山楂多酚微膠囊制備及理化性質分析

余金橙，王淑玉，崔 楠，劉素穩,, ，李淑英，徐永平，常學東

（1.河北科技師范學院食品科技學院，河北省燕山農業特色產業技術研究院，河北秦皇島 066000；2.河北省燕山特色果品加工技術創新中心，河北承德 067000；3.大連賽姆生物工程技術有限公司，遼寧大連 116000）

山楂（Crataegus pinnatifida）屬薔薇科植物，季節性果實，具有良好的經濟屬性[1]。山楂果實富含多酚類物質，具有多種藥用功效，如抗氧化、調解血糖、血脂、抗輻射、抗癌等[2-3]。研究表明，山楂多酚的強抗氧化性是其發揮多種藥理學功能的重要原因[4]。然而，多酚由于活潑的酚羥基結構易受到光、熱、氧、pH等不良環境條件影響[5]，限制了其在食品加工中的商業化應用。提高山楂多酚穩定性成為實現其在食品加工中應用的重要研究方向。目前可通過微膠囊化、分子包埋[6]、化學改性（如糖基化、羥基化和酰基化等）、納米技術[7]等方式改善穩定性[8]。

微膠囊技術是降低生物活性成分損失，提高穩定性的常用方法及有效手段[9]。微膠囊制備方法多樣，常見的有噴霧干燥法、冷凍干燥法、界面聚合和酵母微膠囊法等[10]，噴霧干燥法由于具操作簡便、效率高和生產易控等優勢成為常用的微膠囊化方法被用于商業化連續生產[11]。噴霧干燥茶多酚微膠囊具有較高的熱穩定性[12]，對比銳孔浴法和噴霧干燥法也得出噴霧干燥蘋果渣多酚微膠囊具備更高的穩定性[13]等。因此，本研究的目的是通過噴霧干燥法制備山楂多酚微膠囊，優化山楂多酚微膠囊的制備工藝，對微膠囊進行表征，分析微膠囊化前后抗氧化性和穩定性變化，為提高山楂多酚穩定性以及在食品工業應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮燕瓤紅山楂 采購于河北承德寬城縣，收獲日期2020年9月20日，八成熟，去除田間熱后貯藏于-20 ℃；乳清分離蛋白 食品級，廊坊納科新材料技術有限公司；β-環糊精（β-CD） 食品級，河南萬邦實業有限公司；阿拉伯膠 食品級，天津市風船化學試劑科技有限公司；無水乙醇 分析級，天津歐博凱化有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）

分析級，西亞化學科技有限公司；過氧化氫 分析級，河南正商科技有限公司；水楊酸 分析級，鄭州雙辰商貿有限公司；Folin-Ciocalteu試劑 分析級，國藥集團化學試劑有限公司。

SD-06噴霧干燥儀 嘉盛（香港）科技有限公司；S-3400N型電子掃描電鏡 日立高新技術（上海）國際貿易有限公司；LA-920型粒度儀 日本Horiba公司；Great 20型傅里葉紅外變換光譜儀 中科瑞捷（天津）科技有限公司；NETZSCH STA 449 F3型熱重分析儀 Germany Bruck；US-1500CS型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；N-1100型旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司；800D電動離心機 鄭州長城科工貿有限公司；GNP-9080恒溫培養箱 無錫瑪瑞特科技有限公司；HHS-2S恒溫水浴鍋 海宜昌儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山楂多酚提取物的制備 參照Liu等[14]的研究方法。山楂去核，打漿，加入70%酸化乙醇，30 ℃攪拌提取，抽濾后真空蒸發，AB-8大孔樹脂吸附后，蒸餾水洗去多余雜質后用酸化乙醇洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥成粉末，-18 ℃避光貯藏備用。

1.2.2 山楂多酚微膠囊的制備 參照Sharayei等[15]的方法，稍作修改。分別配制8%β-環糊精、8%乳清分離蛋白、1%的阿拉伯膠和4%的山楂多酚溶液，三種壁材溶液按照1:1:1的比例混合，與多酚溶液按照不同芯壁比（v/v）（1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7），用磁力攪拌器在不同時間下進行攪拌乳化處理（5、10、15、20、25、30 min）。設置不同的進風溫度（160、165、170、175、180、185 ℃），固定兩個變量（分別固定芯壁比為1:3、進風溫度為170 ℃、乳化時間為10 min），改變一個變量進行噴霧干燥得到的粉末即為山楂多酚微膠囊。

1.2.3 包埋率和載藥量的測定 多酚測定參考林倩等的研究方法[16]，稍作修改。稱取5 mg沒食子酸于50 mL燒杯中，蒸餾水溶解定容，配成0.1 mg/mL標準液，取0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL沒食子酸標液加入容量瓶，再加入福林酚試劑、Na2CO3溶液定容，用蒸餾水代替樣液作為空白對照，反應1 h。760 nm波長處測吸光度，以沒食子酸濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線方程為y=0.1223x+0.0083（R2=0.9993）。

微膠囊溶于水，不溶于乙醇。稱取0.05 g山楂多酚微膠囊兩份，一份用于表面游離多酚的測定，一份用于微膠囊總多酚的測定，分別加入相同體積（5 mL）的無水乙醇和蒸餾水，加入無水乙醇的樣品在1790×g下離心10 min，取上清液0.1 mL按上述多酚測定方法進行測定，即為表面游離多酚，溶解于水中樣品即為微膠囊總多酚含量。微膠囊總多酚與表面游離多酚之差即為微膠囊內多酚含量，在760 nm波長處測定吸光度值并計算包埋率和載藥量。包埋率和載藥量計算公式如下[17]：

式中：W1為微膠囊表面游離多酚含量，μg/mL；W為微膠囊總多酚含量，μg/mL；M0為微膠囊內多酚質量，g；M：微膠囊總質量，g。

1.2.4 響應面優化試驗 根據單因素實驗結果設計響應面因素水平，進行參數優化實驗。以包埋率和載藥量為評價指標確定最優制備參數，因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗的因素與水平設計Table 1 Factors and horizontal design of response surface test

1.2.5 粒徑的測定 取適量的微膠囊于燒杯中，以無水乙醇為分散劑，吸取5.0 mL、0.1 g/mL的微膠囊溶液于激光粒度儀測量槽中，樣品折射率為1.5，轉速為2500 r/min，激光粒度分析儀測定微膠囊平均粒徑大小[18]。

1.2.6 微膠囊微觀表面形態觀察 取0.5 mg山楂多酚微膠囊用導電膠固定在樣品臺上，15 mA噴金處理5 min，置于掃描電子顯微鏡樣品室中，在15 kV掃描電鏡觀察微膠囊表觀形態[19]。

1.2.7 抗氧化實驗

1.2.7.1 清除DPPH自由基 參考Ngombe等[20]方法，稍作修改。配制0.1 mmol/L DPPH溶液，1 mg/L山楂多酚溶液、山楂多酚微膠囊溶液和VC溶液。一定量的樣品溶液加入3 mL DPPH溶液，517 nm處測吸光度As；無水乙醇加入DPPH溶液做對照，測吸光度Ac；無水乙醇加入樣品溶液做空白，測吸光度Ab，反應15 min，以同樣方法測VC作為陽性對照。根據以下公式計算清除率：

1.2.7.2 清除羥基自由基 參考Shen等[21]方法，稍作修改。在比色管中依次加入一定量1 mg/mL樣品溶液、10 mmol/L的FeSO4溶液1 mL、8.8 mmol/L的H2O2溶液1 mL、10 mmol/L水楊酸溶液1 mL，37 ℃反應30 min，以蒸餾水作參比，在510 nm波長處測吸光度Ai，同時做不加顯色劑的樣品空白測吸光度Aj，以蒸餾水代替不同濃度的樣品溶液測吸光度Ao。每個濃度梯度做3個平行樣，取平均值；以同樣方法測VC作為對照。

1.2.7.3 清除超氧陰離子自由基 參考Liu等[22]的方法，稍作修改。取4.5 mL pH=8.2 Tris-HCl緩沖液，分別加入一定量的樣品溶液（50 mg/mL），25 ℃保溫20 min，加入鄰苯三酚（50 mmol/L稀釋10倍）0.2 mL，320 nm測吸光度Ai；同時用蒸餾水代替樣液作空白對照，5 min后測吸光度A0；以同樣的方法測定VC作為對照。

1.2.8 微膠囊穩定性的測定 參照Li等[6]的方法，稍作修改。

1.2.9 光穩定性 各取0.50 g山楂多酚和山楂多酚微膠囊于錐形瓶中，第一組在自然光下靜置保存，第二組于完全避光的環境靜置，測定760 nm吸光度，24 h測一次，共測10 d。光穩定性以多酚保留率表示，保留率計算方式如下：

1.2.10 熱穩定性 各取0.50 g山楂多酚和山楂多酚微膠囊于錐形瓶中，放在不同溫度（25、40、60、80 ℃）下水浴60 min，測定760 nm吸光度。熱穩定性以多酚保留率表示，保留率計算方式見1.2.9。

1.2.11 貯藏穩定性 各取0.50 g山楂多酚和山楂多酚微膠囊，分別采用真空包裝和無包裝條件下貯藏28 d，分別取0、7、14、21和28 d分析二者的保留率。保留率計算方式見1.2.9。

1.2.12 體外模擬胃腸道消化 各取0.50 g山楂多酚和山楂多酚微膠囊于錐形瓶中，加入100 mL人工胃液（在1000 mL 模擬胃液中，胃蛋白酶3.2 g，NaCl 2.0 g，HCl調pH至1.2）；在37 ℃ 180 r/min恒溫水浴振蕩器中釋放2 h，分別在0.5、1和2 h取樣品1mL，在8000 r/min轉速下離心10 min，取上清液檢測溶液中多酚含量[23]，每次取后并補充等體積的胃液。調節樣品pH至6.8終止胃液消化，加入腸液（在1000 mL模擬腸液中，胰蛋白酶10.0 g，磷酸二氫鉀6.8 g，NaOH調pH至6.8）100 mL進行6 h的消化實驗，分別在1、2、3、4、5和6 h進行上述離心操作，取上清液檢測溶液中多酚釋放情況[24]，每次取后并補充等體積的腸液。釋放率計算公式如下：

其中：Wt為每個時間點測得的山楂多酚累計釋放量，μg/mL；t為體外釋放時間，h；W0為初始山楂多酚含量，μg/mL。

1.3 數據處理

每組實驗設置三組平行，取平均值，結果用“平均值±標準偏差”表示。用SPSS22.0進行Duncan’s多重差異分析試驗數據的顯著性，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

山楂多酚微膠囊化單因素結果如圖1所示。在1:2～1:7范圍內，評估芯壁比對山楂多酚微膠囊包埋率和載藥量的影響，包埋率隨壁材溶液添加量增加逐漸增大，載藥量呈下降趨勢。當芯壁比為1:3時，微膠囊包埋率為85.28%，載藥量為16.24%（圖1A）。芯壁比較小時，成膜速度較快，不容易破裂，包埋率上升。若芯壁比越大，載藥量就越小，生產成本增加[25]。

圖1 單因素實驗結果Fig.1 Results of single factor experiments

乳化時間10 min時，微膠囊包埋率為94.38%，載藥量為17.98%。5～10 min內包埋率和載藥量呈上升趨勢，延長乳化時間，包埋率降低（圖1B）。可能是因為乳化時間越長，可能會導致芯材黏壁現象，也可能是乳化時間過長導致芯材流出，從而使包埋率降低[26]；乳化時間分別為5 min和15 min時，包埋率和載藥量無顯著性差異（P＞0.05）。

進風溫度在160～185 ℃之間，微膠囊包埋率在90%以上，載藥量在17%以上。進風溫度為165 ℃時，微膠囊包埋率和載藥量分別為98.81%和18.82%，進風溫度在165～175 ℃之間，包埋率變化不顯著（P＞0.05）（圖1C）。進風溫度在180 ℃時，可能原因為溫度過高，水分過度蒸發導致微膠囊破裂或者微膠囊表面快速皺縮，影響包埋率和載藥量[27]。但溫度過低會產生霧珠，出現黏壁現象，影響微膠囊的包埋率和載藥量。綜上所述，分別選擇芯壁比為1:3、乳化時間為10 min、進風溫度為165 ℃進行三因素三水平的參數優化實驗。

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 包埋率、載藥量回歸方程的建立及顯著性分析 響應面試驗結果見表2。使用響應面軟件以包埋率、載藥量作為響應值，得到如下公式：

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface analysis

響應面回歸方程方差分析見表3。

表3 響應面回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface regression equation

方差分析可知，試驗模型P＜0.0001，說明模型顯著；模型包埋率的確定系數R2=0.9978，R2Adj=0.9950；載藥量的確定系數R2=0.9983，R2Adj=0.9962，說明該模型能夠解釋99.00%以上響應值的變化，失擬項＞0.05，表明模型具有顯著性。可以用來預測山楂多酚微膠囊的包埋率和載藥量。由表3可知芯壁比的一次項、二次項和乳化時間的二次項對包埋率和載藥量影響極顯著（P＜0.01），其余均不顯著。各項單因素對包埋率和載藥量的影響順序均為：芯壁比＞乳化時間＞進風溫度。根據表3交互項顯著性檢驗分析可知，AB、AC、BC的交互項，P＞0.05。曲面越陡表示兩因素的交互作用顯著，圖2中交互作用曲面圖不陡，結合圖2和表3可知各因素交互作用對包埋率和載藥量不顯著，各因素交互作用響應面圖如圖2所示。

圖2 各因素交互作用對包埋率、載藥量響應面圖Fig.2 Response surface map of interaction of various factors on entrapment rate and drug loading

2.2.2 驗證實驗 利用響應面軟件中的Box-Behnken設計，對包埋率和載藥量進行優化分析。通過回歸方程分析，得到山楂多酚微膠囊的最佳工藝參數：芯壁比為1:2.948，進風溫度為165℃，乳化時間為11.381 min。考慮實際操作問題，以芯壁比1:3，進風溫度165 ℃，乳化時間11.4 min，進行驗證，得出微膠囊實際包埋率為94.45%±1.03%，預測值為89.50%；微膠囊的實際載藥量為17.99%±0.20%，預測值為17.27%。實測值和預測值相差不大，表明模型可靠性好。

2.3 微膠囊粒徑測定

微膠囊的粒徑范圍為5～200 μm[28]，微膠囊粒徑分布與包埋效果有關，在微膠囊的粒徑分布范圍內，若粒徑過大，表明包埋效果不好，芯材的保留率會變低[29]；粒徑越小，表明微膠囊芯材釋放效果越佳，越利于人體腸道吸收利用。由圖3可知，在最優條件下制備的山楂多酚微膠囊粒徑分布在1.5～20 μm之間，平均粒徑為6.77 μm，50%微膠囊粒徑為6.44 μm，10%粒徑為3.79 μm，90%粒徑為10.09 μm，粒徑呈正態分布，說明最優條件下微膠囊的粒徑大小分布均勻。

圖3 微膠囊粒徑分析圖Fig.3 Microcapsule particle size analysis

2.4 微膠囊微觀形貌觀察

掃描電鏡可以更好地觀察微膠囊的表面微觀結構。由圖4可知，β-環糊精、阿拉伯膠、乳清分離蛋白與山楂多酚a，b，c，d呈塊狀，β-環糊精表面粗糙；阿拉伯膠、乳清分離蛋白與山楂多酚表面光滑，可能與材料本身的性質有關。在最優工藝條件下，噴霧干燥法制得的山楂多酚微膠囊（圖4e、圖4f）顆粒完整，近似球形，分散性好，無粘結情況。部分微膠囊表面出現褶皺或凹陷，可能是在噴霧干燥過程中，高溫導致的水分揮發不均勻導致[30]。微膠囊的表面出現褶皺但無破裂的情況，仍保持一定的形狀，說明該壁材具有強支撐性，對芯材具有很好的保護作用。喬絢[31]利用噴霧干燥法制備茶粉微膠囊，結果也表明微膠囊近似球形，表面有褶皺但無破裂現象，和本實驗結果一致。

圖4 微膠囊掃描電鏡圖Fig.4 Sem image of microcapsules

2.5 抗氧化性實驗

2.5.1 微膠囊抗氧化能力分析 隨著濃度的升高，多酚和微膠囊清除率也升高。在同等濃度條件下，微膠囊清除DPPH自由基的能力優于山楂多酚（圖5A），從圖中可以看出微膠囊化后對DPPH自由基的清除能力提高了0.50%～65.34%。山楂多酚清除DPPH自由基IC50為12.669 μg/mL，微膠囊IC50為0.939 μg/mL。結合圖5A可以看出，微膠囊清除DPPH自由基的能力優于山楂多酚，原因可能與微膠囊粒徑有關，粒徑越小，越有利于微膠囊中抗氧化物質的釋放[32]。以VC作為對照可看出其清除DPPH自由基的能力變化不顯著；Silva等[33]采用噴霧干燥法制備巴西樹葡萄花色苷微膠囊，檢測DPPH抗氧化活性，結果表明微膠囊化后花色苷具有更強的抗氧化能力，所得結果與本文相似。

隨著多酚和微膠囊濃度增加，清除羥基自由基的能力增強，山楂多酚清除羥基自由基的能力變化顯著，而微膠囊清除能力變化曲線較平緩。在同等濃度條件下，微膠囊清除羥基自由基的能力優于山楂多酚。從圖5B中可以看出微膠囊化后對羥基自由基的清除能力提高了4.03%～49.32%，山楂多酚清除羥基自由基IC50為1.131 mg/mL，山楂多酚微膠囊IC50為0.129 mg/mL。以VC作為對照可看出其清除羥基自由基的能力變化不顯著。鄭虎哲等[34]研究了蘋果多酚微膠囊的羥基自由基清除率，發現微膠囊化后抗氧化性更高，和本實驗的結果一致，原因可能為微膠囊有更高的水溶解性，在水中能夠釋放出大量山楂多酚導致抗氧化能力增強[35]。

隨著濃度的增加，山楂多酚和微膠囊的清除率都呈現明顯的上升趨勢，在同等濃度下，微膠囊清除超氧陰離子自由基的能力優于山楂多酚（圖5C），從圖5C中可以看出微膠囊化后對超氧陰離子的清除能力提高了2.09%～7.45%。在濃度大于0.63 mg/mL時，VC對超氧陰離子的清除率低于山楂多酚和微膠囊。山楂多酚清除超氧陰離子自由基IC50為0.581 mg/mL，微膠囊的IC50為0.546 mg/mL，原因可能為壁材中的乳清分離蛋白具有一定的抗氧化作用[36]，加之微膠囊水溶性較好，因此表現出優于山楂多酚的超氧陰離子自由基清除率。以VC作為對照可看出其清除超氧陰離子自由基的能力變化顯著。鄭虎哲等[34]的蘋果多酚微膠囊也表現出更出色的超氧陰離子自由基清除率。

圖5 微膠囊對各類自由基清除率的影響Fig.5 Effects of microcapsules on scavenging rate of various free radicals

2.6 微膠囊穩定性測定

避光條件和光照條件下的山楂多酚微膠囊的保留率均高于山楂多酚（圖6A），光照條件下貯藏至第10 d，山楂多酚的保留率為64.99%，而山楂多酚微膠囊的保留率為86.74%；與光照山楂多酚微膠囊對比，避光條件下的微膠囊中多酚保留率較高；與光照山楂多酚相比，山楂多酚微膠囊具有更高的保留率，原因為壁材在一定程度上阻礙了光對芯材的分解作用[37]。Aizpurua-Olaizola等[38]分析了葡萄多酚的光穩定性，得出在避光條件下，多酚微膠囊的穩定性更強，和本實驗結果類似。因此，避光條件更利于山楂多酚微膠囊的貯存，微膠囊化處理也有利于提高山楂多酚的穩定性。

在不同溫度條件下，山楂多酚微膠囊的保留率均高于山楂多酚（圖6B），隨著溫度的上升，二者的保留率均下降，在80 ℃時，多酚保留率僅為70.77%，而山楂多酚微膠囊的保留率為88.77%，與未微膠囊化的山楂多酚相比，微膠囊化后其保留率提高了18.00%。與未微膠囊化山楂多酚相比，微膠囊化技術能夠提高山楂多酚的熱穩定性，原因可能為山楂多酚微膠囊擁有穩定的結構以及微膠囊化技術提高了山楂多酚微膠囊的失重溫度導致[12]。Wang等[39]對比了微膠囊化前后茶多酚的熱穩定性，所得結果和本實驗類似的結果。因此，微膠囊化處理也有利于提高山楂多酚的熱穩定性。

采用真空包裝和無包裝的形式對山楂多酚和山楂多酚微膠囊進行貯藏穩定性的評價，山楂多酚微膠囊的穩定性都優于山楂多酚，真空包裝的貯藏效果優于無包裝（圖6C），在貯藏28 d后，真空包裝的山楂多酚和山楂多酚微膠囊的保留率分別為90.02%和97.17%，無包裝的山楂多酚和山楂微膠囊的保留率分別為73.48%和91.15%，與無包裝的山楂多酚和山楂多酚微膠囊相比，真空包裝后二者的保留率分別提高了16.54%和6.02%，原因為在膠囊化過程中芯材得到壁材很好的保護，且真空包裝阻礙了山楂多酚和山楂多酚微膠囊與外界環境的接觸，阻止其氧化變質[40]。以上結果表明微膠囊化能提高山楂多酚的貯藏穩定性。廖霞等[24]研究了槲皮素微膠囊的穩定性，在貯藏35 d后，微膠囊依然能保持較高的穩定性，所得結果和本文一致。

圖6 不同條件對微膠囊穩定性的影響Fig.6 Effects of different conditions on the stability of microcapsules

2.7 體外模擬消化對微膠囊釋放率的影響

由圖7可知，在模擬胃液階段，山楂多酚和山楂多酚微膠囊的釋放率均較低，原因可能為山楂多酚在胃液中能以較穩定的2-苯基苯并陽離子形式存在，山楂多酚微膠囊由于有壁材的保護作用阻止了胃液對二者的分解[41]；在腸液消化階段，多酚和微膠囊的釋放速率明顯不同，多酚的釋放率急劇上升，在釋放4 h后釋放率達到91.96%，之后達到穩定值；而多酚微膠囊的釋放速率較緩慢，持續釋放6 h后，總計釋放率為72.53%，原因可能為當腸液中的pH較高，山楂多酚分子結構轉化為醌式結構，導致穩定性下降，而山楂多酚由于有壁材的保護作用，可以實現緩慢釋放的效果[41]，說明微膠囊在腸液中較穩定。廖霞等[24]研究也表明相較于槲皮素，槲皮素微膠囊能實現緩慢釋放，更利于吸收。陳忠寶[42]的研究也表明藍靛果多酚微膠囊在腸液中具有緩慢釋放的效果。

圖7 微膠囊在模擬胃腸液中的釋放率Fig.7 Release rate of microcapsules in simulated gastroenteric fluid

3 結論

采用噴霧干燥法制備了山楂多酚微膠囊，以包埋率和載藥量為評價指標，進行了響應面優化實驗，得到最佳工藝參數芯壁比為1:3（v/v），進風溫度為165 ℃，乳化時間為11.4 min，得到微膠囊包埋率為94.45%±1.033%，載藥量為17.99%±0.197%；優化后微膠囊的平均粒徑為6.77 μm，微膠囊微觀結構近似球形。微膠囊化后多酚的穩定性和抗氧化性得到顯著改善，表明微膠囊化可以改善山楂多酚的穩定性，可為山楂多酚的精深加工提供參考依據。

目前微膠囊化技術廣泛用于各種食品配料的遞送。相較于生物醫藥領域，農副業食品對微膠囊顆粒的研究和開發仍然很低。為了使微膠囊化技術更好運用于食物鏈，使食品從生產到消費都能受益，未來仍有多項工作要做，如在確保經濟和規模的同時，還要進一步研究在實際食品生產、貯藏、運輸、銷售等過程中都能保證活性成分的活性等。