茶多酚對酸奶發酵品質及抗氧化活性的影響

馮子健，陳 南，高浩祥，何 強，曾維才,,

（1.四川大學食品工程系，四川成都 610065；2.四川大學食品科學與技術四川省高校重點實驗室，四川成都 610065）

酸奶是牛乳經乳酸菌發酵和冷卻后熟所制得的一種發酵型乳制品，因其獨特的風味和良好的營養價值，深受消費者的喜愛[1]。但目前酸奶在生產和貯藏過程中仍存在著諸多問題，使產品質量不夠穩定，加之消費者對酸奶的口感及功能性等要求的提高，功能性輔料的選擇和營養強化型酸奶的研發已成為相關領域的研究熱點[2-3]。茶多酚是茶葉中酚類化合物的總稱，是茶葉中具有保健功能的活性物質，主要包括非酯型兒茶素（表兒茶素，Epicatechin，EC；表沒食子兒茶素，Epigallocatechin，EGC）和酯型兒茶素（表兒茶素沒食子酸酯，Epicatechin gallate，ECG；表沒食子兒茶素沒食子酸酯，Epigallocatechin gallate，EGCG）等成分。大量研究表明，茶多酚具有抗氧化、抑制病毒及抗輻射等多種有益人體健康的生物活性[4-5]。同時，茶多酚還具有綠色、安全及易得等優點，常作為食品添加劑應用于食品工業，對改良食品的質量與品質有積極的作用，在食品加工領域具有廣闊的應用前景[6]。

目前，相關領域科研人員對酸奶的研究以發展新型發酵菌種以及添加多糖及蛋白類營養補充劑為主，針對天然植物多酚進行設計的酸奶的研究內容較少[7]。相關研究表明，酚類化合物與牛乳酪蛋白具有較強的結合能力[8]，這種相互作用會使蛋白質的結構發生變化，從而改變牛奶制品的品質。雖然已有部分研究針對酚類物質在酸奶中的應用進行探索，但缺乏對發酵過程中酚類物質主成分變化的分析，忽略了乳酸菌對酚類物質的利用和分解。

本研究通過測定和評估茶多酚酸奶的品質特性（pH、可滴定酸度、營養成分含量、持水力、質構特性、顏色及風味成分）和功能活性（茶多酚中兒茶素含量的變化及體外抗氧化活性），探究茶多酚對酸奶發酵品質及抗氧化活性的影響，為茶多酚在酸奶加工領域的開發利用提供理論與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牛乳、活潤發酵乳 新希望乳業股份有限公司；茶多酚（純度≥95%） 通澤生物科技有限公司；蔗糖 成都市沃爾瑪超市；酚酞、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵（均為分析純），乙腈、甲醇（均為色譜純） 成都市科龍化工試劑廠；ABTS（2,2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，2,2'-聯氮-二（-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽）、DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實驗用水 為蒸餾水。

STARTER2100/3C pH計 奧豪斯儀器上海有限公司；TA.XT.Plus質構儀 英國Stable Micro Systems有限公司；CM-5色差色度儀 日本Konica Minolta公司；QP2010 SE氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 日本島津公司；Carboxen/PDMS纖維頭和固相微萃取手柄 美國Supelco公司；Agilent 1290高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）

美國Agilent公司；UV-1800BPC型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多酚酸奶制備 茶多酚酸奶制備：稱取一定質量的新鮮牛乳，添加5%（w/w，下同）的蔗糖，攪拌均勻后水浴加熱至60～65 ℃，并保持30 min，隨后冷卻至42 ℃，備用。向48 mL預處理后的牛奶中分別添加2.5 g發酵種子（新希望活潤發酵乳，該發酵種子的種類和劑量由預實驗結果所確定）和2 mL不同濃度（w/v，0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%和12.5%）的茶多酚溶液，使得茶多酚的最終濃度達到0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/100 mL牛乳。攪拌均勻后置于42 ℃條件下恒溫發酵4 h，發酵結束后于4 ℃條件下冷藏后熟24 h，備用[9]。

空白組酸奶制備：向48 mL預處理后的牛乳中分別添加2.5 g發酵種子（新希望活潤發酵乳）和2 mL蒸餾水，攪拌均勻后置于42 ℃條件下恒溫發酵4 h，發酵結束后于4 ℃條件下冷藏后熟24 h，備用。

未發酵的茶多酚牛乳制備：向48 mL預處理后的牛乳中分別添加2.5 g發酵種子（低溫巴氏滅菌處理，新希望活潤發酵乳）和2 mL不同濃度（w/v，0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%和12.5%）的茶多酚溶液，使得茶多酚的最終濃度達到0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/100 mL牛乳，攪拌均勻后，備用。

1.2.2 pH和可滴定酸度測定 稱取10 g酸奶樣品，使用pH計對樣品的pH進行測定。

稱取10 g酸奶樣品，與20 mL蒸餾水混勻，滴加適量的酚酞指示劑，隨后以0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色，且30 s內不褪色，滴定結束[10]。樣品的可滴定酸度值按下式計算：

式中：c為氫氧化鈉溶液的濃度（mol/L）；V為消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積（mL）；m為樣品質量（g）。

1.2.3 營養成分含量測定 水分含量測定：參照國家標準《食品安全國家國家標準 食品中水分的測定》（GB 5009.3-2016）中半固體類的直接干燥法[11]。

灰分測定：參照國家標準《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》（GB 5009.4-2016）中總灰分的測定方法[12]。

蛋白質含量測定：參照國家標準《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5-2016）中的凱氏定氮法[13]。

脂肪含量測定：參照國家標準《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》（GB 5009.6-2016）中的堿水解法[14]。

還原糖測定：參照國家標準《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》（GB 5009.7-2016）中的直接滴定法[15]。

1.2.4 持水力測定 向50 mL冷凍離心管中加入10 g酸奶樣品并進行密封，隨后于4 ℃條件下離心（3000 r/min）10 min，靜置10 min后棄掉上清液，稱量離心管與剩余沉淀物的總質量[16]。酸奶樣品的持水力按下式計算：

式中：m為空離心管的質量（g）；m1為裝有酸乳樣品離心管的質量（g）；m2為棄去上清液后離心管與剩余沉淀物的總質量（g）。

1.2.5 質構特性測定 采用質構儀測定酸奶樣品的硬度、粘性、膠粘性和內聚性。儀器的參數設定：探頭選用P/36R，測試模式為TPA（texture profile analysis），觸發力為5 g．測定前速度、測定時速度及測定后速度均為2 mm/s，測試距離為20 mm[17]。每組平行測定五次。

1.2.6 顏色測定 采用CM-5色差色度儀測定酸奶樣品的顏色。測定的光源為D65，測量區域為30 mm，測量的類型為培養皿測量，每組樣品平行測定3次，并以L*、a*、b*值來反映樣品顏色的變化。其中L*代表亮度值，a*代表紅綠值，b*代表黃藍值[18]。以空白組酸奶作為標樣，測量并計算其余檢樣的ΔL、Δa、Δb和ΔE。ΔE的計算公式如下所示：

式中：L*、a*、b*分別為樣品的亮度值、紅綠值和黃藍值；L0*、a0*、b0*分別為空白組樣品的亮度值、紅綠值和黃藍值[19]。

1.2.7 風味成分測定 頂空萃取條件：取酸奶樣品5 g置于頂空瓶內，插入萃取頭在60 ℃條件下萃取40 min。

GC條件：起始溫度為45 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min的速度升溫至80 ℃，保持1 min，隨后以5 ℃/min的速度升溫至240 ℃，保持5 min。進樣口溫度為250 ℃，傳輸線溫度為230 ℃，載氣為氦氣，流速為2.0 mL/min，進樣模式為不分流進樣[20]。

MS條件：離子源溫度為250 ℃，電離方式為EI，電子能量為70 eV；掃描速率為4.5 scans/s，捕獲范圍為30～400 m/z。

風味成分的定性和定量分析：通過檢索和對比標準譜庫（NIST，14.0 Gaithersburg，MD，USA）對目標化合物進行定性分析，采用歸一化積分法對各物質進行定量分析[21]。

1.2.8 茶多酚中兒茶素單體含量測定 兒茶素單體標準溶液配制：參考《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313-2018），稱取適量EC、EGC、ECG和EGCG標準品配制標準混合樣品儲備液。

茶多酚樣品溶液配制：準確稱取茶多酚樣品10 mg并溶解于10 mL甲醇中，配成茶多酚樣品儲備液。

酸奶樣品溶液配制：稱取10 g茶多酚凝固型酸奶（濃度為0.5 g茶多酚/100 mL牛乳），加入15 mL甲醇后，以4000 r/min離心10 min（25 ℃），取上清液并經0.45 μm濾膜過濾，備用。

流動相：流動相A：將90 mL乙腈，20 mL乙酸及2 mL乙二胺四乙酸二鈉溶液（10 mg/mL）加入到1000 mL水中，搖勻后經0.45 μm濾膜過濾。流動相B：將800 mL乙腈，20 mL乙酸及乙二胺四乙酸二鈉（10 mg/mL）溶液加入到1000 mL水中，搖勻后經0.45 μm濾膜過濾。

色譜條件：色譜柱：ODS-3反相柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；紫外檢測器檢測波長：278 nm；進樣量：10 μL；洗脫程序：0～10 min，100% A；10～25 min，100%～68% A；25～35 min，68% A；35～36 min，68%～100% A[22]。

1.2.9 茶多酚酸奶抗氧化活性測定 樣品制備：向10 g酸奶樣品中加入15 mL無水乙醇和0.5 mL濃鹽酸，然后以3000 r/min離心10 min（4 ℃），靜置10 min后取上清液進行以下體外抗氧化實驗。

DPPH自由基清除實驗：將上清液稀釋200倍后，取2 mL稀釋液與2 mL DPPH自由基溶液（0.1 mol/L）混勻，25 ℃條件下避光孵育30 min后，于517 nm波長下測定其吸光度，以95%乙醇作空白對照，DPPH自由基清除率的計算公式如下所示[23]。

ABTS+自由基清除實驗：將上清液稀釋30倍后，取0.1 mL稀釋液與3.9 mL ABTS工作液混勻，25 ℃條件下反應6 min后，于734 nm波長下測定其吸光度，以蒸餾水作空白對照，ABTS+自由基清除率的計算公式如下所示[24]。還原能力的測定：將上清液稀釋30倍后，取2.5 mL稀釋液，與2.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mmol/L，pH6.6）和2.5 mL鐵氰化鉀溶液（1%，w/v）混勻，50 ℃水浴20 min后迅速冷卻，加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%，w/v），混合后以3000 r/min離心10 min（25 ℃），取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL三氯化鐵溶液（0.1%，w/v），混勻后于700 nm波長下測定其吸光度[25]。吸光度越大，則樣品的還原能力越強。

1.3 數據處理

每組進行多次重復實驗，所有結果均以“平均值±標準差”的形式表示。實驗結果用Origin（version 8.0 for Windows，OriginLab Corporation，SPSS）軟件進行統計分析，顯著性差異水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 茶多酚對酸奶pH及可滴定酸度的影響

茶多酚濃度對酸奶的pH及可滴定酸度的影響如圖1所示。

酸度的變化與酸奶的黏度、質地以及組織狀態等方面密切相關。由圖1可知，不同濃度茶多酚的加入對酸奶的pH（圖1A）和可滴定酸度（圖1B）并未產生顯著影響，而酸奶的酸度主要由乳酸菌發酵產生。本研究結果表明，該濃度梯度下茶多酚的加入并未顯著抑制發酵過程中乳酸菌的生長及發酵產酸[26]。

圖1 茶多酚濃度對酸奶pH及可滴定酸度的影響Fig.1 Effects of TP concentrations on pH and titratable acidity of yogurt

2.2 茶多酚對酸奶營養成分含量的影響

茶多酚濃度對酸奶營養成分含量的影響如表1所示。

酸奶中各項營養成分的含量是評價酸奶質量的重要指標。由表1可知，不同濃度茶多酚的添加對酸奶的水分、脂肪、蛋白質及灰分含量并未產生顯著影響，而還原糖含量有所增大，這可能是由于茶多酚的還原性干擾了測定結果，使得所測還原糖含量偏高[27]。

表1 茶多酚濃度對酸奶營養成分含量的影響Table 1 Effect of TP concentrations on nutrient content of yogurt

2.3 茶多酚對酸奶持水力的影響

茶多酚濃度對酸奶持水力的影響如圖2所示。

酸奶的持水力是受酸奶中總固形物含量和總蛋白含量的影響，與產品的組織狀態密切相關[28]。由圖2可知，與空白對照組酸奶的持水能力相比，隨著茶多酚添加量的增大，酸奶的持水力略有減小，但仍然維持在80%以上。酸奶持水力的大幅下降會嚴重影響產品的品質，使得其在儲存過程中發生乳清析出和質量劣變等問題，縮短產品的保質期。查閱相關文獻分析可知[8-9,17,28]，酸奶持水力的輕微降低對產品的品質并不會產生顯著的負面影響，而植物多酚的高濃度添加會使得酸奶的持水力大幅下降，故應嚴格控制植物多酚在酸奶中的添加劑量。在本研究中，含有不同濃度（0.1～0.5 g/100 mL牛乳）茶多酚的酸奶在設定的儲存周期內（15 d）并未發生乳清析出等不良現象，表明該濃度劑量下茶多酚的添加對產品的儲存品質并未產生負面影響。此外，相關研究表明，茶多酚的加入可能會促使蛋白聚集形成大分子聚集物，使得酸奶的內部結構發生改變，從而改變蛋白質分子與水分子間的相互作用，降低蛋白質對水分子的吸附與控制作用，進而使得持水力下降[8]。

圖2 茶多酚濃度對酸奶持水力的影響Fig.2 Effect of TP concentrations on the water-holding capacity of yogurt

2.4 茶多酚對酸奶質構特性的影響

茶多酚濃度對酸奶硬度、黏性、膠粘性和內聚性的影響如圖3所示。

質構特性是衡量酸奶品質的一個重要指標，酸奶的口感、組織狀態及質量穩定性都與之密切相關[29]。由圖3可知，茶多酚的添加使得酸奶的硬度（圖3A）、黏性（圖3B）和膠粘性（圖3C）整體呈下降趨勢，而對其內聚性（圖3D）并未產生顯著影響。查閱相關文獻可知，酸奶發酵過程中，茶多酚與牛乳中的酪蛋白分子發生相互作用，可引起酪蛋白分子之間的聚集，干擾了酸奶內部網狀部結構的形成，從而使得酸奶的硬度和黏性值下降[30]。實際加工和銷售中，過高的硬度和黏性對于酸奶的感官品質有負面影響，會降低消費者對產品的接受程度。因此，適量濃度茶多酚的添加，可以使得凝固型酸奶的質地更為柔軟，降低其對容器的黏附性，在一定程度上提升其感官品質。

圖3 茶多酚濃度對酸奶質構特性的影響Fig.3 Effect of TP concentrations on texture of yogurt

2.5 茶多酚對酸奶顏色的影響

茶多酚濃度對酸奶顏色的影響如表2所示。

酸奶的顏色是感官評價的重要參考指標，影響著消費者的食欲和總體接受程度。由表2可知，隨著茶多酚濃度的增加，ΔL值逐漸下降，而Δa值、Δb值和ΔE值逐漸增大，這與茶多酚本身的棕紅色顏色相關。研究結果表明，適量茶多酚的添加會賦予酸奶一定的色澤，使之呈現出淡淡的茶湯色，增加產品的市場競爭力[31]。

表2 茶多酚濃度對酸奶顏色的影響Table 2 Effect of TP concentrations on the color of yogurt

2.6 酸奶風味成分的分析

酸奶中風味成分的種類和含量與酸奶的感官評價密切相關[32]。由表3可知，酸奶中的揮發性風味成分主要包括酸類、醛類、酮類、醇類和其他類化合物。分析可知，茶多酚的加入降低了酸奶中酸類物質的相對含量，增多了其它風味物質的含量和風味物質的總類別數。這可能是由于茶多酚具有良好的反應活性，參與了酸奶發酵過程中相關風味成分的生成反應，從而影響了風味物質的組成及比例[15]。同時，茶多酚還可能通過對酸奶中益生菌相關代謝途徑的調控，間接地對酸奶的風味產生影響。研究結果表明，茶多酚的添加可以豐富酸奶的風味，對于改善酸奶風味和提高酸奶品質具有積極影響。

表3 茶多酚（0.1 g/100 mL牛乳）對酸奶風味成分的影響Table 3 Effect of TP (0.1 g/100 mL milk) on flavor components of yogurt

2.7 茶多酚中主要兒茶素單體含量的變化

通過高效液相色譜法對茶多酚酸奶中四種兒茶素單體（EC，EGC，ECG及EGCG）進行分析，結果如圖4～圖6所示。

圖6 茶多酚酸奶（0.5 g茶多酚/100 mL牛乳）的高效液相色譜圖Fig.6 High performance liquid chromatography of yogurt with 0.5 g TP/100 mL milk

圖4為兒茶素混合標品的高效液相色譜圖，結合《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313-2018）中兒茶素類測定的結果可知[22]，實驗所用混合標品中按照保留時間依次出現的物質為EGC、EC、EGCG和ECG。

圖4 混合標準溶液高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatography of mixed standard sample

圖5為未經發酵處理的茶多酚的高效液相色譜圖。由圖可知，實驗所用的茶多酚中含有四種兒茶素，且各自的含量分別為1.27%（EGC）、1.86%（EC）、60.83%（EGCG）和24.78%（ECG），EGCG為茶多酚中含量最高的兒茶素成分，這與相關報道和測定一致[5,22]。

圖5 茶多酚溶液（1 mg/mL）的高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatography of TP solution(1 mg/mL)

圖6是茶多酚酸奶中茶多酚的高效液相色譜圖。由圖6可知，在乳酸菌的發酵作用下，茶多酚中四種主要兒茶素單體的相對含量都發生了變化，分別為2.92%（EGC）、1.61%（EC）、39.64%（EGCG）和20.16%（ECG）。同未經發酵的茶多酚相比（圖5），酯型兒茶素（EGCG和ECG）的相對含量降低。分析可知，酯型兒茶素結構中的酯鍵在酶的作用下不穩定，易發生水解。酸奶發酵過程中，益生菌的生長代謝會產生多種酶，它們在適宜的發酵溫度條件下可能對酯鍵產生水解效應，故而使得酯型兒茶素在共發酵過程中結構發生了改變，酯鍵被破壞，使其降解生成分子量更小的物質[33]。

2.8 茶多酚酸奶抗氧化活性的分析

茶多酚酸奶和未經發酵的茶多酚牛乳的抗氧化活性如圖7所示。

圖7 茶多酚酸奶和未發酵的茶多酚牛乳的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of TP yogurt and TP milk

由圖7未添加茶多酚的空白對照組可知，未添加茶多酚的牛乳（即茶多酚濃度為0 g/100 mL）不具有抗氧化活性，而牛乳經保溫發酵形成酸奶后，其抗氧化活性相比未發酵牛乳的略有增加，但并不顯著，該結果表明牛乳發酵產物所提供的抗氧化活性較低，而茶多酚的添加能夠賦予牛乳和酸奶更強的抗氧化活性。同時，隨著茶多酚添加濃度的增大，茶多酚酸奶和茶多酚牛乳的DPPH自由基清除率（圖7A）和ABTS+自由基清除率（圖7B）逐漸提高，呈顯著的濃度劑量效應。此外，隨受試濃度的增加，反應溶液的吸光度值也在逐漸增大（圖7C），表明其還原能力逐漸增強。結合前述實驗結果可知，茶多酚雖然與酸奶中的蛋白質結合并在發酵過程中受到益生菌相關酶的作用發生了降解，但其仍能展現出較強的抗氧化活性（圖7）。同時，與同濃度未經發酵的茶多酚牛乳的抗氧化活性結果相比，茶多酚酸奶的DPPH及ABTS+自由基清除能力總體上并沒有發生顯著的變化，其還原能力增強，表明由益生菌的生長代謝所促發的茶多酚中酯型兒茶素的降解并未對茶多酚的抗氧化能力產生顯著的負面影響，這可能是由于酯型兒茶素（ECG和EGCG）降解所得的小分子物質仍然具有良好的電子轉移能力，從而表現出良好的還原能力與自由基清除作用[31,33]。因此，乳酸菌發酵所得的茶多酚酸奶仍然具有良好的抗氧化能力。實驗結果表明，茶多酚牛乳發酵所得的酸奶仍具有良好的抗氧化活性。

3 結論

添加茶多酚對酸奶的pH、可滴定酸度、持水力及營養成分含量影響不大。同時，茶多酚的添加改善了酸奶的質構特性和顏色，提升了酸奶的風味。此外，茶多酚中的酯型兒茶素在發酵過程中會發生顯著的降解，但茶多酚酸奶仍具有良好的自由基清除活性及還原能力等抗氧化作用。實驗結果表明，茶多酚對酸奶的品質及功能性有益，可作為一種天然成分參與酸奶的制備。研究為茶多酚在酸奶加工領域的應用提供參考。后續還需要進一步優化和確定茶多酚在酸奶中添加的工藝參數，并對其在乳酸菌發酵過程中的降解歷程及對其抗氧化作用影響的構效關系和相關分子機理進行研究。