響應面法優化鮮黃酒瓶內發酵工藝

葛松濤，壽泉洪，韓文鳳，王 蘭，沙如意 ，王珍珍，胡普信，毛建衛

（1.浙江工業職業技術學院黃酒學院，浙江紹興 312000；2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州 310023；3.國家黃酒工程技術研究中心，浙江紹興 312000；4.浙江科技學院，浙江杭州 310023）

黃酒是世界三大發酵酒之一，是我國所獨有的，以稻米、黍米、小米等為主要原料，經加麥曲等糖化發酵劑釀制而成的發酵酒[1]。由于黃酒的原輔料和采用獨特多菌種協同的雙邊發酵工藝，因此黃酒含有豐富的功能性成分，如多酚、多糖、多肽、γ-氨基丁酸等，使黃酒具有一定的調節腸道菌群、降血壓等保健功效[2]。黃酒獨特的原料和生產工藝，通過發酵過程中的微生物代謝、陳化儲存過程的生化反應[3]，賦予黃酒酸、甜、苦、鮮、澀的口感[4]，豐富且復雜的風味[5-6]。口感與風味對黃酒的質量和風格起到重要的作用，也是影響消費者偏好的重要因素[1]。復雜的風味導致黃酒地域消費特征顯著，主要市場向江浙滬集中，年齡向中老年集中[7]。

通過引導消費的方式實現消費區域與年齡突破不現實[7]，因此，開發適合現代青年生活習慣及口感的黃酒成為首選方案。目前，黃酒的研究主要集中在原料的選擇、酒曲微生物種類、功能性成分及黃酒風味等[8-10]。而傳統黃酒發酵結束后需經過澄清、滅菌等工序使其達到穩定，目前主流的滅菌工藝采用加熱滅菌[11]，加熱滅菌則會造成黃酒風味的損失，尤其使澀味的感官屬性突出[1]。鮮黃酒發酵后不經高溫滅菌[12]，因此鮮酒較熱法殺菌酒口感更新鮮[13]。朱一松等[14]通過超濾膜截留黃酒中的大分子物質，得到純生黃酒，顏色變淺香味淡爽。胡普信[12]采用先糖化后發酵，再經無菌過濾的工藝，生產得到較為爽口的純生黃酒。但膜過濾法生產純生黃酒，導致黃酒中蛋白質和氨基酸的含量下降，且對膜的要求較高，導致黃酒生產成本的上升。

瓶內發酵鮮黃酒是通過原料滅菌裝瓶后，接入酵母發酵，發酵結束后不經滅菌直接進入消費終端，既能減少滅菌能耗又能保證產品的質量。由于發酵后的成品未被加熱，成品呈多種復合香味且較為爽口[12]；同時發酵是在完全密閉的環境中進行，因此產生的二氧化碳會被溶解到黃酒中，賦予低度黃酒獨特的風味[15]。本研究通過調整配方、發酵時間和溫度，在前期單因素實驗的基礎上，通過Plackett-Burman試驗，最陡爬坡試驗，中心組合試驗（Central Composite Design，CCD）的方法優化低度鮮黃酒發酵工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糯米 市售；黃酒高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖 國藥集團化學試劑有限公司；α-淀粉酶（酶活2000 U） 無錫杰能科酶制劑公司；糖化酶（酶活50000 U） 張家港金源生物化工有限公司；礦泉水 華潤怡寶飲料有限公司。

電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇榮華儀器制造公司；BSP-250生化培養箱 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖液制備與滅菌 按照吳殿輝[16]的方法制備初始發酵糖液，稀釋至試驗所需糖度裝瓶后95 ℃水浴滅菌[12,16]，備用。

1.2.2 鮮黃酒發酵與耐壓計算

1.2.2.1 鮮黃酒發酵工藝 稱取0.2%安琪干酵母按

參考文獻[17]方法35 ℃下活化，產生大量氣泡后備用。按方法1.2.1制備的初始發酵糖液中接入已活化安琪酵母液，置于生化培養箱中按一定溫度恒溫培養，達到一定發酵時間后4 ℃保存備用。

1.2.2.2 鮮黃酒耐壓計算 按照參考文獻[12]的方法測量初始糖度和發酵終了結束糖度。按照參考文獻[18]的方法計算瓶內壓力，釀造中CO2計算可簡化為：

式中：G：發酵液中CO2產生總量，%。

1.2.3 發酵工藝響應面試驗

1.2.3.1 Plackett-Burman設計篩選 采用 Plackett-Burman設計法和Design-expert軟件創建試驗次數N=12的試驗，對初始糖度（A，g/L）、裝液量（C，mL）、水浴滅菌的時間（D，h）、接種量（F，mL）、發酵溫度（G，℃）、發酵時間（J，h），6個因素進行考察，另設5個虛擬因素（B、E、H、I、K）以考察試驗誤差[19]，如表1所示，以感官評價分為響應值考察各因素對口感影響的顯著性[20]。

表1 Plackett-Burman 設計因子水平及編碼值Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.3.2 最陡爬坡試驗 析因實驗的初步估計常常遠離實際最優點，需要以響應值變化的梯度方向為爬坡方向設計爬坡試驗，根據各顯著因素效應值的大小確定變化步長，以期快速、經濟地逼近最大響應區域。根據Plackett-Burman試驗結果，設計最陡爬坡試驗[21]。

1.2.3.3 響應面試驗 利用Design-expert軟件在最陡爬坡試驗的基礎上進行3因素3水平的中心組合設計試驗[22-24]，如表2所示，以得到最佳的發酵條件，提高感官評價分數。

表2 中心組合試驗中變量及其水平Table 2 Factors and levels of central composite design

1.2.4 鮮黃酒感官評價

1.2.4.1 感官品評人員 品評人員分為兩組選拔后統一培訓[25-26]。一組由國家級黃酒評酒委員組成，作為專家品評小組，共4 人，其中男性3人，女性1人；另一組由19～22歲的浙江工業職業技術學院黃酒分院的青年學生組成，作為鮮黃酒潛在的消費者，共9人，其中男性3人，女性6人。

1.2.4.2 評價方法 品評共3輪重復，樣品隨機組合；分別將樣品分輪次提供給品評員進行味覺和嗅覺的感官描述分析；每輪品評之間間隔時間15 min，提供純凈水給品評員漱口；品評員記錄樣品的味道和氣味感官性質，并根據表3進行評分[26-28]。去掉一個最高分，去掉一個最低分后取算術平均值作為最終得分。

表3 成品黃酒評分標準（分）Table 3 Sensory evaluation (scores)

1.3 數據處理

每位品評人員每組數據重復測定2次，去掉每組評分最高分和最低分后取平均值；采用Design-Expert.V 8.0.6統計軟件進行實驗設計和數據分析統計，響應面圖采用Design-Expert.V 8.0.6導出。

2 結果與分析

2.1 瓶內發酵耐壓安全性計算

將根據Plackett-Burman試驗設計和爬坡試驗設計發酵得到的低度鮮酒按照方法1.2.2.2檢測糖度。

如表4、表5所示，本試驗中所采取的初始糖度最高為160 g/L，在實際操作中檢測得到發酵結束糖度不低于40 g/L，根據實驗方法1.2.2.2計算可得CO2含量＜0.58%，而成品啤酒按國家標準CO2含量在0.40%～0.65%之間，因此本項目所產生的CO2含量符合耐壓安全標準。

表4 Plackett-Burman試驗鮮酒糖度Table 4 The brix of Plackett-Burman design

表5 最陡爬坡試驗鮮酒糖度Table 5 The brix of the steepest ascent method

2.2 Plackett-Burman設計篩選結果

根據前期單因素實驗基礎，選用試驗次數N=12的試驗設計，以感官評價為響應值。實驗設計及結果如表6所示。

表6 Plackett-Burman 試驗設計與結果Table 6 Design and results of Plackett-Burman test

對試驗數據進行方差分析，Plackett-Burman試驗結果采用Lenth法識別顯著效應[22]，得到了因素標準化效應的半正態概率效應圖（圖1）以及因素標準化效應的帕累托圖（圖2）。由圖1可看出，因素G、J、A的標準化效應點離擬合線較遠，位于圖右側，故其為顯著影響因素（P＜0.05），即影響感官評價的顯著因素是發酵溫度、發酵時間、初始糖度、接種量，各因素對感官評價影響程度的大小順序為：發酵溫度＞發酵時間＞初始糖度＞接種量。裝液量和滅菌時間標準化效應點均較小，說明影響不顯著。標準化效應的帕累托圖（圖2）進一步確定了效應的量值和重要性，因素G、J、A、F均超過了t值，為顯著因子。

圖1 鮮黃酒感官評價半正態概率效應圖（α=0.05）Fig.1 Half-Normal plot of estimated main effects on sensory scores (α=0.05）

圖2 鮮黃酒感官評價的標準效應帕累托圖（α=0.05）Fig.2 Pareto chart of estimated main effects on sensory scores(α=0.05)

由表7可知，模型的P值為0.0122＜0.05表明顯著，故該模型可靠，即該模型在被研究的整個回歸區域擬合很好；決定系數R2=0.9214，說明相關性較好；校正決定系數R2Adj=0.8270表明，82.7%的試驗數據的變異性可用此回歸模型來解釋；通常情況下變異系數（CV）越低，實驗的可信度和精確度越高，CV值等于8.67%，表示PB實驗的可信度和精確度較好；精密度是有效信號與噪聲的比值（Adeq Precisior），大于4.0視為合理[22]，本試驗精密度達9.807。

表7 Plackett-Burman試驗因素、水平及顯著性分析Table 7 Factors, levels and significance analysis of Plackett-Burman test

通過對數據進行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y=65.61+5.39A+4.01C-3.17D-4.36F-6.69G-6.24J。

2.3 最陡爬坡實驗

由回歸方程可知，因素A偏回歸系數為5.39，表明因素A對感官評價分數的影響為正效應，即隨著A因素的增加，感官評分呈上升趨勢，應增加。同時由回歸方程1可見，F、G、J因素為負效應，即對響應值的影響為負效應，應減小。但響應面試驗時考察因素超過3個會使試驗次數顯著增加（3個因素為20次處理，4個因素為31次處理）。同時，因素F即接種量的效應在這4個因素中最小，因此舍棄對該因素的進一步優化[29]。由于最顯著的因素是G，因此以G為爬坡單位。

爬坡實驗從中心點開始出發[30]，一般而言減少接種量可降低成本，因此取低水平接種量10 mL。綜合考慮成品酒的氣泡含量、滅菌效果與成本等因素，裝液量固定取195 mL，滅菌時間固定取2.5 h。設計及結果如表8所示。

表8 最陡爬坡實驗設計及其結果Table 8 The steepest ascent method results

由表8可知，處理2的感官分數最高，因此以處理2為響應面試驗的中心點。

2.4 CCD結果與響應面分析

根據最陡爬坡試驗，以處理2為中心點實行CCD試驗[31]，以感官分數為響應值。因為有3個自變量，為使擬合響應方程具有旋轉性和通用性, 選擇中心點實驗數為6，星號臂長γ=1.682。實驗方案及結果見表9。

表9 中心組合試驗設計結果Table 9 Results of central composite design

通過對數據進行二次多元回歸擬合，得到二次多項式方程：Y=95.67-2.25A+2.06B-2.62C-1.62AB-2.62AC-0.12BC-3.62A2-6.80B2-7.33C2。

響應面分析中對試驗結果進行擬合的二次模型方差分析見表10。F值為768.85，R2=0.9986，R2Adj=0.9973，說明模型對實際情況擬合較好；P值為＜0.0001，表明該模型高度顯著，可用來進行響應值預測。

表10 中心組合試驗模型顯著性分析Table 10 The variance of central composite design

利用回歸模型對各發酵條件下鮮黃酒感官評價進行預測[32]，為便于觀察模型預測結果，將模型預測值與實驗值相關圖繪于圖3，圖中可以發現樣本點都處于45°對角線附近，說明模型對各發酵條件下低度鮮黃酒預測值與實驗值高度相關，兩者差別較小。模型預測誤差分布圖見圖4，通常對于一個優良的模型要求大部分樣本的預測誤差不得超過±2SD。圖4中可以看到全部樣本點都落在模型的±2SD范圍內，沒有異常點，說明模型預測準確性高，可以用于對低度鮮酒的發酵工藝進行分析[33]。

圖3 模型預測值與實驗值相關圖Fig.3 Normal plot of residuals on sensory score

圖4 殘差對模型預測散布圖Fig.4 Residuals versus predicted values on sensory score

依據回歸方程，利用Design-expert繪出響應面分析圖，結果見圖5、圖6、圖7。通過響應面3D圖可以明顯看到所做試驗的范圍包括最大值所在區域。

圖5 糖度和發酵溫度交互作用對感官評價的影響Fig.5 Effects of interactions between brix and fermentation temperature on sensory score

圖6 糖度和發酵時間交互作用對感官評價的影響Fig.6 Effects of interactions between brix and fermentation time on sensory score

圖7 發酵時間和發酵溫度交互作用對感官評價的影響Fig.7 Effects of interactions between fermentation time and temperature on sensory score

利用Design-expert對模型進行分析預測[22]，得到糖度為126 g/L，發酵溫度為20.5 ℃，發酵時間為69.2 h，此時的響應值最大且值為96.7分。

2.5 驗證性試驗

在優化條件下進行驗證試驗，感官分析的數據為96.6分，試驗值與理論預測值非常接近，可見該模型可以較好的預測實際的發酵情況，從而也證明響應面優化低度鮮黃酒發酵工藝的可行性。

3 結論

研究結果表明，利用Design-expert軟件進行Plackett-Burman設計、最陡爬坡法與響應面相結合的試驗設計方法能快速、有效地從眾多影響低度鮮黃酒因素中篩選關鍵因素，并優化發酵工藝。經上述方法優化后，低度鮮黃酒的最佳發酵工藝為：糖度為126 g/L，發酵溫度為20.5 ℃，發酵時間為69.2 h，裝液量為195 mL，滅菌時間為2.5 h，接種量為10 mL，此時低度鮮黃酒的感官評價分數最高。鮮酒與發酵后滅菌得到的樣品相比較，具有復合果香、無苦澀味且明顯更為爽口，因此響應面法能較好地對低度鮮黃酒的發酵條件進行優化，試驗可為行業低度鮮黃酒的開發提供數據參考。