響應面法優化鹿鞭肽酶解工藝及體外補腎健骨活性分析

趙峻露，李春楠，尹馨雪，蘭 夢，張 輝，李晶峰

（長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春 130117）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種全身代謝性骨病，以低骨量和骨組織微結構破壞為其顯著特征[1]。近年來，隨著世界人口老齡化的日益加劇，OP發病率逐年上升，目前已成為中老年人最常見的疾病之一[2-3]。中醫認識OP的歷史由來已久，多將其歸屬為“骨痿”、“骨痹”的范疇。中醫認為腎精虧虛是骨質疏松發生的主要病機，認為“腎藏精，主骨，生髓”，骨為腎所主，腎氣的盛衰影響骨的生長、發育、強盛、衰弱的過程，因此補腎中藥被廣泛應用于骨質疏松的防治[4-5]。

鹿鞭（Penis et Testis Cervi）系鹿科動物梅花鹿、馬鹿的干燥帶睪丸的陰莖，是我國傳統名貴動物藥，具有補腎精、壯腎陽、強腰膝的功效[6]。鹿鞭可以做成藥膳和藥酒，通過食療來改善身體狀況以及加強體質[7]。并且鹿鞭酒擁有悠久歷史，補腎益精效果顯著，在我國廣為流傳[8]。隨著人們對鹿鞭的重視和應用，現今已經形成了與其他珍貴藥材配伍制成復方用于保健食品和產品的市場趨勢[9-10]。鹿鞭具有廣泛的生物活性及藥理作用，其單方或與其他中藥配伍均可發揮強健滋補、補腎壯陽等作用[11-13]。康櫻櫻等[14]研究發現梅花鹿鞭提取物能明顯延長小鼠負重游泳時間，具有明顯的抗疲勞作用。譚興貴等[15]研究3種不同鞭類藥材對腎陽虛動物的壯陽作用，鹿鞭作用效果最好。鹿鞭還含有多種化學成分，其中含有豐富的蛋白、肽類成分[16]。近年來，研究表明動物源生物活性肽具有豐富的生物學活性和極高的可食用安全性，添加此類物質的功能性食品可以用來預防或調節慢性病，具有廣闊的發展前景[17-19]。目前生物活性肽已經成為當下研究的熱點，其常見的提取方法有化學水解法、微生物發酵法、酶解法等[20]。其中酶解法條件溫和，水解程度易調控，制備得到的肽類成分具有高生物活性和低毒副作用的特性，深受研究者的喜愛[21]。然而鹿鞭肽類活性成分研究尚淺，其提取工藝及主要藥理作用更是鮮有研究報道。因此，積極深入地研究鹿鞭活性肽的開發和其藥理作用，對鹿鞭今后在保健食品、醫藥等領域的新應用具有重要意義。

本實驗以梅花鹿鹿鞭為原料，超聲波提取法獲得鹿鞭蛋白，采用堿性蛋白酶酶解，以水解度為指標，單因素實驗結合響應面法優化鹿鞭肽的酶解工藝，并對TM3細胞及MC3T3-E1細胞的相關活性進行研究，在細胞水平上探討鹿鞭肽補腎健骨的作用，為鹿鞭肽的制備工藝以及進一步的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿鹿鞭（干燥品） 吉林省東鰲鹿業科技開發有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；茚三酮 上海三愛思試劑有限公司；小鼠睪丸間質細胞TM3、小鼠成骨細胞 MC3T3-E1 中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；DMEM/F12（1:1）培養基、α-MEM培養基 美國HyClone公司；胎牛血清 美國Gibco公司；Cell Counting Kit-8（CCK8） 北京博奧森；地塞米松 索萊寶；小鼠睪酮ELISA檢測試劑盒、骨鈣素ELISA檢測試劑盒 美國Rad公司；BCA試劑盒 中國碧云天；ALP試劑盒 中國南京建成；其他試劑 均為國產分析純。

METTLER TOLEDO pH計 上海虹益儀器儀表有限公司；KS-250DE超聲波清洗器 潔力美超聲儀器有限公司；DF101-S磁力加熱攪拌器 金壇市水北康輝實驗儀器廠；Alpha 1-2 LDplus冷凍干燥機

德國Christ公司；CKX41倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Model680酶標儀 日本Takara公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿鞭蛋白制備 取鹿鞭干品，砍成2 cm左右小塊，粉碎過20目篩，按料液比1:14（g/mL）溶于水中，于功率300 W下超聲提取1 h[22]，以3600 r/min離心20 min，取上清液過濾，冷凍干燥，即得鹿鞭蛋白凍干粉，備用。

1.2.2 鹿鞭肽酶解工藝 參考王帥等[23]比較不同蛋白酶水解鹿鞭制備活性肽的研究結果，本實驗選用了堿性蛋白酶進行水解。稱取一定量的鹿鞭蛋白凍干粉，按底物濃度1% 加入一定量的蒸餾水，置于恒溫磁力攪拌器中攪拌，調節酶解溫度及pH，加入堿性蛋白酶水解，水解過程中不斷加入1 mol/L NaOH或HCl以維持pH恒定在所需值，水解結束后轉入沸水中煮沸15 min，滅酶，冷卻至室溫，以3600 r/min離心20 min，取上清液冷凍干燥，即得鹿鞭肽凍干粉，備用。

1.2.3 鹿鞭肽酶解工藝優化

1.2.3.1 單因素實驗 實驗選用堿性蛋白酶，以水解度為指標，考察酶解溫度、pH、酶用量和酶解時間4個因素對實驗水解效果的影響。酶解固定條件設為溫度50 ℃、pH9、酶用量1200 U/g、時間5 h，各因素梯度分別為酶解溫度：40、45、50、55、60 ℃；pH：8.5、9.0、9.5、10.0、10.5；酶用量：400、800、1200、1600、2000、2400 U/g；時間：3、4、5、6、7 h。

1.2.3.2 響應面試驗設計 結合單因素實驗結果，按照Box-Behnken試驗設計原理，以水解度為指標，選取酶解溫度、pH、酶用量和酶解時間4個因素為優化對象，進行四因素三水平的響應面試驗設計，采用軟件Design-Expert V12.0.11分析設計，試驗因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 水解度的測定 按照茚三酮比色法[24]測定水解度，得到標準曲線回歸方程：y=1.8327x-0.0163，R2=0.9949，利用標準曲線得到蛋白質量，并按下列公式計算水解度（DH）：

式中：A表示供試品溶液（樣液）中的蛋白質量，mg；W表示稱樣質量，mg；V1表示水解液的總體積，mL；V2表示顯色時所用稀釋液的體積，mL。

1.2.5 鹿鞭肽對TM3細胞存活率和睪酮分泌量的影響

1.2.5.1 細胞培養 將凍存的TM3細胞復蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培養基于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱內培養，當細胞貼壁時，吸去培養液，用PBS洗3次至無漂浮細胞，加入含10%胎牛血清的培養基繼續培養。待細胞長至培養瓶80%～90%時，進行傳代培養，隔2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.5.2 CCK8法測定細胞存活率 以每孔4×103個細胞接種于96孔板，隨機分為空白組、模型組和給藥組，培養24 h，細胞模型組和給藥組加入5 μmol/L過氧化氫[25]造模4 h后，細胞給藥組分別加入終濃度為12.5、25、50、100、200 μg /mL樣品，每組5個復孔，在培養箱中繼續培養24 h后，每孔加入10 μL CCK8試劑，37 ℃避光孵育4 h，在酶標儀450 nm處檢測各組OD值。根據所測得吸光度，計算每組細胞存活率，計算公式如下。

1.2.5.3 睪酮含量測定 TM3細胞給藥培養24 h后，吸取上清液。采用小鼠睪酮ELISA試劑盒檢測睪酮含量，按照說明書操作，于450 nm 測定OD值。

1.2.6 鹿鞭肽對MC3T3-E1細胞存活率和ALP活力、OCN分泌量的影響

1.2.6.1 細胞培養 將凍存的MC3T3-E1細胞復蘇后，用含10%胎牛血清的α-MEM培養基于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱內培養，后續操作同1.2.5.1。

1.2.6.2 CCK8法測定細胞增殖活性存活率 以每孔4×103個細胞接種于96孔板，隨機分為空白組、模型組和給藥組，培養24 h，MC3T3-E1細胞模型組和給藥組加入100 μmol/L地塞米松[26]造模24 h后，后續操作同1.2.5.2。

1.2.6.3 ALP活力測定 MC3T3-E1細胞給藥培養24 h后，棄去培養基至于冰上，PBS洗3次，每個孔中加入200 μL RIPA裂解液，使裂解液覆蓋滿細胞，裂解30 min后，4 ℃條件下12000 r/min離心30 min，取上清液測定蛋白濃度，具體方法按照BCA法蛋白定量試劑盒說明，按ALP試劑盒操作測定ALP活力。

1.2.6.4 OCN含量測定 MC3T3-E1細胞給藥培養24 h后，吸取上清液。采用骨鈣素ELISA試劑盒檢測OCN含量，按照說明書操作，于450 nm測定OD值。

1.3 數據處理

每組實驗分別進行3次獨立的重復實驗，結果取平均值，應用Design Expert 12.0.11對響應面試驗結果進行分析；應用SPSS 22.0軟件進行數據的顯著性分析，計量數據以±s表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 酶解溫度對鹿鞭肽水解度的影響 由圖1可知，隨著酶解溫度的升高，鹿鞭肽水解度先升高后降低，在50 ℃時水解度達到最高值29.95%，顯著高于其他樣品組，表明在50 ℃時堿性蛋白酶的酶活性最好（P＜0.05）。超過50 ℃呈明顯下降趨勢，這是由于溫度繼續升高，蛋白酶結構遭到破壞而導致酶活性降低甚至喪失，從而使酶解效率降低[27]。因此確定酶解溫度45～55 ℃為宜。與賈斌等[28]利用堿性蛋白酶水解鹿尾肽獲得的最適溫度范圍結果一致。

圖1 酶解溫度對水解度的影響Fig.1 Effect of enzymatic temperature on degree of hydrolysis

2.1.2 pH對鹿鞭肽水解度的影響 pH對水解度的影響表現在對酶活性的影響，堿性蛋白酶最適pH范圍在9～11。如圖2所示，隨著pH升高，水解度先升高后顯著降低，pH為9.0時水解度達到最高值30.07%（P＜0.05）。這是由于酶作為蛋白質的一種，其酶促反應速率和pH關系密切，酶具有最適pH，當 pH偏離最適值時會影響酶的天然構象和與底物的解離程度，使酶活性受到抑制甚至失活[29]。汪濤等[30]研究了利用堿性蛋白酶酶解鹿皮蛋白的最適pH，發現pH為9時達到最佳，與本實驗結果一致。因此選擇酶解最適pH范圍8.5～9.5。

圖2 pH對水解度的影響Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.3 酶解時間對鹿鞭肽水解度的影響 由圖3可知，水解度隨著時間延長先升高后降低最后趨于平緩，在反應4 h時水解度達最高值36.24%，發現此時水解度顯著高于其他樣品組（P＜0.05）。郅慧等[31]利用堿性蛋白酶酶解鹿筋膠原蛋白時，酶解時間影響水解度的趨勢與本實驗相似。這是由于當酶解時間較短時，酶與底物反應還不夠充分，此時肽鍵快速斷裂，酶解速率較快，隨著時間的延長，酶與底物結合達到飽和狀態，繼續延長時間會使酶解產物濃度增加，從而產生競爭性抑制作用，酶解反應速率減緩[32]。因此選擇酶解時間3～5 h。

圖3 酶解時間對水解度的影響Fig.3 Effect of enzymatic time on the degree of hydrolysis

2.1.4 酶用量對鹿鞭肽水解度的影響 如圖4所示，隨著酶用量的增加，水解度先升高后降低，當酶用量為1200 U/g時水解度達最高值35.56%，相比于其他酶用量有顯著性差異（P＜0.05）。這與高冷等[33]研究利用堿性蛋白酶酶解鹿血肽的單因素實驗結果相一致，均在1200 U/g時水解度達最高值。這是由于酶量的增加可以提高底物與酶的作用，從而加快酶解速率，當底物已經充分酶解時，繼續增加酶用量體系流動性會變差，從而導致反應速率呈現下降趨勢[31]。因此選擇酶用量800～1600 U/g。

圖4 酶用量對水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面模型的建立與分析 根據單因素實驗結果，選取的響應面試驗因素為酶解溫度（A）、pH（B）、酶用量（C）、酶解時間（D），以水解度（Y）為響應值，根據Box-Behnken中心組合原理，設計試驗優化鹿鞭肽酶解工藝，響應面試驗設計及結果見表2。

運用 Design-Expert 12.0.11軟件對表2的數據進行二次多元回歸分析，得到鹿鞭肽水解度（Y）預測值對自變量A、B、C和D的回歸方程：Y=39.59+0.5083A-4.73B+1.01C-0.3741D-0.9766AB+3.71AC+0.1633AD+1.93BC-3.35BD+2.03CD-3.17A2-4.84B2-5.35C2-3.64D2，方差分析結果見表3。

表2 響應面優化試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significant test and variance analysis for the regression model

從方差分析結果可知，二次多項式回歸模型項極顯著（P＜0.001），失擬項不顯著（P＞0.05），表明試驗誤差小，操作可行，試驗結果與模型擬合度好。由F值可知，各因素的影響大小為B（pH）＞C（時間）＞A（溫度）＞D（酶用量），一次項、二次項及交互項的方差分析顯示，C、BC、CD對Y的影響高度顯著（P＜0.01），B、AC、BD、A2、B2、C2、D2對Y的影響極顯著（P＜0.001）。模型的決定系數R2=0.9790，校正決定系數R2Adj=0.9580，表明由響應面試驗設計所獲得的回歸方程與實際情況擬合較好，可用此模型進行預測及分析[34]。

2.2.2 響應面交互作用分析與優化 利用Design Expert 12.0.11軟件做不同因素間響應曲面圖與等高線圖，響應曲面坡度和等高線的形狀及緊密程度可直觀地反映各因素間交互作用和對響應值的影響程度。響應曲面坡度越陡峭說明研究因素對結果影響越大，等高線呈圓形說明交互作用不顯著[35]。響應曲面圖和等高線圖見圖5。

由圖5響應曲面坡度陡峭程度可知，酶解溫度與酶用量曲面坡度較為平緩，說明二者對水解度影響較弱，pH與酶解時間曲面坡度變化陡峭，說明二者對水解度有顯著影響。由圖5等高線形狀及緊密程度可知，圖5a等高線密集但呈近圓形，圖5c呈圓形，說明AB、AD因素之間交互作用不明顯，圖5b、圖5d、圖5e、圖5f等高線較密集且呈橢圓形，說明AC、BC、BD、CD因素之間交互作用對響應值的影響顯著。

圖5 各因素交互作用的響應曲面和等高線圖Fig.5 Response surfaces and contour plots of factor interactions

2.2.3 驗證實驗 通過軟件Design Expert 12.0.11求解方程，計算得到水解度達到最大值時的最優酶解工藝條件為：酶解溫度51.24 ℃，pH8.71，時間4.12 h，酶用量1301.85 U/g，水解度預測值41.03%。為了便于進行試驗，對該條件進行修正：酶解溫度51 ℃，pH8.7，時間4.1 h，酶用量1300 U/g。該條件下進行三次重復驗證實驗，取平均值，得鹿鞭肽水解度為40.36%±0.22%，與預測值相接近，為鹿鞭蛋白的酶解提供了良好的技術支撐。

2.3 鹿鞭肽對TM3細胞存活率和睪酮分泌量的影響

2.3.1 鹿鞭肽對TM3細胞存活率的影響 當代中醫認為腎陽虛證與性腺軸的功能紊亂密切相關[36]，TM3細胞作為研究雄激素合成與分泌、及生精細胞調控的理想細胞模型，可以真實的模擬藥物對體內雄激素的影響[37]。不同濃度鹿鞭肽對TM3細胞存活率的影響結果見圖6。H2O2誘導TM3細胞的模型組與空白組相比，細胞存活率極顯著下降（P＜0.001），表明TM3細胞腎陽虛模型造模成功。與模型組相比，給藥組在12.5～200 μg/mL質量濃度范圍內均不同程度地促進TM3細胞增殖，且呈現濃度依賴性，在200 μg/mL質量濃度下促進作用最強，存活率達85.97%，與模型組有極顯著差異（P＜0.001）。但在12.5 μg/mL濃度下，給藥組與模型組無顯著影響（P＞0.05）。

圖6 不同濃度鹿鞭肽對TM3細胞存活率的影響（x±s，n=3）Fig.6 Effects of different concentrations of deer whip peptide on the survival rate of TM3 cells（x±s, n=3）

2.3.2 鹿鞭肽對TM3細胞睪酮分泌量的影響 慢性腎病的一個主要影響是由于性腺功能減退引起的睪酮水平降低[38]。TM3細胞是雄性動物合成和分泌睪酮的唯一細胞，而睪酮是維持精子發生和雄性性征不可或缺的激素[39]。通過2.3.1結果可知，在質量濃度為12.5 μg/mL時，鹿鞭肽對TM3細胞無明顯促進作用，故對25～200 μg/mL鹿鞭肽進行睪酮分泌量分析。如圖7所示，與空白組相比，模型組睪酮分泌量極顯著降低（P＜0.001），表明TM3細胞腎陽虛模型造模成功。與模型組相比，給藥組均可不同程度地增加TM3細胞的睪酮分泌量，當質量濃度為50 μg/mL時，睪酮分泌量達到最高，此時分泌量為42.47 ng/mL，極顯著高于模型組（P＜0.001）。

圖7 不同濃度鹿鞭肽對TM3細胞睪酮分泌量的影響（x±s，n=3）Fig.7 Effects of different concentrations of deer whip peptide on the amount of testosterone secreted by TM3 cells（x±s, n=3）

上述結果表明，鹿鞭酶解肽能夠提高TM3細胞存活率以及促進睪酮分泌，并且在質量濃度為50 μg/mL時，鹿鞭肽促進細胞睪酮分泌量達到最多，效果最佳。因此推測鹿鞭肽能夠通過促進睪酮分泌從而影響性腺軸功能，間接調節腎功能，具有一定的補腎活性。

鹿鞭酶解肽促進睪酮分泌的最佳濃度為50 μg/mL，與對細胞存活率的最佳濃度200 μg/mL不一致，推測是因為鹿鞭肽對TM3細胞產生的增殖作用不僅僅是通過促進睪酮分泌來發揮藥效，可能同時通過其它途徑來促進TM3細胞的存活率。

2.4 鹿鞭肽對MC3T3-E1細胞存活率和ALP活力、OCN分泌量的影響

2.4.1 鹿鞭肽對MC3T3-E1細胞存活率的影響 成骨細胞的動態功能失調可導致骨質疏松，MC3T3-E1細胞是成骨樣細胞前體細胞，具有在體外分化成成骨細胞、骨細胞，形成骨結節的能力，是體外研究藥物對成骨細胞活性影響的理想細胞模型[40]。不同濃度鹿鞭肽對MC3T3-E1細胞存活率的影響結果見圖8。地塞米松誘導MC3T3-E1細胞的模型組與空白組相比，細胞存活率極顯著下降（P＜0.001），表明MC3T3-E1細胞骨質疏松模型造模成功。與模型組相比，給藥組在12.5～200 μg/mL質量濃度范圍內均不同程度地促進MC3T3-E1細胞增殖，且呈現濃度依賴性，在200 μg/mL質量濃度下促進作用最強，存活率達106.93%，與模型組有極顯著差異（P＜0.001）。但在12.5 μg/mL濃度下，給藥組與模型組差異不明顯，對MC3T3-E1細胞存活率無顯著影響（P＞0.05）。

圖8 不同濃度鹿鞭肽對MC3T3-E1細胞存活率的影響（x±s，n=3）Fig.8 Effects of different concentrations of deer whip peptideon the survival rate of MC3T3-E1 cells（x±s，n=3）

2.4.2 鹿鞭肽對MC3T3-E1細胞ALP活力的影響

ALP是成骨細胞骨形成和分化的標志，在骨礦鹽沉積以及骨鈣化過程中比較重要，是成骨細胞的敏感指標[41]。通過2.4.1結果可知，鹿鞭肽在12.5 μg/mL時促進MC3T3-E1細胞增殖作用不顯著，因此對25～200 μg/mL質量濃度的鹿鞭肽進行ALP活力測定。見圖9，與空白組相比，模型組ALP活力極顯著降低（P＜0.001），表明MC3T3-E1細胞骨質疏松模型造模成功。與模型組相比，各濃度給藥組均可極顯著提高MC3T3-E1細胞ALP活力（P＜0.001），在質量濃度為50 μg/mL時，ALP活力最強，達到6.80金氏單位/g prot。

圖9 不同濃度鹿鞭肽對MC3T3-E1細胞ALP活力的影響（x±s，n=3）Fig.9 Effects of different concentrations of deer whip peptide on ALP viability in MC3T3-E1 cells（x±s，n=3）

2.4.3 鹿鞭肽對MC3T3-E1細胞OCN分泌量的影響 OCN是成骨細胞分化階段的晚期指標，在骨細胞外基質中對羥磷灰石的沉積和結合起著重要的作用[42]。通過2.4.1結果可知，在質量濃度為12.5 μg/mL時，鹿鞭肽對MC3T3-E1細胞無明顯促進作用，故對25～200 μg/mL鹿鞭肽進行OCN分泌量分析。如圖10所示，與空白組相比，模型組OCN分泌量高度顯著降低（P＜0.01），表明MC3T3-E1細胞骨質疏松模型造模成功。與模型組相比，給藥組均可不同程度地增加MC3T3-E1細胞OCN分泌量，當質量濃度達到50 μg/mL時，OCN分泌量達到最高，此時分泌量為15.63 ng/mL，極顯著高于模型組（P＜0.001）。

圖10 不同濃度鹿鞭肽對MC3T3-E1細胞OCN分泌量的影響（x±s，n=3）Fig.10 Effects of different concentrations of deer whip peptide on the amount of OCN secretion in MC3T3-E1 cells（x±s，n=3）

上述結果表明，鹿鞭酶解肽能夠提高MC3T3-E1細胞存活率，并且可以有效地提高ALP活性以及促進OCN的分泌，進一步增強了成骨細胞的礦化活動，說明鹿鞭肽在成骨分化的早期以及晚期均起到了促進作用，具有一定的健骨活性。

鹿鞭酶解肽在質量濃度為50 μg/mL時，ALP活力以及OCN分泌達到最佳效果，與細胞存活率達最佳效果時濃度為200 μg/mL不一致，推測鹿鞭肽提高MC3T3-E1細胞的存活率不單純是通過ALP活性以及OCN分泌來發揮藥效，可能還通過其它途徑協同作用。

3 結論

本研究以梅花鹿鹿鞭為原料，超聲波法提取鹿鞭蛋白，并采用堿性蛋白酶酶解法制備鹿鞭肽，在單因素實驗的基礎上，結合響應面分析法對酶解條件進行優化，最終得到最佳酶解工藝條件為溫度51 ℃，pH8.7，時間4.1 h，酶用量1300 U/g，此時水解度為40.36%±0.22%，與響應面試驗預測值相近，具有實際應用價值，為鹿鞭肽的工業制備提供了理論基礎。

通過體外構建TM3細胞腎陽虛模型和MC3T3-E1細胞骨質疏松模型，分別從“補腎”和“健骨”兩個方面探究鹿鞭肽的潛在活性。結果表明，在補腎方面，與模型組相比，不同濃度的鹿鞭肽均能提高TM3細胞存活率，且呈濃度依賴性。給藥后的TM3細胞上清液中睪酮含量顯著增加（P＜0.05），在質量濃度為50 μg/mL時，睪酮分泌量達最高值42.47 ng/mL，證明鹿鞭肽的補腎作用與睪酮的分泌密切相關，驗證了鹿鞭肽具有一定的補腎活性，但鹿鞭肽的補腎活性不僅是通過睪酮的分泌發揮效果，推測可能同時通過其它途徑來促進TM3細胞增殖；在健骨方面，與模型組相比，鹿鞭肽能顯著提高MC3T3-E1細胞存活率及ALP活力、OCN分泌量，在質量濃度為50 μg/mL時，ALP活力和OCN分泌量達最高值，證明鹿鞭肽的健骨作用與ALP活力和OCN的分泌密切相關，進一步驗證了鹿鞭肽具有一定的健骨作用，但鹿鞭肽的健骨活性也不單純是通過ALP活力以及OCN的分泌來發揮作用，推測可能通過其它途徑協同來提高MC3T3-E1細胞存活率。綜上所述，初步驗證了鹿鞭肽具有良好的補腎健骨活性，具有潛在治療骨質疏松癥的能力，為以后鹿鞭產品在保健食品、醫藥等領域的開發應用提供新思路。其具體的作用機制和體內實驗還有待進一步研究。