‘東紅’獼猴桃軟腐病病原菌的分離鑒定及褪黑素對其控制效果

瞿光凡，王 瑞，馬 超，雷霽卿，巴良杰，曹 森，羋婷婷，龍 芳

（貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽 550005）

“東紅”獼猴桃（'East Red'Actinidia chinensis）是由中國科學院武漢植物園選育出的新品種，因其富含豐富維生素C、黃酮等營養物質，深受消費者的喜愛[1-2]。但是‘東紅’獼猴桃感染軟腐病的情況逐年上升。從目前研究來看，引起獼猴桃軟腐病病原菌主要有葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）[3]、間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）（擬莖點霉菌的有性態）[4]和盤多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora）[5]等。研究還發現灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）和鏈格孢菌（Alternariasp.）也可引起獼猴桃軟腐病[6]。近年來，對于獼猴桃軟腐病的防治主要集于化學殺菌劑方面。例如研究表明50%多菌靈可濕性粉劑1000倍液對葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）抑制率為91.97%[7]；肟菌酯戊唑醇、異菌脲和苯醚甲環唑也能有效抑制葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和擬莖點霉菌（Phomopsissp.）生長[8]。然而，化學殺菌劑存在化學殘留及病原菌耐藥問題仍需解決。

褪黑素（Melatonin，MT）是一種內源性具有多種調節功能的生物活性分子，參與果蔬的生長、分化、成熟、衰老和防御等多種生理活動[9-11]。孫子荀等[12]研究發現，0.5 mmol/L褪黑素能夠顯著抑制鏈格孢菌菌絲生長，誘導提高草莓抗病性相關基因表達量，從而提高草莓對黑斑病的抗性。曹晶晶等[13]研究結果顯示，褪黑素處理有效抑制蘋果灰霉病病斑擴展及誘導提高果實過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，增強蘋果采后抗病能力。此外，褪黑素處理還可提高荔枝[14]、番茄[15]、梨[16]、棗[17]采后抗病性。然而，褪黑素在獼猴桃采后病害的防控研究未見報道。因此，本研究對‘東紅’獼猴桃貯藏期軟腐病進行分離鑒定，并探究褪黑素對其控制效果，以期為‘東紅’獼猴桃軟腐病的綠色防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘東紅’獼猴桃鮮果 于2020年9月在貴州省水城縣宏興綠色農業種植園采摘，獼猴桃果實當天運回貴陽學院果品加工工程技術研究中心實驗室，挑選無機械損傷、無病蟲害的果實進行后續試驗；植物基因組DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAAC CTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 生工生物工程（上海）股份有限公司；褪黑素 上海源葉生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂 上海博微生物科技有限公司；PE20袋 國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津）。

ChemiDoc免染型蛋白印跡成像系統 成都百樂科技有限公司；CX21光學顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司；超凈工作臺 上海蘇凈實業有限公司；電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ‘東紅’獼猴桃軟腐病的分離鑒定

1.2.1.1 病原菌的分離純化 采用組織塊分離法對‘東紅’獼猴桃病原菌進行分離[18]。選取發病的‘東紅’獼猴桃果實，用75%酒精浸泡消毒、無菌水清洗、無菌紙吸干水分后置于超凈工作臺中自然晾干。用無菌手術刀取病果病健交界處約4 mm果肉組織放于PDA培養基上，28 ℃恒溫培養2～4 d，觀察菌絲生長及菌落情況，待菌落形成后用接種環挑取菌落邊緣不同形態的菌絲于新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上進行單孢培養，直至獲得純化菌株，并斜面保存于4 ℃冰箱。

1.2.1.2 病原菌的形態觀察 將純化的病原菌接種于PDA培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱培養7 d，觀察并記錄菌落的生長情況，利用光學顯微鏡觀察記錄菌絲與分生孢子的形態和結構。

1.2.1.3 病原菌致病性試驗 選取健康、無病害的獼猴桃果實，利用2%次氯酸鈉浸泡消毒1 min、無菌水清洗、75%酒精擦拭消毒，再用無菌水清洗2次后置于超凈工作臺中自然晾干，備用。將從患病獼猴桃果實分離純化后的菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中，置于28 ℃恒溫培養箱培養5 d，用滅菌的打孔器取菌餅（4 mm）損傷接種于‘東紅’獼猴桃果實，每個病原菌接種3個果。損傷接種的‘東紅’獼猴桃果實放于滅菌的保鮮盒中并用PE20袋裝，25 ℃，85%的條件下恒溫培養7 d。定期觀察果實發病情況，待果實發病后，從發病果實中分離病原菌進行培養，將損傷接種發病果的病原菌與原菌株進行比較，形態一致則確定為致病菌。

1.2.1.4 病原菌rDNA-ITS序列與系統發育分析

取一定量純化后培養5～7 d病原菌菌絲，用液氮研磨粉末狀后，參照植物基因組DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA，選用真菌ITS1和ITS4為引物對病原菌進行PCR擴增。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃終延伸10 min[12]。50 μL反應體系：Taq Master Mix 25 μL、ITS1和ITS4各2 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O220 μL。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳及成像后，其產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析，選擇并下載同源性較高的序列，采用MEGA7軟件構建病原菌系統發育樹[19]。

1.2.2 褪黑素對病原菌的抑制效果

1.2.2.1 褪黑素對病原菌體外抑菌試驗 采用菌絲生長速率法[20]測定褪黑素對‘東紅’獼猴桃果實貯藏期病原菌體外抑制效果。在前期的預實驗中，選用50、100、300、500和700 μmol/L MT進行試驗。預實驗結果得知，50 μmol/L MT對菌絲及病斑擴展無顯著抑制，700 μmol/L MT處理顯著抑制菌絲生長，但對果實病斑擴展的控制與500 μmol/L MT處理無顯著性。因此，本實驗選取100、300和500 μmol/L MT進行試驗。分別稱取不同質量的褪黑素添加至已滅菌的PDA培養基中，搖勻，使其PDA培養基中褪黑素濃度分別為100、300和500 μmol/L，以不加褪黑素PDA培養基作為對照組；用無菌打孔器從純化后培養5 d的病原菌菌落邊緣打取4 mm菌餅放于培養皿中央，每個病原菌3個平行。28 ℃恒溫培養5～7 d，每天采用十字交叉法測量菌落直徑，并參照王丹等[21]方法計算抑菌率。

式中：W：抑菌率，%；A：對照組菌落直徑，mm；B：處理組菌落直徑，mm；C：菌餅直徑，mm。

1.2.2.2 褪黑素對病原菌活體抑菌試驗 選取健康的獼猴桃果實，用75%酒精浸泡30 s，后用無菌水清洗3次，置于超凈工作臺中自然晾干。用無菌鐵釘在果實赤道處打1個孔（深2 mm，直徑4 mm），1 h后在每個果實傷口處分別注射20 μL的0（無菌水，對照組）、100、300和500 μmol/L褪黑素溶液，6 h后取純化后培養5 d的菌落邊緣的菌餅（4 mm）接種于果實傷口處，每個處理組6個果。接種后的果實放于滅菌的保鮮盒中并用PE20袋包裝，20 ℃，90%的條件下培養5 d，每天觀察果實發病情況并測量果實病斑直徑。

1.3 數據處理

實驗基礎數據采用Excel 2016軟件進行統計分析，每個處理重復3次，采用SPSS19.0軟件的Duncan法對數據進行差異顯著性分析（P＜0.05表示顯著性差異），采用Origin 2018對數據進行作圖。

2 結果與分析

2.1 ‘東紅’獼猴桃軟腐病菌分離鑒定

2.1.1 病原菌形態學鑒定 將貯藏期感染軟腐病的‘東紅’獼猴桃果實進行組織分離、單孢培養后獲得2株病原菌（見圖1）。第1株菌絲初期白色茸毛狀，后期呈灰白色（圖1A），基質初期米黃色后為棕色（圖1B）；顯微鏡下菌絲白色，有隔膜和分枝，培養10 d后產生圓形或橢圓形分生孢子，無色透明，有隔膜（圖1C）。其初步鑒定為間座殼屬（Diaporthesp）。第2株菌絲稠密，初期為白色棉絮狀，后期變為黑色或灰黑色（圖1D），基質初為暗灰色后變為褐色或黑色（圖1F）；顯微鏡下菌絲有隔膜、較多分枝，菌落生長14 d后產生不成熟的孢子，橢圓形或球形（圖1E）；根據其培養特性及形態特征初步鑒定為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。

圖1 ‘東紅’獼猴桃2株病原菌的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of two pathogenic strains of 'East Red' kiwifruit

2.1.2 病原菌的致病性 將純化的2株病原菌回接到健康的‘東紅’獼猴桃果實上，25 ℃、85% RH恒溫培養5～7 d。損傷接種5 d后，菌株DH1、DH2（見圖2A～圖2B）損傷接種部位液體滲出，果面出現明顯的軟腐病病斑，呈圓形或橢圓形，病斑處果皮呈現暗黃色，果肉軟化，橫切果實可見病斑擴展至果心，果肉穿孔性腐爛并產生臭味，失去食用價值；而CK組（對照）均無發病癥狀。將接種7 d后發病果實再次進行組織分離培養，并將其與回接前菌株形態特征和培養性狀進行比對，其結果一致則確定為致病菌。

圖2 ‘東紅’獼猴桃接種菌株DH1（A）、DH2（B）后的癥狀Fig.2 Symptoms of 'East Red' kiwifruit inoculated with strains DH1 (A) and DH2 (B)

2.1.3 病原菌分子生物學鑒定 以分離得到的2株病原菌的DNA為模板、ITS1和ITS4為引物進行PCR擴增，PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測得到500～700 bp片段（圖3）。將2株病原菌rDNA-ITS序列提交到GenBank數據庫中進行BLAST 同源性比對，搜索并下載同源性較高的序列，采用MEGA 7軟件構建病原菌系統發育樹（圖4）；由系統發育樹分析結果發現，DH1、DH2菌株分別與Diaporthe phaseolorum（NR165879.1）、Botryosphaeria dothidea（NR111146.1）處于同一分支，同源性較高，并且相似度高達97%、100%；并結合其培養性狀和形態學鑒定結果，確定‘東紅’獼猴桃軟腐病病原菌為間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。

圖3 病原菌DH1、DH2的PCR產物電泳圖Fig.3 Electrophoretic map of PCR products of pathogenic bacteria DH1 and DH2

圖4 病原菌DH1、DH2的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of pathogenic bacteria DH1 and DH2

2.2 褪黑素對病原菌的抑制效果

2.2.1 褪黑素對病原菌體外抑制效果 由圖5可知，兩種病原菌的菌落直徑隨著培養時間的延長而增加，但褪黑素對間座殼菌（圖5A）、葡萄座腔菌（圖5B）菌絲有一定的抑制作用，并且2株病原菌對褪黑素的敏感性不同。在培養3 d后，不同濃度褪黑素均能顯著地抑制2株病原菌生長（P＜0.05），其中，500 μmol/L抑制效果最好。由表1可知，在培養5 d時，500 μmol/L褪黑素對間座殼菌、葡萄座腔菌的抑制率分別為71.22%和63.34%。

表1 褪黑素對間座殼菌和葡萄座腔菌的抑菌率Table 1 Antibacterial rate of melatonin on Diaporthe phaseolorum and Botryosphaeria dothidea

圖5 褪黑素對間座殼菌（A）和葡萄座腔菌（B）菌落生長的影響Fig.5 Effect of melatonin on colony growth of Diaporthe phaseolorum (A) and Botryosphaeria dothidea (B)

2.2.2 褪黑素對病原菌的體內抑制效果 由圖6可知，褪黑素處理對‘東紅’獼猴桃軟腐病病斑的擴展具體一定的控制效果，在接種貯藏1 d時果實開始出現病癥，其中，500 μmol/L褪黑素完全抑制2株病原菌病斑的擴展。在3 d時，接種間座殼菌CK組果實病斑直徑顯著大于100、300和500 μmol/L褪黑素處理（P＜0.05），其病斑直徑為18.52 mm，分別是褪黑素處理組的1.74、2.90和4.04倍；而接種葡萄座腔菌CK組果實病斑直徑為20.84 mm，分別是褪黑素處理組的1.67、1.93和2.89倍。在接種貯藏5 d時，500 μmol/L褪黑素處理的病斑直徑分別僅為對照組的37.40%和45.50%。

獼猴桃軟腐病也稱熟腐病，在花期形成幼果時侵染于幼果中并長期潛伏在果實組織內，在果實貯藏和銷售過程中爆發，果實發病初期果肉局部軟化，果面出現病斑且滲出組織液，病斑內部果肉呈現乳白色，果實發病后期病斑大面積擴展，果肉腐爛并產生臭味，果實失去商品價值[22-23]。石浩等[22]研究發現引起‘紅陽’獼猴桃軟腐病病原菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）。葡萄座腔菌不僅能使獼猴桃果實致腐，在葉片上產生大量的分生孢子致葉片產生斑點，同時還能侵染黃桃[24]、柑橘[25]等果實致腐。而間座殼菌是一種導致多種果蔬致病的病原性真菌，能引起柑橘黑點病和葡萄柚蒂腐病的發生[26]。本研究發現，引起‘東紅’獼猴桃采后軟腐病的致病菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和間座殼菌（Diaporthe phaseolorum），并在果實體內研究發現，果實在發病初期，果實局部果肉變軟，果面周圍出現病斑，發病后期果實發病部位組織液流出，產生異味（圖6），此結果與前人研究的結果一致。吳文能等[8]報道‘貴長’獼猴桃軟腐病主要病原菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeriasp.）、擬莖點霉菌（Phomopsissp.）和鏈格孢菌（Alternaria alternata），其中鏈格孢菌檢出率較低 。雷霽卿等[27]發現‘紅陽’獼猴桃軟腐病主要致病菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeriasp.）、擬莖點霉菌（Phomopstssp.）、交鏈孢菌（Alternariasp.）、小新殼梭孢菌（Neofusicoccumsp.）和間座殼菌（Diaporthesp.），并發現間座殼菌的檢出率和致病力較弱。王小潔等[7]研究結果顯示，引起‘海沃德’獼猴桃采后軟腐病的主要致病菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。以上研究表明，引起獼猴桃軟腐病的病原菌種類較多，且致病力及發病規律比較復雜。

果實在采后貯藏期間遭受生物或非生物脅迫時，植物體內自發一系列防御反應[28]。Li等[29]研究表明，MT處理誘導提高番茄果實中苯丙烷代謝相關酶活性，促進果實中總酚、類黃酮和木質素含量的積累，增強番茄果實對灰霉（Botrytis cinerea）的抵抗力；Zhang等[30]研究發現，MT處理降低了棗果相對電解滲漏率、過氧化氫含量和超氧陰離子產生速率，維持了抗壞血酸和還原型谷胱甘肽含量，從而增強棗果鏈格孢菌（Alternaria alternata）對的抗性；以上研究說明MT對病原菌不具有體外抑菌活性，但MT可以通過誘導果實采后果實苯丙烷代謝產物合成及提升果實病程相關蛋白活性，維持果實ROS代謝平衡，從而提高果實采后抗病能力。然而，研究還發現，褪黑素能夠顯著抑制草莓鏈格孢菌（Alternaria alternata）[12]、大棗青霉（Penicillium polonicum）[31]和荔枝霜疫霉（Peronophythora litchii）[32]菌絲生長。說明褪黑素對病原菌菌絲的抑菌活性其可能與褪黑素的濃度、病原菌的敏感性和種屬有關。本研究發現，褪黑素對葡萄座腔菌和間座殼菌菌絲生長具有一定的抑制作用（圖5），并能有效控制軟腐病病斑的擴展（圖6）。然而，對于‘東紅’獼猴桃軟腐病的發病規律、致病力以及褪黑素對其的抑制機理還需進一步研究。

圖6 褪黑素對間座殼菌（A）和葡萄座腔菌（B）病斑擴展的影響Fig.6 Effect of melatonin on plaque expansion of Diaporthe phaseolorum (A) and Botryosphaeria dothidea (B)

3 結論

本研究鑒定出引起‘東紅’獼猴桃貯藏期軟腐病的病原菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和間座殼菌（Diaporthe phaseolorum），并探究不同濃度（100、300和500 μmol/L）褪黑素對其控制效果。結果表明，褪黑素體對兩株病原菌具有一定抑制作用，并能有效控制果實病斑的擴展，其中500 μmol/L褪黑素控制效果最佳。因此，褪黑素可作為‘東紅’獼猴桃采后保鮮的一種有效策略。