持水力增加了77%，比酪蛋白更具有保水性，與本文的結(jié)果一致。另外，Sodini等[27]進(jìn)行了一項(xiàng)研究，關(guān)于乳清加工對(duì)凝固型酸奶中WPC功能的影響，用乳清中提取的WPC經(jīng)低熱處理強(qiáng)化酸奶時(shí)，酸奶的持水能力最高。Gyawali等[8]的研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的加工過(guò)程對(duì)乳清蛋白的功能也起著重要的作用。本文中使用的WPI-E+MA也是復(fù)合變性而來(lái)，8%添加量更利于酸奶凝膠的形成及穩(wěn)定，顯著提高凝固型酸奶的持水力（P＜0.05）。

2.3 改性WPI對(duì)凝固型酸奶游離巰基的影響

在發(fā)酵過(guò)程中，酸奶體系的不同會(huì)引起不同的結(jié)構(gòu)變化，從而影響體系中游離巰基的改變。因此，研究了添加不同濃度的WPI-E+MA（0%、2%、4%、6%、8%）的凝固型酸奶中游離巰基的關(guān)系，如圖2所示。

圖2 不同濃度的WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶游離巰基的影響Fig.2 Effects of different concentrations of WPI-E+MA on free sulfhydryl of fermented yogurt

由圖2可見(jiàn)，隨著WPI-E+MA濃度的增加，凝固型酸奶中游離巰基的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。對(duì)比未添加組（0%），2%添加量的酸奶游離巰基含量存在顯著變化（P＜0.05），由3.51±0.04 μmol/g增加至4.47±0.12 μmol/g。這可能與WPI中成分的比例有關(guān)，之前的研究已經(jīng)證明了WPI-E+MA含有一些游離巰基[13]，故增加WPI-E+MA含量也會(huì)間接提高凝固型酸奶的游離巰基含量。王月秀[28]的研究結(jié)果也表明發(fā)酵乳飲料的游離巰基含量會(huì)隨著WPI添加量的增加而增加，與本文的結(jié)果一致。然而，添加更高濃度的WPI-E+MA進(jìn)行發(fā)酵后，反而顯著地降低了游離巰基的含量（P＜0.05），從4.47±0.12 μmol/g降低至3.28±0.01 μmol/g。出現(xiàn)這種變化的原因可能是WPI-E+MA自身的低pH引起的發(fā)酵體系整體pH偏低，經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸后，pH更低，增加了分子間的靜電斥力，導(dǎo)致分子穩(wěn)定性改變，游離巰基轉(zhuǎn)變?yōu)槎蜴I，酸奶中的蛋白發(fā)生聚合。孫穎[29]也發(fā)現(xiàn)隨著pH的降低，凝固型酸奶的游離巰基也明顯降低。

2.4 改性WPI對(duì)凝固型酸奶中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

基于酰胺Ⅰ帶（1700～1600 cm-1）對(duì)不同濃度WPI-E+MA的凝固型酸奶進(jìn)行分析和檢測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化，見(jiàn)表2。

由表2可以看出，β-折疊是所有凝固型酸奶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分，從49.65%±0.53%～57.82%±0.02%。對(duì)比未添加組（0%），添加WPIE+MA的凝固型酸奶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了以下變化。首先，α-螺旋和β-折疊含量分別從12.96%±0.38%和51.38%±0.76%增加至19.90%±0.37%和57.82%±0.02%，β-轉(zhuǎn)角含量從19.78%±0.29%下降至12.50%±0.02%，且變化顯著（P＜0.05）。其中，在2%～8% WPIE+MA添加量的凝固型酸奶的α-螺旋呈現(xiàn)出不同程度的上升趨勢(shì)，以8%添加組最顯著（P＜0.05）。趙謀明等[30]關(guān)于大豆分離蛋白的酸處理研究，發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的α-螺旋增加的現(xiàn)象，與表2結(jié)果一致。并且，不同WPI-E+MA添加量的凝固型酸奶的β-折疊除2%有所降低外，其余都顯示出增加的現(xiàn)象；同時(shí)，8%添加組的β-轉(zhuǎn)角含量對(duì)比未添加組（0%）降低的最明顯，表明酸性pH破壞了維持蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵（如氫鍵、靜電相互作用、范德華力），分子結(jié)構(gòu)的疏松和伸展導(dǎo)致酪蛋白與乳清蛋白高度結(jié)合形成聚合物。Evangelho等[31]將β-折疊含量的增加歸功于疏水區(qū)域的暴露。這可能意味著，酪蛋白與乳清蛋白結(jié)合在蛋白質(zhì)表面形成的聚合物是一些具有疏水性的氨基酸組成的。從表2也可以看到，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在2%、4%、6%濃度與無(wú)添加對(duì)照組之間存在顯著差異（P＜0.05），而8%添加量與無(wú)添加對(duì)照組之間不存在顯著差異，說(shuō)明添加量的低pH WPI-E+MA可以增加一些無(wú)規(guī)則的結(jié)構(gòu)。Wang等[32]發(fā)現(xiàn)米糠蛋白在酸性條件下，β-轉(zhuǎn)角會(huì)向無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。總體來(lái)說(shuō)，8%添加組β-轉(zhuǎn)角向α-螺旋和β-折疊的轉(zhuǎn)化意味著松散的蛋白結(jié)構(gòu)重新排列成穩(wěn)定有序的聚合物。

表2 不同濃度的WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Table 2 Effects of different concentrations of WPI-E+MA on secondary structure content of fermented yogurt

2.5 改性WPI對(duì)凝固型酸奶微觀結(jié)構(gòu)的影響

酸奶的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是一種立體的纖維網(wǎng)狀，由酪蛋白的交聯(lián)作用形成六棱形的空隙。因此，酸奶的微觀結(jié)構(gòu)與酪蛋白的交聯(lián)形式密切相關(guān)。在發(fā)酵過(guò)程中，酸奶蛋白的結(jié)構(gòu)和種類(lèi)及其與酪蛋白的交聯(lián)形式、交聯(lián)程度的差異性會(huì)直接影響形成的凝膠結(jié)構(gòu)的不同。以添加不同濃度的WPI-E+MA的形式強(qiáng)化凝固型酸奶中的蛋白含量，形成的酸奶凝膠經(jīng)過(guò)冷凍干燥后使用掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)的變化。

從圖3A可以看到，未添加組（0%）的微觀結(jié)構(gòu)與其他圖像相比，呈現(xiàn)出完全不同的圖像，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)是一種由相對(duì)較大的球狀聚集物組成的粗結(jié)構(gòu)，空隙大小不一，空穴較多，酪蛋白的交聯(lián)性較差。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告[33-34]，使用脫脂奶粉制成的樣品中也觀察到類(lèi)似的大孔。Lee等[35]指出酪蛋白膠束中的交聯(lián)性與酸奶凝膠的空穴孔徑高度相關(guān)，并且空穴孔徑越大，膠束的交聯(lián)性越差。而圖3B凝固型酸奶凝膠的微觀結(jié)構(gòu)中空隙較少，空穴的孔徑也較圖3A更小，說(shuō)明添加2% WPI-E+MA可以增加酸奶中酪蛋白與WPI的交聯(lián)度，產(chǎn)生更多的結(jié)構(gòu)分枝，進(jìn)一步提高酸奶的持水力和黏度。這一點(diǎn)與圖2的結(jié)果一致。由圖3C～圖3E可知，隨著WPI-E+MA添加量的增大，與酸奶中的酪蛋白的交聯(lián)作用更大，交聯(lián)度的增加使得凝固型酸奶凝膠的結(jié)構(gòu)分支更多，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，空隙更小，尤其是添加8% WPI的凝固型酸奶（圖3E）。可能是因?yàn)閃PI-E+MA自身的聚集體附著在酪蛋白膠束的表面，交聯(lián)形成緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提高了酸奶的凝膠特性，使得凝膠對(duì)水分的束縛能力提高，減少乳清析出量，也進(jìn)一步證明了8% WPIE+MA添加量酸奶的高持水力和聚合行為（圖1、圖2）。Akalin等[36]使用掃描電子顯微鏡在添加WPI的酸奶中觀察到類(lèi)似的細(xì)膩的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和更多的分枝結(jié)構(gòu)。Puvanenthiran等[37]在酸奶樣品中獲得了類(lèi)似的微觀結(jié)構(gòu)，他們觀察到，隨著WPI比例的增加，網(wǎng)絡(luò)變得更細(xì)，聚集體的尺寸變得更小，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)更致密，空隙更小。酸奶微觀結(jié)構(gòu)致密性的增加同樣會(huì)導(dǎo)致大量游離水的固定，與本文中圖1和圖3E的結(jié)果一致。因此，使用某些類(lèi)型的WPI會(huì)在一定程度上影響酸奶樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

圖3 不同濃度的WPI-E+MA的凝固型酸奶的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy images of fermented yoghurt with different concentrations of WPI-E+MA

2.6 改性WPI對(duì)凝固型酸奶平均粒徑的影響

從上述不同添加量WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶游離巰基含量和微觀結(jié)構(gòu)影響的數(shù)據(jù)中可以看到，不同比例的WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶在蛋白質(zhì)聚合或解離方面可以產(chǎn)生不同的影響。同樣，蛋白質(zhì)的粒徑也可以反映蛋白質(zhì)的聚合或解離能力。因此，為了進(jìn)一步確定前面結(jié)果出現(xiàn)的聚集情況，測(cè)定了不同WPI-E+MA添加量的酸奶的粒徑體積分布情況和平均粒徑，具體結(jié)果如圖4所示。

在圖4A的粒徑體積分布可以看到，未添加組（0%）的粒徑主要分布在0.1～10 μm之間，且粒徑分布呈雙峰分布。而其他添加了WPI-E+MA的凝固型酸奶均呈現(xiàn)單峰分布，粒徑范圍大約在10～1000 μm。

在圖4B可以看到，與未添加組（0%）相比，添加了WPI-E+MA的凝固型酸奶粒徑都有著不同程度的增加。其中，2%添加組的粒徑（105.86±7.86 μm）顯著高于未添加組（35.05±2.63 μm）（P＜0.05），提高了66.89%。說(shuō)明添加一定比例的WPI-E+MA可以提高其與酸奶中酪蛋白膠束的結(jié)合能力，進(jìn)而增強(qiáng)乳蛋白的聚合能力。Beaulieu等[38]也做過(guò)類(lèi)似的研究，發(fā)現(xiàn)在脫脂牛奶和WPI混合物中，粒徑隨著乳清蛋白比例的增加而增加。并得出一個(gè)結(jié)論，添加高水平的乳清蛋白可能導(dǎo)致所有k-酪蛋白與乳清蛋白結(jié)合的能力飽和，形成了乳清蛋白聚集物的顆粒。然而，添加更高濃度的WPI-E+MA進(jìn)行發(fā)酵后，雖顯著地降低了粒徑（P＜0.05），但仍然顯著高于未添加組（0%）。出現(xiàn)這種變化的原因可能是加入了更高濃度的WPI-E+MA使得酸奶的整體pH偏低，導(dǎo)致形成更小的顆粒[39]。有學(xué)者指出[40]，pH小于6.4有利于形成更小的聚集體。另外，已有報(bào)道稱(chēng)，增加凝膠體系中可溶性聚集體的量對(duì)形成的凝膠的機(jī)械性能有積極影響[41-42]。因此，更高含量的納米顆粒可能有利于酸奶的最終凝膠特性，這一點(diǎn)在圖3E也可以得到證實(shí)。

2.7 改性WPI對(duì)凝固型酸奶流變學(xué)特性的影響

凝固型酸奶是一種具有黏彈性的凝膠狀物質(zhì)，其流變學(xué)特性不僅與酸奶的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且會(huì)隨著剪切速率和頻率的變化而表現(xiàn)出不同的流動(dòng)性和形變[43]，因此常用來(lái)反映酸奶的感官品質(zhì)。本文選擇了不同添加量（0%、2%、4%、6%、8%）的WPI-E+MA進(jìn)行發(fā)酵，考察不同WPI-E+MA添加量的凝固型酸奶之間的流變學(xué)特性的差異。

2.7.1 改性WPI對(duì)凝固型酸奶靜態(tài)流變的影響圖5為不同添加量（0%、2%、4%、6%、8%）的WPIE+MA對(duì)凝固型酸奶的表觀黏度、剪切應(yīng)力的影響。由圖5A可知，在0.01～100 s-1的剪切速率范圍內(nèi)，隨著剪切速率的增加，所有凝固型酸奶的表觀黏度均下降，表現(xiàn)出明顯的剪切變稀現(xiàn)象，是一種典型的非牛頓流體。并且，在相同剪切速率的條件下，可以在圖5A看到凝固型酸奶凝膠的表觀黏度隨著WPI-E+MA添加量的增加而增大，0%添加量的表觀粘度最低，2%添加量次之，8%添加量最高。其中，添加量為8% WPI-E+MA的凝固型酸奶凝膠的表觀黏度最大，這可能是因?yàn)閃PI-E+MA自身存在的高黏度，在發(fā)酵過(guò)程中與酪蛋白高度結(jié)合，進(jìn)一步提高了凝固型酸奶凝膠的表觀黏度。Remeuf等[7]發(fā)現(xiàn)使用WPI強(qiáng)化的凝固型酸奶具有較高的黏度，與本文的研究結(jié)果一致。Guinee等[44]用WPC制成的酸奶也獲得了類(lèi)似黏度。

圖5 不同濃度的WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶的靜態(tài)流變性能的影響Fig.5 Effects of different concentrations of WPI-E+MA on static rheological properties of fermented yogurt

由圖5B可知，在0.01～100 s-1的剪切速率下，所有凝固型酸奶的剪切應(yīng)力都隨著剪切速率的增加而增大。并且，在相同剪切速率的條件下，可以在圖5B看到酸奶凝膠的剪切應(yīng)力隨著WPI-E+MA添加量的增加而增大。其中，添加量為8% WPIE+MA的凝固型酸奶凝膠的剪切應(yīng)力最大，是因?yàn)?% WPI-E+MA凝固型酸奶凝膠的表觀黏度相對(duì)較大，抗剪切能力最強(qiáng)，所需的剪切應(yīng)力也隨之增大，這與表觀黏度圖5A的分析結(jié)果一致。

2.7.2 改性WPI對(duì)凝固型酸奶動(dòng)態(tài)流變特性的影響圖6為不同添加量（0%、2%、4%、6%、8%）的WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶的粘彈性的影響。從圖6可以看到所有酸奶凝膠的G'和G''都是隨著頻率的增加而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，并且在整個(gè)頻率掃描的過(guò)程中，酸奶凝膠的彈性隨著WPI-E+MA添加量的增加而增大，表現(xiàn)為：0%添加量最小，2%添加量次之，8%添加量最大；酸奶凝膠的粘性隨著WPI-E+MA添加量的增加而增大，與表觀黏度（圖5A）的結(jié)果一致。其中，添加量為8% WPI-E+MA的酸奶凝膠的粘彈性都是最大，且粘性大于彈性，這可能是因?yàn)閃PI-E+MA自身存在的高粘彈性，在發(fā)酵過(guò)程中與酪蛋白高度結(jié)合，增強(qiáng)了凝固型酸奶的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高了凝固型酸奶凝膠的粘彈性，這一點(diǎn)在圖3E和圖4B可以得到證實(shí)。Kücükcetin等[45]、Lucey等[46]和Walstra[47]在研究中表明，以WPI為主的凝固型酸奶凝膠會(huì)產(chǎn)生較高的G'值，這與本文結(jié)果一致。另外，有研究指出在一定蛋白質(zhì)水平下，WPI對(duì)凝固型酸奶流變學(xué)特性的影響很大程度上取決于WPI的等級(jí)[47]。Cho等[48]報(bào)道了含有高變性WPI的凝固型酸奶凝膠的彈性從13增加到80 Pa。彭新顏等[49]在豬肉糜中添加20%WPI水解物使得G'提高，這可能是由于WPI水解物中的抗氧化肽嵌于凝膠網(wǎng)絡(luò)中，增強(qiáng)了凝膠強(qiáng)度。Massimiliano等[50]關(guān)于在香腸中添加WPI的研究發(fā)現(xiàn)，8%添加量可以提高其硬度和咀嚼性，且香腸的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也更加緊密。推測(cè)可能是WPI或其水解物可以與蛋白發(fā)生相互作用而形成密切的凝膠結(jié)構(gòu)。而本文研究的WPI-E+MA是由酶解和蘋(píng)果酸復(fù)合變性產(chǎn)生的降膽固醇肽，由于其營(yíng)養(yǎng)和功能特性，對(duì)變性后產(chǎn)生粘彈性凝膠的成膠能力也表現(xiàn)出顯著的影響（圖6）[51]。

圖6 不同濃度的WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶的動(dòng)態(tài)流變性能的影響Fig.6 Effects of different concentrations of WPI-E+MA on dynamic rheological properties of fermented yogurt

2.8 改性WPI對(duì)凝固型酸奶膽酸鹽結(jié)合能力的影響

之前的研究結(jié)果[13]已經(jīng)證明了WPI-E+MA具有顯著的膽酸鹽結(jié)合能力，為了進(jìn)一步研究其對(duì)凝固型酸奶膽鹽結(jié)合力的影響，對(duì)添加不同濃度的WPIE+MA凝固型酸奶的膽鹽結(jié)合能力進(jìn)行了比較，結(jié)果見(jiàn)圖7。

從圖7A可以看到，在發(fā)酵前，隨著WPI-E+MA濃度的增加，凝固型酸奶的膽酸鹽結(jié)合能力都呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，并且對(duì)于SDC的結(jié)合能力都顯著高于SC和STC（P＜0.05），說(shuō)明WPI-E+MA的羥基和氨基易與SDC和SC中的氫鍵進(jìn)行相互作用，與之前的研究結(jié)果一致。值得注意的是，8%的WPIE+MA凝固型酸奶結(jié)合膽鹽的效果最顯著（P＜0.05），分別為38.92%±0.84%（STC）、60.99%±1.57%（SC）、100.44%±0.45%（SDC）。

圖7B展示出了不同濃度的WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶表現(xiàn)出的膽酸鹽結(jié)合能力。添加不同濃度WPI-E+MA的凝固型酸奶對(duì)于STC、SC和SDC的結(jié)合能力不僅沒(méi)有降低，而且較發(fā)酵前都呈現(xiàn)出不同程度的增加。這說(shuō)明在添加WPI-E+MA的基礎(chǔ)上進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵，可以在一定程度上提高凝固型酸奶的降膽固醇能力。而且當(dāng)添加量為8%時(shí)，對(duì)STC、SC和SDC的結(jié)合能力均達(dá)到最大值，比發(fā)酵前同濃度添加量（8%）提高了59.49%、15.53%、49.2%。其中對(duì)STC的結(jié)合能力提高的幅度最大，出現(xiàn)這種變化的原因可能是FQR乳酸菌本身自帶的生理功能和在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物-膽鹽水解酶可以水解結(jié)合性膽酸鹽（例如STC），使其轉(zhuǎn)變?yōu)榘被岷陀坞x膽酸，進(jìn)而降低了膽酸鹽的含量，提高凝固型酸奶的降膽固醇活性[40]。另外，添加WPI-E+MA的凝固型酸奶對(duì)STC、SC和SDC的結(jié)合能力隨著濃度的增加而增大，均以8%最高，與未添加組（0%）相比，分別提高了8.54%、12.14%、86.65%（圖7B）。可能是由于酶解和有機(jī)酸處理的WPI-E+MA本身就具有結(jié)合膽酸鹽能力而表現(xiàn)出降膽固醇效果，對(duì)乳酸菌的促發(fā)酵作用也使得這種結(jié)合膽酸鹽的能力增強(qiáng)，從而提高凝固型酸奶的降膽固醇活性。因此，添加適量的具有特殊功效的WPI-E+MA進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵可以提高凝固型酸奶的功能特性。類(lèi)似的研究如，張國(guó)柱等[12]添加了WPI酶解液的凝固型酸奶，抗氧化活性較空白對(duì)照組提高了11.08%。

圖7 不同濃度的WPI-E+MA對(duì)凝固型酸奶膽酸鹽結(jié)合率（%）Fig.7 Bile salts binding ability of different concentrations of WPI-E+MA (%)

3 討論

凝固型酸奶在制作過(guò)程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)粘稠度低、乳清析出的不良現(xiàn)象，而且在貯藏和運(yùn)輸期間極容易受到擠壓，都將嚴(yán)重影響其穩(wěn)定性和質(zhì)地，從而影響凝固型酸奶消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)意愿。近年來(lái)，大量研究已經(jīng)驗(yàn)證乳清蛋白作為添加劑添加至乳制品進(jìn)行發(fā)酵的可行性，不僅可以在增強(qiáng)其凝膠結(jié)構(gòu)上有幫助，而且具有特殊功能性質(zhì)的附加價(jià)值[41]。因此，本研究利用復(fù)合酶解結(jié)合蘋(píng)果酸處理WPI，得到一種具有降膽固醇性質(zhì)的生物活性肽，將其添加至凝固型酸奶中，并測(cè)定其在發(fā)酵過(guò)程中的變化。

在品質(zhì)上，對(duì)凝固型酸奶的持水力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示W(wǎng)PI-E+MA的添加量與持水力呈正相關(guān)，且8%添加量組最顯著（P＜0.05），其蛋白結(jié)構(gòu)因WPIE+MA的加入而更穩(wěn)定，研究表明WPI的比例可以提高凝固型酸奶凝膠的水結(jié)合能力，蛋白質(zhì)的加工對(duì)持水力也具有重要影響[1,42]，本文使用的8% WPIE+MA是經(jīng)過(guò)酶解和有機(jī)酸復(fù)合變性而來(lái)，更利于凝固型酸奶凝膠的形成。

在二級(jí)結(jié)構(gòu)上，游離巰基的結(jié)果顯示，隨著添加量的增加，游離巰基含量先增加后減少，8%添加量組含量最少，是由于發(fā)酵引起的低pH使得分子間的靜電斥力增加，游離巰基轉(zhuǎn)變?yōu)槎蜴I，蛋白發(fā)生聚合，與孫穎[29]的結(jié)果一致。紅外光譜中，β-轉(zhuǎn)角含量顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明低pH破壞了蛋白的次級(jí)鍵，分子結(jié)構(gòu)變得疏松，酸奶中的酪蛋白與WPIE+MA高度結(jié)合，形成聚合物；α-螺旋和β-折疊含量顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明形成的聚合物是由一些疏水性氨基酸組成[40]，且是穩(wěn)定而有序的。

微觀結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)，從SEM觀察到8% WPI-E+MA與酪蛋白的交聯(lián)作用增加了酸奶凝膠的分支結(jié)構(gòu)，從而形成均勻緊致的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在Akalin等[36]觀察到了類(lèi)似的微觀結(jié)構(gòu)。隨著添加量的增加，凝固型酸奶粒徑先增加后下降，根據(jù)研究學(xué)者的解釋[1]，主要是由于酸性pH更利于小顆粒的形成。在流變學(xué)特性中，添加量與表觀黏度、剪切應(yīng)力及粘彈性均呈正相關(guān)，余娛樂(lè)[52]報(bào)道了乳清蛋白對(duì)凝固型酸奶流變學(xué)特性的影響很大程度上取決于乳清蛋白的等級(jí)。本研究使用的WPI-E+MA是由酶解和蘋(píng)果酸復(fù)合變性而來(lái)，較強(qiáng)的降膽固醇作用在一定程度上影響著酸奶的凝膠特性。另外，本文研究了WPIE+MA添加量對(duì)酸奶在發(fā)酵前后降膽固醇作用的影響。結(jié)果顯示，在發(fā)酵前，8%添加量組結(jié)合膽酸鹽效果最顯著（P＜0.05）；在乳酸菌的發(fā)酵作用下，與發(fā)酵前同添加量或發(fā)酵后其他添加量相比，8%添加量組結(jié)合膽酸鹽效果都是最顯著的（P＜0.05），可能是由于WPI-E+MA自身的降膽固醇效果及其對(duì)乳酸菌的促發(fā)酵作用使得這種能力增強(qiáng)，與王丹等[53]結(jié)果類(lèi)似。

另外，本文對(duì)于WPI-E+MA凝固型酸奶的功能還只是停留在體外研究階段，當(dāng)?shù)诌_(dá)體內(nèi)腸胃時(shí)是否同樣具有效果，需要在模擬胃腸道環(huán)境中進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

WPI-E+MA能夠較好改善凝固型酸奶的持水力、表觀粘度、剪切應(yīng)力與粘彈性，其中8%WPIE+MA添加量達(dá)到最優(yōu)；酸奶的凝膠網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)也因WPI-E+MA的加入變得更加致密、聚合度更高、粒徑更大。另外，由于該改性WPI具有膽鹽結(jié)合能力，在酸奶制備過(guò)程中添加該WPI，能夠結(jié)合脫氧膽酸鈉（SDC）、膽酸鈉（SC）、牛磺膽酸鈉（STC），其中SDC結(jié)合能力良好。通過(guò)上述研究證明，WPIE+MA可有效改善凝固型酸奶的品質(zhì)并顯著提高膽酸鹽結(jié)合能力，為功能性WPI的應(yīng)用推廣奠定研究和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，改性膽鹽結(jié)合乳清分離蛋白對(duì)凝固性酸奶品質(zhì)及功能產(chǎn)生一定影響，但其對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味及消化特性仍未深入研究，下一步擬通過(guò)體外模擬消化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討以功能性乳清分離蛋白添加制備的凝固型酸奶消化特性。