蛋清蛋白-β-環(huán)狀糊精復(fù)合物對(duì)小龍蝦蝦仁凍融穩(wěn)定性的影響

張新?tīng)N，李小定

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070）

小龍蝦學(xué)名為克氏原螯蝦（Procambarus clarkia），屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、十足目、蝲蛄科、淡水螯蝦屬[1]。小龍蝦原產(chǎn)于美國(guó)和墨西哥，在20世紀(jì)20年代末經(jīng)日本引入我國(guó)南京[2]，然后逐漸擴(kuò)展流通至長(zhǎng)江中下游地區(qū)，江蘇、安徽、湖北等地為其主要養(yǎng)殖地區(qū)[3]。小龍蝦除了以精美的菜肴形式呈現(xiàn)給消費(fèi)者外，大部分以冷凍整蝦、冷凍蝦仁、凍蝦黃等成品或者半成品出口，主要出口美洲、歐洲等地區(qū)的國(guó)家[4]，為我國(guó)帶來(lái)巨大的社會(huì)效益與經(jīng)濟(jì)效益。但是小龍蝦及其產(chǎn)品大都需要冷鏈運(yùn)輸，所需設(shè)備和儀器成本高、能耗大，并且在運(yùn)輸過(guò)程中會(huì)不可避免的因?yàn)闇囟鹊纳叨诨俅卫鋬鲇謺?huì)使得蝦仁重新結(jié)晶。蝦仁在凍融過(guò)程中重新生成的冰晶，由于其形狀不規(guī)則，顆粒大，會(huì)擠壓肌肉組織導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，汁液外流，質(zhì)地變軟[5]。此外，蝦仁在凍融過(guò)程中蛋白質(zhì)和脂肪的氧化也不容忽視，凍融過(guò)程中，蛋白質(zhì)氧化使得肽鏈展開(kāi)，疏水性氨基酸暴露[6-7]。脂肪分解產(chǎn)生丙二醛等代謝產(chǎn)物也是造成肉制品品質(zhì)下降的重要原因[8]。

雞蛋清中含有豐富的蛋清蛋白（Egg white protein，EWP），由于游離巰基（SH）的存在，EWP可以通過(guò)結(jié)合金屬離子來(lái)調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)[9]。研究表明，在肌原纖維蛋白中添加EWP可抑制其在凍藏過(guò)程中的結(jié)晶、蛋白質(zhì)和疏水相互作用引起的蛋白氧化，還可減少表面疏水性增加引起的結(jié)構(gòu)變化[10]。此外，將蛋清蛋白作為低熱量冷凍保護(hù)劑可以減緩翹嘴鲌肌原纖維蛋白在反復(fù)凍融循環(huán)或長(zhǎng)期冷凍儲(chǔ)存下的氧化、營(yíng)養(yǎng)損失和感官惡化[11]。

β-環(huán)狀糊精（β-cyclodextrin，β-CD）已被報(bào)道為肉類產(chǎn)品中的冷凍保護(hù)劑，可以減少酶活性的損失來(lái)防止蛋白質(zhì)損傷[12]。β-CD中大量的羥基可以與水分子或某些蛋白質(zhì)形成氫鍵，阻止水分子的移動(dòng)，冷凍狀態(tài)下減少冰晶生成并阻止其進(jìn)一步生長(zhǎng)，減少對(duì)產(chǎn)品造成的物理擠壓，進(jìn)而對(duì)產(chǎn)品到保護(hù)作用。β-CD的親水性伯醇羥基全部排列在筒形立體結(jié)構(gòu)的外側(cè)，而疏水基C-H排列在內(nèi)壁，使得β-CD的外側(cè)親水，空穴疏水，鑒于這一獨(dú)特的分子特性，可以與溶劑中暴露的疏水性氨基酸殘基結(jié)合[13]，抑制蛋白質(zhì)的聚集。研究表明，在鲌魚(yú)中添加β-CD可減少魚(yú)肉白度、持水性和硬度的下降幅度，同時(shí)有效抑制了肌肉組織的結(jié)構(gòu)劣化，保護(hù)了內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性[14]。在肌原纖維蛋白中添加β-CD后，羰基含量顯著減小，同時(shí)延緩了巰基含量下降[10]，提高了肌原纖維蛋白凝膠硬度、彈性、膠質(zhì)度和粘結(jié)性以及白度和保水性能[15]。

目前，大多數(shù)研究關(guān)注單一種類的物質(zhì)作為冷凍保護(hù)劑在冷凍儲(chǔ)存期間對(duì)肉制品的影響，例如蔗糖、山梨糖醇、寡糖和多糖。當(dāng)與其他食物的添加劑（蛋清蛋白、多酚等）結(jié)合使用時(shí)，它們作為冷凍保護(hù)劑的冷凍保護(hù)能力可以增強(qiáng)[11]。蛋白與糖類可以通過(guò)兩者的靜電相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使其具有更加穩(wěn)定的性質(zhì)和更廣闊的使用范圍[16]。EWP在加熱時(shí)可形成熔融的球狀蛋白，通過(guò)填充作用提高肉制品的保水性[10]。此外，與糖的共價(jià)鍵可增強(qiáng)EWP的抗氧化性能[15]。因此，本文以EWP和β-CD為原料制備EWP-β-CD復(fù)合抗凍劑，探究EWP-β-CD復(fù)合物對(duì)蝦仁品質(zhì)的保護(hù)作用，以期改善蝦仁在反復(fù)凍融過(guò)程中的品質(zhì)劣變問(wèn)題，為開(kāi)發(fā)綠色健康的抗凍劑提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋清白蛋白（EWP）（純度90%）、β-環(huán)狀糊精（β-CD）（純度99%）、過(guò)氧化氫酶（牛肝BR，2000～5000 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；鮮活小龍蝦（35～40 g/只） 淮安漁夫水產(chǎn)有限公司；牛血清蛋白 廣州賽國(guó)生物科技有限公司；福林酚 北京索萊寶科技有限公司；0.1 mol/L檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液（pH3.0～6.0） 上海澤葉生物科技有限公司、Tris-HCl緩沖液（pH7.0～9.0） 廣州碩譜生物科技有限公司、甘氨酸-HCl緩沖液（pH10.0） 上海滬震實(shí)業(yè)有限公司；其余試劑 均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-1500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司；Multiskan Sky全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 Thermo Scientific；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Avanti JXN-26冷凍離心機(jī)、Allegra 64R冷凍離心機(jī) Beckman Coulter；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀

英國(guó)STABLE MICROSYS公司；DR-410色差儀日本Konica Minolta公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EWP-β-CD復(fù)合物制備工藝優(yōu)化

1.2.1.1 復(fù)合物制備 準(zhǔn)確稱取60 g EWP溶于2000 mL蒸餾水，室溫下磁力攪拌3 h，充分溶解后放入4 ℃冰箱過(guò)夜，得到EWP樣品濃度為0.03 g/mL的儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取6 gβ-CD溶于1000 mL EWP儲(chǔ)備液，使得EWP樣品濃度為0.03 g/mL、β-CD樣品濃度為0.6 g/100 mL，β-CD與EWP的復(fù)合比為1:5。用緩沖液調(diào)節(jié)EWP儲(chǔ)備液、EWP與β-CD的混合溶液pH為7.0，并將所有溶液在70 ℃水浴中加熱3 h，加熱后振蕩樣品并冷卻至室溫，測(cè)定其抗凍活性[17]。

1.2.1.2 抗凍活性的測(cè)定方法 樣品抗凍活性的測(cè)定和過(guò)氧化氫酶活力的測(cè)定參考劉璐的方法略作修改[18]。向100 μL 0.02 mg/mL過(guò)氧化氫酶液中加入50 μL樣品溶液，測(cè)定初始酶活力，然后將該樣品放入-20 ℃冰箱冷凍12 h，取出后37 ℃水浴解凍，測(cè)定解凍后的酶活力。

將1 mL的0.1%過(guò)氧化氫稀釋液和0.1 mL的過(guò)氧化氫酶液混勻，測(cè)定240 nm處的吸光值，靜置10 min后再測(cè)定一次。以10 min內(nèi)240 nm處的吸光值減少0.1為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.1.3 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)預(yù)設(shè)混合溶液pH為7.0，β-CD與EWP的復(fù)合比為1:5和熱處理溫度70 ℃為單因素實(shí)驗(yàn)中的常規(guī)量。以pH（3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0）、β-CD與EWP的復(fù)合比（1:20、1:10、1:5、1:2、1:1）、熱處理溫度（65、70、75、80、85 ℃）3個(gè)因素變量替換試驗(yàn)中的常規(guī)量。按照1.2.1.1方法制備樣品，測(cè)定其抗凍活性，確定單因素的最佳取值范圍。

1.2.1.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以pH（A）、β-CD與EWP的復(fù)合比（B）、熱處理溫度（C）3個(gè)因素為自變量，以抗凍活性為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平編碼表Table 1 Coding table of experimental factors and levels

1.2.2 小龍蝦蝦仁凍融循環(huán)品質(zhì)的測(cè)定

1.2.2.1 蝦仁樣品的制備 將小龍蝦用清水沖洗干凈，去頭、殼、蝦線后得到蝦仁。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果，選擇pH為7.0，β-CD:EWP為1:10，熱處理溫度為75 ℃制備EWP-β-CD復(fù)合物，冷凍干燥后即為EWP-β-CD復(fù)合物。將蝦仁分別用2%、4%、6%的EWP-β-CD復(fù)合物浸泡，并選擇用蒸餾水浸泡作為空白對(duì)照，商業(yè)抗凍劑（4%蔗糖+4%山梨糖醇）浸泡為陽(yáng)性對(duì)照，分別命名為2% EWP-β-CD、4%EWP-β-CD、6% EWP-β-CD，空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照。所有處理組在4 ℃下浸泡6 h，真空包裝，-80 ℃冷凍6 h。-18 ℃冷凍1周，然后4 ℃解凍6 h，此為一次凍融循環(huán)。

1.2.2.2 解凍損失率測(cè)定 參考張樹(shù)峰等[19]的方法略作修改。解凍前將蝦仁稱重M1，4 ℃冰箱中解凍后，用濾紙擦去表面水分后稱重M2，計(jì)算蝦仁解凍損失率。

1.2.2.3 質(zhì)構(gòu)特性分析 參考汪蘭等[20]的方法略作修改。采用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀及其軟件，使用P/36R探頭對(duì)蝦仁背部第二腹節(jié)肌肉進(jìn)行2次壓縮質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）測(cè)試。測(cè)定指標(biāo)包括硬度、咀嚼性、回復(fù)性、彈性和內(nèi)聚性。

TPA參數(shù)：測(cè)量前探頭下降速度3 mm/s，測(cè)試速度0.5 mm/s，測(cè)試后回程速度3 mm/s，測(cè)試距離5 mm，觸發(fā)力5 g，形變50%，兩次壓縮時(shí)間間隔5 s。

1.2.2.4 色差測(cè)定 參考陸云飛等[21]的方法略作修改。用高精度色差儀測(cè)定蝦仁第二腹節(jié)表面的亮度值L*、紅綠值a*、黃藍(lán)值b*，根據(jù)公式計(jì)算白度W。

1.2.2.5 TCA-可溶性肽含量測(cè)定 參考Benjakul等[22]的方法略作修改。稱取2 g處理后的蝦仁，加入預(yù)冷的18 mL 5%的三氯乙酸，冰浴中8000 r/min均質(zhì)2 min，然后4 ℃靜置1 h后再以4 ℃，10000 r/min離心15 min，離心后取上清液1 mL，加入5 mL 0.4 mol/L的Na2CO3溶液，1 mL福林酚，然后40 ℃水浴20 min，680 nm處測(cè)吸光值，對(duì)照酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.01x+0.06，R2=0.999）得到樣品中酪氨酸濃度，最終結(jié)果用μmol酪氨酸/g樣品表示（umol Tyrosine/g Sample）TCA-可溶性肽含量。

式中：x表示樣品中酪氨酸濃度，μg/mL；MTyrosine為181.19 g/mol。

1.2.2.6 脂肪氧化程度分析 參考GB 5009.181-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中丙二醛的測(cè)定》分光光度法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均做三次平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Microsoft excel 2019整理數(shù)據(jù)，Origin 2021軟件作圖，IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異判別標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EWP-β-CD復(fù)合物制備工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 pH對(duì)EWP-β-CD復(fù)合物抗凍活性的影響

過(guò)氧化氫酶在低溫凍藏條件下酶活力會(huì)因?yàn)闇囟鹊慕档投鴾p弱，因此可以用過(guò)氧化氫酶活力的大小表示抗凍活性的大小[18,23]。圖1反映不同pH的EWP和EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性的變化情況。由圖可知，隨著pH的增大，EWP和EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性先增大后減小，當(dāng)pH為7.0時(shí)，兩者的抗凍活性均達(dá)到最大值64.00%和76.61%，且EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性顯著高于EWP（P＜0.05），因此，β-CD的加入可以增強(qiáng)EWP的抗凍活性。研究表明，EWP與β-CD在中性條件下可通過(guò)靜電相互作用形成可溶性復(fù)合物，原因是此時(shí)EWP表面帶有負(fù)電荷，β-CD表面帶有正電荷，正負(fù)電荷會(huì)發(fā)生相互吸引，形成的復(fù)合物同時(shí)改善了EWP和β-CD的功能性質(zhì)，這可能是pH為7.0時(shí)EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性較高的原因[16]。因此，選擇7.0作為pH的較優(yōu)水平。

圖1 不同pH的EWP和EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性變化Fig.1 Changes of antifreeze activity of EWP and EWP-β-CD composite system at different pH

2.1.1.2 復(fù)合比對(duì)EWP-β-CD復(fù)合物抗凍活性的影響 圖2顯示了不同復(fù)合比的EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性變化。隨著β-CD添加量的增加（β-CD與EWP的復(fù)合比由1:20變化到1:10），EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性顯著增加（P＜0.05）。當(dāng)β-CD與EWP的復(fù)合比為1:10時(shí)，EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性最大，比EWP提高了23.43%。隨著復(fù)合比繼續(xù)增加，抗凍活性逐漸減小，當(dāng)β-CD與EWP的復(fù)合比為1:1時(shí)，EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性僅為52.31%，顯著低于EWP（P＜0.05）。隨著β-CD添加量的增加，β-CD所帶的正電荷為EWP表面的負(fù)電荷提供了更多的結(jié)合位點(diǎn)，可以形成更多的EWP-β-CD復(fù)合物，對(duì)過(guò)氧化氫酶的保護(hù)效果增強(qiáng)，從而表現(xiàn)出更高的抗凍活性[16]。因此，選擇1:10作為復(fù)合比的較優(yōu)水平。

圖2 不同復(fù)合比的EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性Fig.2 Antifreeze activity of EWP-β-CD composite system at different composite ratio

2.1.1.3 溫度對(duì)EWP-β-CD復(fù)合物抗凍活性的影響圖3顯示了不同熱處理溫度的EWP和EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性的變化。隨著熱處理溫度的升高，EWP的抗凍活性呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢(shì)，當(dāng)熱處理溫度為75 ℃時(shí)，EWP的抗凍活性為75.51%，顯著高于80 ℃處理的EWP（P＜0.05）。與EWP相比，β-CD的加入顯著提高了EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性（P＜0.05）。隨著溫度的升高，EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性呈先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)熱處理溫度為70 ℃和75 ℃時(shí)，EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性分別為78.54%和81.42%，二者無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。因此，選擇75℃作為溫度的較優(yōu)水平。

圖3 不同熱處理溫度的EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性Fig.3 Antifreeze activity of EWP-β-CD composite system at different heat treatment temperatures

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.1.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 以抗凍活性為響應(yīng)值，選取pH（A）、β-CD與EWP的復(fù)合比（B）和熱處理溫度（C）為主要因素的自變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步優(yōu)化EWP-β-CD復(fù)合物的工藝，試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.2.2 響應(yīng)面回歸模型的方差分析 使用Design Expert 10.0.1軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合與方差分析，得回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Scheme and results of response surface test design

回歸方程方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results of regression equation

經(jīng)分析，該抗凍活性模型的F值為48.77，P＜0.0001，失擬項(xiàng)的F值為1.06，P=0.459＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，模型的R2=0.9641，因此該回歸方程參數(shù)可靠，準(zhǔn)確性高。一次項(xiàng)A、B，二次項(xiàng)A2、B2、C2的影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C的影響顯著（P＜0.05）；交互項(xiàng)影響均不顯著。

2.1.2.3 響應(yīng)面圖分析 分別將模型中的pH、β-CD與EWP的復(fù)合比和熱處理溫度三個(gè)因素中的一個(gè)因素固定在零水平，研究另外兩個(gè)因素的改變和他們之間的相互作用對(duì)EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性影響，得到的子模型結(jié)果分別如圖4～圖6所示，AB、AC和BC的相互作用均不顯著，與方差分析得到的結(jié)果相似。

圖4 pH和β-CD與EWP的復(fù)合比的相互作用對(duì)EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性的影響Fig.4 Effect of interaction between pH and composite ratio of β-CD and EWP on antifreeze activity of EWP-β-CD composite system

圖6 β-CD與EWP的復(fù)合比和處理溫度交互作用對(duì)EWPβ-CD復(fù)合體系抗凍活性的影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Effect of interaction between composite ratio of β-CD and EWP and heat treatment temperature on antifreeze activity of EWP-β-CD composite system

2.1.2.4 工藝參數(shù)的確定 通過(guò)EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性的響應(yīng)面模擬得到EWP-β-CD復(fù)合體系的最佳制備條件和抗凍活性結(jié)果如下：pH為6.8，β-CD與EWP的復(fù)合比為1:8.33，熱處理溫度為73 ℃，此時(shí)EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性可以達(dá)到最大值83.97%。考慮到實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中難以達(dá)到如此高精度和高準(zhǔn)確度的條件，為使EWP-β-CD復(fù)合體系的制備更能廣泛和普遍的應(yīng)用，現(xiàn)將EWP-β-CD復(fù)合體系的最佳制備條件修改成pH7.0，β-CD與EWP的復(fù)合比1:10，熱處理溫度75 ℃。經(jīng)檢驗(yàn)，此時(shí)EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性為84.09%±1.06%，與理論的最大值很接近。此響應(yīng)面法優(yōu)化得到的制備高抗凍活性EWP-β-CD復(fù)合體系的參數(shù)準(zhǔn)確、可靠，可以代替理論值進(jìn)行使用。

圖5 pH和熱處理溫度的相互作用對(duì)EWP-β-CD復(fù)合體系抗凍活性的影響Fig.5 Effect of interaction between pH and heat treatment temperature on antifreeze activity of EWP-β-CD composite system

2.2 EWP-β-CD復(fù)合物對(duì)小龍蝦仁品質(zhì)的影響

2.2.1 蝦仁凍融循環(huán)過(guò)程總解凍損失率的變化 蝦仁的解凍損失（Thawing loss，TL）可反映肌肉組織保持水分的能力[24]。添加不同抗凍劑的蝦仁經(jīng)凍融循環(huán)后，TL如圖7所示。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，所有處理組蝦仁TL均逐漸增大。其中商業(yè)抗凍劑TL值低于其他樣品，表明商業(yè)抗凍劑能更好地保持蝦仁水分。當(dāng)凍融循環(huán)次數(shù)一定時(shí)，隨著EWP-β-CD復(fù)合物添加量的增大，蝦仁TL逐漸減小，表明EWP-β-CD復(fù)合物的添加量為6%時(shí)，更能保持蝦仁水分。

圖7 蝦仁解凍損失率變化Fig.7 Changes of thawing loss rate of shrimp

2.2.2 蝦仁凍融循環(huán)過(guò)程質(zhì)構(gòu)特性分析 添加不同抗凍劑的蝦仁TPA參數(shù)如表4所示。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，蝦仁硬度、咀嚼性、回復(fù)性、彈性、內(nèi)聚性均逐漸減小。這是因?yàn)樵趦鋈谘h(huán)過(guò)程中，在細(xì)胞外形成大冰晶，通過(guò)擠壓對(duì)肉制品造成物理?yè)p傷，同時(shí)蝦仁中脂肪和蛋白質(zhì)的氧化降解破壞了蝦仁肌肉組織原有的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，使得質(zhì)地變軟[25-26]。經(jīng)過(guò)1次凍融循環(huán)后，添加4%和6%的EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁硬度顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），添加6%的EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁咀嚼性顯著高于其他處理組（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)4次凍融循環(huán)后，添加商業(yè)抗凍劑的蝦仁硬度和咀嚼性與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），添加EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁硬度顯著高于空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），添加6%的EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁咀嚼性顯著高于其他處理組（P＜0.05）。這說(shuō)明在凍融循環(huán)期間，添加商業(yè)抗凍劑不能延緩硬度等指標(biāo)的降低，而添加EWP-β-CD復(fù)合物能維持蝦仁硬度和咀嚼性，其添加量為6%時(shí)，對(duì)維持蝦仁內(nèi)部肌肉組織結(jié)構(gòu)的作用最好。

表4 不同處理的蝦仁的TPA參數(shù)Table 4 TPA parameters of shrimp with different treatments

2.2.3 蝦仁凍融循環(huán)過(guò)程色差測(cè)定 色度是衡量蝦仁品質(zhì)的另一項(xiàng)重要指標(biāo)，蝦仁的色度可以直觀地影響消費(fèi)者的可接受程度[21]。添加不同抗凍劑的蝦仁L*值、a*值、b*值和白度（W）如表5所示。由表可知，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，添加EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁的L*值和W無(wú)顯著變化，并且與空白對(duì)照組的L*值和W無(wú)顯著差異（P＞0.05）；同時(shí)凍融3、4次后，添加6%的EWP-β-CD復(fù)合物組蝦仁和空白對(duì)照組的蝦仁L*值和W顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組的蝦仁（P＜0.05）。由此可知，商業(yè)抗凍劑具有良好的保水作用，但會(huì)降低蝦仁的L*值和W，EWP-β-CD復(fù)合物則對(duì)蝦仁的色度無(wú)顯著影響。

表5 蝦仁白度的變化Table 5 Changes of whiteness of shrimp

2.2.4 蝦仁凍融循環(huán)過(guò)程TCA-可溶性肽含量測(cè)定

TCA-可溶性肽反映小分子肽的含量，從而反映蛋白質(zhì)在內(nèi)源性組織蛋白酶作用下的水解程度[6]。添加不同抗凍劑的蝦仁TCA-可溶性肽含量變化如圖8所示。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，所有處理組的蝦仁TCA-可溶性肽含量逐漸升高，表明蝦仁中蛋白質(zhì)的降解在不斷進(jìn)行。經(jīng)過(guò)1次凍融循環(huán)后，陽(yáng)性對(duì)照組的蝦仁TCA-可溶性肽含量顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明商業(yè)抗凍劑蔗糖和山梨糖醇對(duì)蝦仁蛋白質(zhì)降解最嚴(yán)重。除了內(nèi)源性蛋白酶不斷分解蛋白質(zhì)的原因外，蔗糖和山梨糖醇的加入為微生物提供適宜的環(huán)境，使得某些細(xì)菌大量生長(zhǎng)和繁殖[27]。當(dāng)EWP-β-CD復(fù)合物的添加量為4%和6%時(shí)，經(jīng)過(guò)4次凍融循環(huán)后TCA-可溶性肽含量仍顯著低于空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。

圖8 蝦仁TCA-可溶性肽含量變化Fig.8 Changes of TCA soluble peptide content in shrimp

2.2.5 蝦仁凍融循環(huán)過(guò)程脂肪氧化程度 蝦仁在冷凍和解凍的過(guò)程中除了蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生氧化降解外，蝦仁中大量的不飽和脂肪酸易被氧化成丙二醛（MDA），其含量與脂肪氧化程度呈正相關(guān)[28]。通常用TBARS值反映脂肪的氧化程度，研究表明若蝦仁的TBARS值在0.2～0.66 mg/kg范圍內(nèi)，則表示品質(zhì)良好，若TBARS值超過(guò)1 mg/kg，說(shuō)明蝦仁已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重的品質(zhì)劣變[29]。添加不同抗凍劑的蝦仁脂肪氧化程度如圖9所示。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，各處理組蝦仁的TBARS值逐漸增大，說(shuō)明在凍融循環(huán)過(guò)程中蝦仁的脂肪發(fā)生了較為嚴(yán)重的氧化。添加2%、4%和6%的EWP-β-CD復(fù)合物和商業(yè)抗凍劑的蝦仁經(jīng)4次凍融循環(huán)后，TBARS顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。同時(shí)，添加EWP-β-CD復(fù)合物的蝦仁脂肪氧化程度顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明EWP-β-CD復(fù)合物抑制脂肪氧化的效果比商業(yè)抗凍劑要好。

圖9 蝦仁脂肪氧化程度的變化Fig.9 Changes of lipid oxidation degree of shrimp

3 結(jié)論

低甜度、低熱量是未來(lái)抗凍劑發(fā)展的趨勢(shì)。以EWP和β-CD為原料制備新型抗凍劑，以EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性大小為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)確定了最佳抗凍活性的EWP-β-CD復(fù)合體系的制備條件：pH為7.0，β-CD與EWP的復(fù)合比為1:10，熱處理溫度75 ℃，此時(shí)EWP-β-CD復(fù)合體系的抗凍活性為84.09%。將EWP-β-CD復(fù)合物按不同濃度應(yīng)用于小龍蝦蝦仁的凍融循環(huán)體系，發(fā)現(xiàn)添加EWP-β-CD復(fù)合物能起到增強(qiáng)蝦仁保水性的作用，當(dāng)添加量為6%時(shí)能維持蝦仁硬度和咀嚼性，同時(shí)不會(huì)影響蝦仁的色度。添加EWP-β-CD復(fù)合物可以在一定程度上抑制蝦仁蛋白質(zhì)的降解和脂肪氧化，當(dāng)EWP-β-CD復(fù)合物的添加量為4%和6%時(shí)，其效果明顯優(yōu)于商業(yè)抗凍劑。本研究擴(kuò)大了蛋品和低聚糖的應(yīng)用范圍，為新型抗凍劑的研發(fā)提供一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)改善蝦仁在反復(fù)凍融過(guò)程中的品質(zhì)劣變問(wèn)題。