海參腸多糖的提取工藝優化及其理化性質研究

Esther Mwizerwa MUHINDO，王藝瑾，吳劍夫，吳 濤，劉 銳，隋文杰，張 民,2,

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.天津農學院，天農農產品加工中外聯合研究中心，天津 300392）

隨著我國經濟發展，海參需求量不斷增加，截止2018年，我國干海參產量約為4379噸，約占全球干海參產量11.2%[1]。海參加工行業經過多年的發展，目前市場產值已超過500億元[1]。然而，在海參產業高度工業化和技術化發展的同時也帶來了大量環境問題，其中包括海參腸在內的海參內臟等廢棄物的隨意處理，不僅對生態環境造成污染，也浪費了大量的營養物質。國內外科研人員針對海參內臟資源進行了部分研究，對海參內臟中的營養物質進行提取鑒定和生物活性研究。海參內臟主要包括海參腸、海參卵和海參精等。目前，研究表明海參內臟具有極高的營養價值和醫療價值[2-3]。海參內臟含有豐富的活性物質，如蛋白質、多糖、脂肪酸、皂苷、性腺色素以及微量元素等[4-8]。海參內臟具有多種生物學活性，如抑癌、抗氧化和降血脂等[9-12]。楊佳洪等[13]比較不同蛋白酶對海參內臟的酶解能力，并通過響應面分析法優化海參內臟的酶解條件，發現中性蛋白酶對海參內臟具有更好的酶解效果，酶解產物具有較好的抗氧化活性。海參內臟多糖表現出極強的體外抗氧化能力，且與濃度呈正相關，與體壁多糖相比，具有更強的羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力[14]。此外，有研究顯示從海參中提取的糖胺聚糖能夠顯著降低高脂飲食大鼠的血清指數，具有良好的降血脂效果[11]。

多糖是海參內臟的重要組成成分。海參內臟多糖主要存在于海參腸壁、呼吸樹以及卵、精細胞。海參多糖主要有海參糖胺聚糖和海參巖藻多糖兩類，其糖鏈與蛋白相結合，具有抗凝、抗血栓、促纖溶等作用[15-16]。海參多糖常用的提取方法有化學水解法、酶解法和熱水法。化學水解法和酶解法通過破壞多糖和蛋白質間的連結使二者分離[3]。化學水解法操作簡單，但會過度降解多糖分子并出現脫硫現象。楊濤等[17]采用堿性蛋白酶水解海參內臟，蛋白質和總糖提取率高達60%～70%。酶解法在不改變糖鏈結構的基礎上，使蛋白質與多糖實現分離，從而達到提取多糖的目的，但提取率較低。熱水法則可將大部分多糖溶出到熱水中，且對多糖的破壞較小，操作簡單，廣泛應用于工業生產中[18]。海參腸是海參內臟的重要組成部分，海參腸多糖的抗氧化能力大于體壁多糖，這可能與兩部位多糖結構、含量或化學成分不同有關。為了合理利用海參廢棄物資源，將海參內臟細分，本研究針對海參腸多糖進行分離鑒定。相對于其他提取方法，熱水提取法操作簡單、對多糖結構破壞性小且成本較低，因此本研究采用熱水法從海參腸中提取多糖，并結合響應面法對海參腸多糖的提取工藝進行優化，擬獲取最佳提取工藝，進一步分析其理化性質，為海參廢棄物資源利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海參內臟廢棄物 由百德福生物技術有限公司（中國河北）提供；咔唑、石油醚、硫酸、乙醇、牛血清蛋白、硫酸鈉、葡萄糖醛酸 國藥集團化學試劑有限公司；鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、巖藻糖 上海源葉生物科技有限公司；所有化學試劑 均為分析純。

AB204-N電子分析天平 上海精科實業有限公司；TDL-5-A離心機 上海安亭科技儀器廠；QL-901微型福特混頻器 海門麒麟貝爾儀器制造有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海正榮生化儀器廠；DGG-101-1電動鼓風干燥箱 天津天宇儀器有限公司；JY-20高速粉碎機 九陽電器有限公司；KDN-08C數字溫控蒸煮器 上海鑫佳儀器有限公司；Modulyod-230冷凍干燥機 美國Thermo公司；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用有限公司；TA-Q50熱重分析儀 美國TA公司；SU1510掃描電子顯微鏡 日本日立公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；7890A氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海參腸組分測定 海參腸組分分析采用以下標準方法進行測定：灰分（GB 5009.4-2016）、水分（GB 5009.3-2016）、脂肪（GB 5009.6-2016）和蛋白質（GB 5009.5-2016）。

1.2.2 海參腸預處理 將海參腸從海參內臟器官中分離，自來水洗滌后烘干備用。利用高速粉碎機將干燥的海參腸物料粉碎，過60目篩備用。

1.2.3 多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法[19]測定多糖含量。濃度為0.1 mg/mL葡萄糖溶液作為標準品溶液。取標準品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于不同試管中，并用蒸餾水補齊至1 mL，分別加入6%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入硫酸5.0 mL，置于冰中20 min。冷卻至室溫后，于波長490 nm處測定吸光度。以標準品濃度（x）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=0.0134x+0.01（R2=0.999）。

1.2.4 海參腸多糖的提取工藝 稱取50 mg海參腸粉末料液比為1:8（mg/mL），于80 ℃熱水條件下提取1 h，沉淀重復浸提2次，并于4000 r/min離心10 min，收集上清液。上清液在60 ℃下真空濃縮，將上清液濃縮至一定體積后采用Sevag法去除蛋白，加入3倍體積的無水乙醇在4 ℃靜置12 h后，4000 r/min離心10 min，將沉淀重新溶于蒸餾水中，冷凍干燥得到海參腸粗多糖。海參腸多糖得率計算公式如下：

式中：M：干燥后海參腸多糖的質量，mg；M0：海參腸粉末的質量，mg。

1.2.5 海參腸多糖提取單因素實驗 固定因素水平為提取時間1 h、提取溫度80 ℃、提取次數2次、料液比1:8（mg/mL）。考察不同提取時間（0.25、0.5、1、1.5、2.0、2.5 h）、不同提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）、不同料液比（1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12 mg/mL）和不同提取次數（1、2、3、4、5次）對多糖得率的影響。

1.2.6 響應面法優化海參腸多糖提取工藝 根據單因素實驗結果選取因素水平，建立4因素3水平Box-Benhnken試驗。以多糖得率為響應值，優化海參腸多糖提取工藝。響應面試驗設計因素水平表如表1所示。

表1 響應面因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.7 海參腸多糖理化性質研究

1.2.7.1 海參腸多糖分子量分布測定 用超純水配制2 mg/mL多糖溶液，過0.22 μm濾膜，采用高效液相色譜儀進行檢測，凝膠色譜柱型號為OHpak SB-805 HQ（8.0 mm×300 mm），以超純水作為流動相，流速為0.8 mL/min，樣品進樣量為20 μL。根據葡聚糖標準品的相對分子量（5300、3700、2400、2000、500、110、70和40 kDa）和保留時間制作標準曲線為Y=0.0012X5-0.0353X4+0.3229X3-0.7967X2-3.0039X+19.6627，R2=0.999，其中X為相對保留時間，Y為相對分子量。

1.2.7.2 單糖組成分析 采用氣相色譜法測定海參腸多糖的單糖組成[20]。取1 mL三氟乙酸（2 mol/L）加入含有10 mg海參腸多糖的三角瓶中，于120 ℃下水解6 h。酸降解產物經真空濃縮干燥，加入1 mL甲醇，真空旋干，重復此操作5次以除盡三氟乙酸。分別向酸降解產物及5 mg單糖標品（甘露糖，鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，肌醇和巖藻糖）中加入30 mg鈉硼氫化鈉（NaBH4）和2 mL蒸餾水，室溫充分反應1.5 h，向反應液滴加冰醋酸以除盡多余的NaBH4，混合溶液經真空濃縮干燥，加入2 mL 0.1%（v/v）鹽酸甲醇溶液，振蕩混合，真空濃縮干燥，共重復4次。干燥后，向混合物中分別加入0.5 mL吡啶和0.5 mL乙酸酐，封管，105 ℃的烘箱中反應1 h，得糖醇乙酰乙酯衍生化產物。將衍生化產物過0.22 μm濾膜后進行氣相色譜（GC）分析。色譜條件：進樣量5 μL，分流比10:1。氣相色譜柱為 Cat No.C-07-004，OV-1701柱型（30 m×0.5 m×0.32 mm）；氫離子火焰檢測器，檢測器溫度250 ℃。載氣為高純氮氣（99.999%）。升溫程序：初始溫度150 ℃，維持1 min，10 ℃/min升溫至200 ℃，維持10 min，5 ℃/min升溫至220 ℃，維持5 min，1.5 ℃/min升溫至終溫240 ℃，并保留20 min。

1.2.7.3 海參腸多糖熱重分析 精確稱取3 mg海參腸多糖于鋁制坩堝中。加熱溫度范圍為30～800 ℃，升溫速率為10 ℃/min，壓力保持在10 kPa[21]。

1.2.7.4 海參腸多糖掃描電鏡分析 將干燥后的海參腸多糖粘附于樣品臺上，后置于離子濺射儀中鍍金，在5.0 kV的加速電壓下通過掃描電子顯微鏡進行觀察，在不同放大倍數（500×、1000×和2000×）下觀察海參腸多糖，獲取多糖電鏡照片[22]。

1.3 數據處理

所有測定指標均作3次平行處理，結果以平均值±標準差表示。實驗數據用Design-Expert DX10 software軟件進行分析，數據分析采用Origin 9.2軟件。方差分析采用（one-way AVONA）進行顯著性檢驗，顯著水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 海參腸組分分析結果

用于本研究的海參腸原料預處理后脂肪、蛋白質、多糖、水分和灰分含量如表2所示。結果表明海參腸中蛋白質含量極高，多糖含量相對較高，海參廢棄物具有良好的營養價值。

表2 海參腸原料組分（%）Table 2 Ingredients of sea cucumber intestines raw material (%)

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 提取時間對海參腸多糖得率的影響 如圖1所示，海參腸多糖得率在0.5～1 h范圍內，隨著時間的增加而增加。當提取時間為1 h時，海參腸多糖得率最高，達到4.41%，隨后開始下降。起初由于時間不足，多糖提取未完全。隨后多糖得率增加可能是由于熱水浸提破壞細胞壁，多糖大量釋放，但隨著提取時間繼續增加，多糖得率增加不明顯，同時增加能耗[23]。因此，提取時間1 h海參腸多糖得率最大。張睿聰[24]利用堿提法提取海參多糖，最佳提取時間為1 h。

圖1 提取時間對海參腸多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the yield of sea cucumber intestines polysaccharide

2.2.2 提取溫度對海參腸多糖得率的影響 如圖2所示，在溫度60～80 ℃范圍內，隨著溫度的增加，海參腸多糖得率升高并在80 ℃時達到最大值。多糖得率的增加可能是由于分子運動加速，海參腸多糖的電導率升高而引起的[18]。此外，海參腸多糖在溶液中的溶解度和擴散性隨著溫度的升高而增加。溫度超過80 ℃時，多糖得率略有下降，過高的提取溫度不僅增加能耗，還可能會破壞多糖的結構[25]。朱啟源[26]利用熱水法提取蛋白酶酶解后的海參肉糜多糖，最佳溫度為105 ℃，與本研究略有差異。高溫提取能夠間接使酶失活，減小酶對多糖得率的影響。

圖2 提取溫度對海參腸多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of sea cucumber intestines polysaccharide

2.2.3 提取次數對海參腸多糖得率的影響 如圖3所示，提取次數為1～2次時，海參腸多糖得率隨著次數增加而增加。當提取次數大于2次時，海參腸多糖得率略有下降，可能由于提取次數的增加，多糖的損失也增加。當提取次數為2次時，海參腸多糖得率達到最大。

圖3 提取次數對海參腸多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction times on the yield of sea cucumber intestines polysaccharide

2.2.4 料液比對海參腸多糖得率的影響 料液比對海參腸多糖的影響如圖4所示。隨著料液比的增加，多糖得率逐漸增加。在料液比為1:8（mg/mL）時，得率最大，為4.13%。當料液比超過1:9（mg/mL）時，多糖提率逐漸下降。因此，在海參腸多糖提取過程中，1:8（mg/mL）為最佳料液比。料液比過低，會導致多糖提取不完全，相反，料液比過高也會浪費原料，并增加多糖提取液濃縮分離難度[27]。楊東達[1]利用未干燥海參內臟提取粗多糖時料液比為1:30（g/mL），原料中水分含量對多糖提取料液比具有重要影響。

圖4 料液比對海參腸多糖得率的影響Fig.4 Effect of soild-liquid ratio on the yield of sea cucumber intestines polysaccharide

2.3 響應面試驗設計與結果

實驗設計及結果見表3，回歸模型方差分析見表4。利用Design-Expert DX10 software軟件進行試驗結果分析得到多元回歸方程：Y=4.14+0.35X1+8.63X2+5.13X3+2.32X4-0.03X1X2-0.03X1X3-0.02X1X4-0.45X2X3-0.10X2X4-0.01X3X4-0.03X12-1.38X22-0.26X32-0.05X42，其中R2=0.9443，R2Adj=0.9378，由方差分析可知回歸方程模型極顯著（P＜0.01），說明該模型的可信度水平大于99.90%；失擬項不顯著（P＞0.05），說明此模型與實際擬合較好，實驗方法可靠，所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例較小，因此可以用此回歸方程代替真實實驗點分析實驗結果。同時由海參腸多糖得率的回歸系數檢驗值F的大小可知，在實驗范圍內，各因素對海參腸多糖得率影響的大小順序依次為：X4（料液比）＞X3（提取時間）＞X2（提取次數）＞X1（提取溫度）。

表3 響應面設計及結果Table 3 Design and results of response surface

表4 響應面二次模型多糖得率的方差和回歸系數分析Table 4 Analysis of variance and regression coefficient of polysaccharide yield in response surface quadratic model

2.4 各因素之間的交互作用

提取海參腸多糖各因素間交互作用見圖5。通過響應曲面立體圖可以清晰地看出各因素之間的相互作用對多糖得率的影響作用。

提取溫度和提取時間的交互關系如圖5A所示，等高線圖接近圓形，表明提取溫度和提取時間之間交互作用不明顯并且對多糖提取得率影響不顯著；圖5B顯示了料液比與提取溫度的交互作用，當提取時間和提取次數一定時，等高線圖形狀接近橢圓形，表明料液比和提取溫度之間交互作用對多糖得率影響顯著；在圖5C中，當提取時間和料液比一定時，隨著提取次數和提取溫度的增加，提取次數和提取溫度之間交互作用顯著；由圖5D可知等高線接近圓形，表明料液比和提取時間交互作用不顯著；圖5E所示，等高線圖圖形接近圓形，表明提取次數和料液比的交互關系不顯著；從圖5F中可以看出，交互曲面整體近似拱形曲面，且曲面縱向跨度較大，表明提取次數和提取時間之間交互作用對多糖得率影響顯著。

圖5 料液比、提取溫度、提取時間、提取次數交互作用的等高線和響應面Fig.5 Contour maps and response surface diagrams of solid-liquid ratio, extraction temperature, extraction time and extraction times

經響應面優化后最優條件為：提取溫度81.70 ℃，提取時間1.16 h，料液比1:8.56（mg/mL），提取次數2次，模型預測海參腸多糖提取得率為4.486%。依據實際操作條件，將工藝修正為提取溫度80 ℃，提取次數2次，提取時間1 h，料水比1:8（mg/mL），得到實測多糖得率為4.43%±0.17%。

2.5 海參腸多糖的理化性質分析

2.5.1 海參腸多糖分子量的測定 海參腸多糖的分子量分布如圖6所示。由于海參腸中含有大量蛋白質，為了鑒定海參腸多糖純度，測定水提海參腸多糖中總糖含量和蛋白質含量，結果分別為86.69%±0.32%和6.34%±0.47%，表明絕大部分蛋白質已去除。將海參腸多糖出峰時間代入分子量標準曲線，得出海參腸多糖的平均分子量為4.91×106Da。朱啟源[26]利用酶解法海參內臟中得到兩個組分多糖，分子量分別為1.81×105和2.09×105Da。因此，提取方法的不同對多糖結構具有重要影響。酶解方法在提取多糖的同時，對多糖結構產生破壞，降低多糖分子量。本研究中海參腸多糖多分散性指數（Mw/Mn）為1.017，從其多分散性指標來看，該多糖為均質多糖[22]。

圖6 海參腸多糖液相色譜圖Fig.6 Liquid chromatogram of sea cucumber intestines polysaccharides

2.5.2 單糖組分分析結果 將海參腸多糖的各峰保留時間與單糖標準品的保留時間對比可知，海參腸多糖主要由五種不同的單糖組成，包括甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和巖藻糖（表5、圖7～圖8）。根據峰面積、校正因子及單糖相對分子質量計算海參腸多糖各單糖的摩爾百分比分別為22.3:19.31:11.78:3.22:42.57。從單糖組成來看，海參腸多糖主要由巖藻糖、甘露糖和阿拉伯糖組成，含有部分半乳糖和葡萄糖。目前對海參多糖研究較多的為腸壁多糖，主要由氨基糖醛酸、氨基半乳糖和巖藻糖組成，并包含微量的甘露糖和阿拉伯糖。其中巖藻糖存在α-巖藻糖硫酸酯殘基和β-巖藻糖硫酸酯殘基兩種形式，是一種酸性粘多糖[28-29]。本研究中海參腸多糖組成中含有大量的巖藻糖，符合海參多糖的特征。

表5 單糖組成結果Table 5 Results of monosaccharide composition

圖7 標準單糖氣相色譜圖Fig.7 GC spectrum of the standard monosaccharides

圖8 海參腸多糖氣相色譜圖Fig.8 GC spectrum of sea cucumber intestines polysaccharides

2.5.3 海參腸多糖熱力學性質分析 熱重分析過程中的質量損失及分解溫度如圖9所示。在30～150 ℃的溫度范圍內，海參腸多糖的質量出現損失，這可能是由于失去了自由水和結合水[1]。溫度在200～400 ℃范圍內，質量損失率最大，達到88.42%，這可能是由于多糖的結構發生崩解，從而導致質量損失增加[30]。在海參內臟多糖熱力學實驗中發現多糖熱崩解溫度約為240 ℃，低于本研究多糖結構熱崩解溫度，可能是由于多糖結構與組成的不同導致[1]。

圖9 海參腸多糖熱重分析Fig.9 Thermogravimetric analysis of sea cucumber intestines polysaccharides

2.5.4 海參腸多糖表觀形貌分析 采用掃描電鏡在不同放大倍數下（500×、1000×、2000×）對海參腸多糖的形貌結構進行分析（圖10），結果表明，海參腸多糖表面由橢圓形顆粒組成，但在500×倍數下，顆粒不明顯；1000×和2000×倍數下顆粒聚集。表面由球形顆粒或橢圓形顆粒構成了一個網狀層，這種表面結構為聚合物之間的連接提供了可能[31]。同樣，在放大倍數較大時（5000×），海參內臟多糖也表現出了不規則的球狀結構[1]，與本研究結果相近。

圖10 海參腸多糖掃描電鏡圖Fig.10 SEM image of sea cucumber intestines polysaccharides

3 結論

本文利用熱水提取法提取海參腸多糖，通過單因素實驗和響應面優化得到最佳提取條件為：提取時間1 h、提取溫度80 ℃、提取次數2次、料液比1:8（mg/mL），在此條件下多糖的平均得率為4.43%。由理化性質分析結果可知，海參腸多糖為均質多糖，分子量較大。海參腸多糖主要由五種不同的單糖組成，包括甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和巖藻糖。當加熱到800 ℃時，海參腸多糖的重量損失達到85.46%，且當溫在309 ℃時，海參腸多糖的結構發生崩解。海參腸多糖是由球形顆粒或橢圓形顆粒構成的網狀層，這種表面結構有益于聚合物之間的連接，本研究為海參廢棄物資源利用提供科學基礎和理論依據。