植物乳桿菌對米酵菌酸的吸附特性研究

劉 鵬，張 雯，歐 杰,3,4, ，李柏林

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海市質量監督檢驗技術研究院/國家食品質量監督檢驗中心（上海），上海 200233；3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；4.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306）

米酵菌酸（Bongkrekic acid）是椰毒假單胞菌產生的一種外毒素，廣泛存在于發酵椰漿、變質薯粉、變質玉米面與變質木耳等食品中[1]。米酵菌酸不僅具有高毒性（小鼠LD50值約為3.16 mg·kg-1），而且耐熱性極強，普通烹飪方式無法殺滅米酵菌酸[2]。食用被米酵菌酸污染的食物容易引起惡心嘔吐、腹痛腹脹等癥狀，甚至會造成肝腦腎等器官的嚴重損害，并且目前對米酵菌酸尚無特效解毒藥[3-4]。近年來，米酵菌酸導致的食物中毒事件在國內時有發生，嚴重影響著食品安全。因此，消除米酵菌酸在食品中的污染是保證食品安全的重要手段。目前對于米酵菌酸的脫除方式僅限于物理和化學層面，主要包括紫外照射、微波輻射和強氧化劑降解等[5-6]。然而，這些方法雖然具有一定的脫除效果，但其成本高，易殘留，且往往會降低食品營養價值[7]。生物吸附是近年來一種綠色高效的新型脫毒策略，通過微生物細胞壁中的肽聚糖與毒素結合從而達到脫毒效果，這種方法穩定性好、效率高且不會影響食品品質。其中，乳酸菌在益生、抗腫瘤與抗突變等方面具有一定優勢，常被用作生物吸附劑來消除毒素污染。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是目前研究最廣泛的乳酸菌之一，其來源廣泛、安全無毒且益生作用明顯，常用于食品發酵[8]。研究表明，植物乳桿菌具有快速結合污染物、增強人體膳食排泄、抑制腸道致病菌、緩解炎癥與氧化應激等多種特殊功能[9]，并且已有研究發現對黃曲霉毒素、伏馬毒素、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮等具有體外脫毒功效[10-12]。然而，利用生物吸附法對米酵菌酸進行脫毒的研究還未曾報道，此外在不同環境中對米酵菌酸的脫毒條件與吸附特性尚未明確，因此本文選用植物乳桿菌對米酵菌酸進行脫毒效果探究。

目前，吸附特性研究主要利用動力學與熱力學方程擬合的方式進行分析，而動力學和熱力學擬合常用于材料對污染物吸附和生物體對有害金屬吸附等方面，在乳酸菌菌株吸附毒素方面的應用鮮有報道。因此，本研究從理化因素及模擬胃腸道環境下對吸附的影響進行設計，并結合動力學和熱力學擬合分析，系統地探究植物乳桿菌對米酵菌酸的吸附效果，旨在為制定有效的毒素脫除策略提供理論方法和依據，以期更好地保證食品安全與公眾健康。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumX1） 現保藏于本實驗室；MRS液體培養基、MRS瓊脂培養基 廣東環凱生物科技有限公司；米酵菌酸標準品（CAS：11076-19-0，純度≥99%） 北京曼哈格生物科技有限公司；胰蛋白酶（≥250 U·mg-1）、胃蛋白酶（≥250 U·mg-1）、磷酸二氫鉀（分析純）、甲醇（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司。

電子天平 上海禾汽玻璃儀器有限公司；PB-260平板式酸度計 海佑科儀器儀表有限公司；ZHJH-C1112C 超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-150F生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體制備 取菌株（保藏于-80 ℃冰箱）于MRS平板上劃線，37 ℃活化48 h后挑取單菌落至MRS肉湯，37 ℃培養18 h后離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）棄上清液，用無菌水沖洗兩次后再次離心，收集菌體置于35 ℃烘箱烘干待用。

1.2.2 米酵菌酸的HPLC檢測 檢測方法參考GB 5009.189-2016《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》[13]，為保證良好峰形，選擇對流動相配比進行更改[14]。檢測條件：色譜柱：Agilent 5 TC-C18（5 μm×4.6 mm×250 mm）；流動相（A：甲醇，B：水用冰乙酸調pH=2.5，A:B=80:20）；流速：1 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：267 nm。在0.3～40 mg·L-1濃度范圍內，測出各濃度梯度下BA標準品的峰面積并繪制標準曲線，方程為y=22.665x+0.1409，R2=0.9994，濃度與峰面積保持著良好的線性關系。

1.2.3 菌體對米酵菌酸吸附率測定 用無菌PBS將烘干菌體配制成1 g·L-1的菌懸液，取1 mL濃度為20 mg·L-1的米酵菌酸工作液加至4 mL菌懸液中，混勻于37 ℃培養1 h后離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）收集上清。將上清液過0.45 μm有機濾膜后進液相檢測。設同濃度米酵菌酸工作液為對照。菌體對米酵菌酸吸附率與單位吸附量按以下公式計算：

式中，Q為米酵菌酸吸附率，%；C0為初始米酵菌酸濃度，mg·L-1；Ce為平衡時懸液中的米酵菌酸濃度，mg·L-1；Y為米酵菌酸吸附量，mg·g-1；V為米酵菌酸工作液體積，L；m為菌體質量，g。

1.2.4 時間、溫度和pH對菌體吸附米酵菌酸的影響

時間：取1 g·L-1的菌懸液4 mL，加入1 mL濃度為20 mg·L-1的米酵菌酸工作液，混勻后37 ℃靜置培養。時間分別設置為10、20、30、60、120和180 min，培養完成后離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）取上清液，過膜檢測，以未加入菌體的同濃度米酵菌酸作為對照。

溫度：取1 g·L-1的菌懸液4 mL，加入1 mL濃度為20 mg·L-1的米酵菌酸工作液，混勻后靜置培養1 h。培養箱溫度分別設置為20、25、30、37和42 ℃，培養完成后離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）取上清液，過膜檢測，以未加入菌體的同濃度米酵菌酸作為對照。

pH：取1 g·L-1的菌懸液4 mL，分別調pH為1、3、5、7和9，加入1 mL濃度為20 mg·L-1的米酵菌酸工作液，混勻后37 ℃靜置培養1 h，培養完成后離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）取上清液，過膜檢測，以未加入菌體的同濃度米酵菌酸作為對照。

1.2.5 菌體濃度與米酵菌酸濃度對菌體吸附米酵菌酸的影響 菌體濃度：用無菌PBS將稱重不同的烘干菌體配制為1、2、3、4、5和6 g·L-1的菌懸液，各濃度分別取4 mL，加入1 mL濃度為20 mg·L-1的米酵菌酸工作液，混勻后37 ℃靜置培養1 h，培養完成后離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）取上清液，過膜檢測，以未加入菌體的同濃度米酵菌酸作對照。

米酵菌酸濃度：分別配制濃度為10、20、50、70、100和150 mg·L-1的米酵菌酸工作液，取1 g·L-1的菌懸液4 mL，分別加入1 mL各個濃度的米酵菌酸工作液，混勻后37 ℃靜置培養1 h，培養完成后離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）取上清液，過膜檢測，以未加入菌體的同濃度米酵菌酸作對照。

1.2.6 模擬胃腸道環境下對吸附的影響 人工胃液的配制：用無菌去離子水分別稀釋適量濃鹽酸于三個燒杯中，調節pH分別為2、3、4，之后各加入1%的胃蛋白酶。充分溶解后，過膜后待用[15]。取3支菌懸液離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）收集菌體，向菌體中分別加入pH為2、3、4的人工胃液，再加入1 mL 米酵菌酸后靜置于37 ℃培養箱中分別培養30、60、120 min，離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）取上清，過膜待測，以不加胃液的毒素-菌體混合液作為對照。

人工腸液的配制：用電子天平準確稱取磷酸二氫鉀6.8 g于燒杯中，加入50 mL無菌水使其溶解，用濃度為0.1 mol·L-1的NaOH溶液調節pH為6.8，加水稀釋并定容到100 mL，之后向其加入1 g胰蛋白酶，充分溶解后過濾，4 ℃冷藏待用[13]。取3支菌懸液離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）收集菌體，向菌體中分別加入4 mL的人工腸液，加入1 mL 米酵菌酸后在37 ℃水浴中分別培養30、60、120 min，離心（5000 r·min-1，4 ℃，10 min）取上清，過膜待測，以無腸液的毒素-菌體混合液作為對照。

1.2.7 等溫吸附擬合 采用常見吸附熱力學方程對試驗數據進行擬合，方程如下：

另外，在Langmuir方程上增加一個分離因子R1來表示吸附過程的難易程度：

式中，Y為米酵菌酸單位吸附量，mg·g-1；Ym為最大吸附量，mg·g-1；K1為Langmuir方程參數；Ce為平衡時懸液中的米酵菌酸濃度，mg·L-1；n、K2為Freundlich方程參數；K3、a、b為Redlich-Peterson方程參數，其中0＜b＜1；A、B為Temkin方程參數。

1.2.8 熱力學特性 為了更好地解釋菌株對米酵菌酸的吸附特性，將由三個熱力學參數來評價，分別為吉布斯自由能（ΔG）、吸附焓（ΔH）與吸附熵（ΔS），方程如下：

式中，ΔH為焓變，J·mol-1；ΔS為熵變，J·mol-1·K-1；Kc為吸附平衡常數；R為理想氣體常數，R=8.314472（J·mol）·K-1；T為溫度，℃（37 ℃=300.15 K）。對于平衡常數Kc的使用，很多報道中將Langmuir方程常數K1與Freundlich方程常數K2作為平衡常數。

1.2.9 動力學擬合 采用Lagergren準一級、準二級動力學方程與Elovich方程對數據進行擬合分析吸附特性，方程如下：

式中，Y同上；Yt是t時刻的吸附量，mg·L-1；K4、K5為準一級與準二級方程常數；c、d為Elovich方程參數。

1.2.10 數據統計分析 本實驗采用IBM SPSS Statistics 26軟件對數據進行統計分析，做方差及顯著性分析，所有實驗均重復三次且設置相應對照，用Origin Pro 9.8軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 影響菌體吸附米酵菌酸的因素

2.1.1 時間對菌體吸附米酵菌酸的影響 不同時間內菌株單位吸附量與米酵菌酸的吸附率如圖1a所示。由圖可知，單位吸附量與吸附率的趨勢相近，前期快速上升，中后期達到平衡。單位吸附量在1 h達到平衡，平衡時為10.02 mg·g-1，因此后續實驗選擇1 h作為培養時間。米酵菌酸吸附率在30 min時最高達到52.3%，1 h之后也達到平衡，平衡時為48.9%。吸附率的小幅度降低可能是由于部分菌株與米酵菌酸結合不牢固，發生了部分解吸，但整體吸附是一個快速高效的過程。隨著吸附的進行，與菌株結合的米酵菌酸分子會與游離米酵菌酸分子產生排斥，吸附量便不再增加。這與最近Muaz等[16]報道乳酸菌快速吸附黃曲霉毒素M1的結論一致，其同樣指出吸附主要在前期發生。

圖1 不同理化因素對吸附米酵菌酸的影響Fig.1 Effects of different physical and chemical factors on adsorption of bongkrekic acid

2.1.2 溫度對菌體吸附米酵菌酸的影響 溫度對生物吸附過程的影響分為兩類：一類是溫度影響吸附效果，吸附過程依賴能量；另一類是溫度不影響吸附效果，吸附過程不依賴能量，是否依賴能量具體取決于微生物本身的特性[17]。圖1b中顯示隨著溫度的上升，菌株單位吸附量與對米酵菌酸的吸附率均在增長，且吸附率在37 ℃達到峰值為52.70%，因此在本研究中37 ℃可認為是吸附的最適溫度。另外，乳桿菌吸附米酵菌酸存在著能量變化，能量可能來自于米酵菌酸分子的熱運動。溫度升高加劇了分子熱運動，故米酵菌酸與吸附位點結合率增高；另外有研究[18]報道過熱時細胞壁蛋白在菌株外形成蛋白膜對菌株加以保護，而植物乳桿菌X1的最佳生長溫度為37 ℃，當超過37 ℃后，植物乳桿菌X1與毒素結合則會減少。同時在Cherkani-hassani等[19]的研究中也提到，鼠李糖乳桿菌L. rhamnosusLb50在最佳生長溫度25 ℃時對黃曲霉毒素B1吸附率最高，而在低溫15 ℃及37 ℃以上時吸附率反而降低。

2.1.3 pH對菌體吸附米酵菌酸的影響 pH在吸附過程中起著重要作用，因為其與米酵菌酸分子的電離程度和植物乳桿菌表面細胞壁結構有關[20]。由圖1c可知，菌株的單位吸附量與米酵菌酸吸附率的整體趨勢均為先上升后下降。當pH為3時，菌株吸附效率達到最高，為47.6%，而后隨pH升高，吸附率逐漸減低且變化較大，說明酸性環境下比堿性環境更有利于吸附的進行。一方面，這可能是由于在酸性環境下，細胞壁多糖結構中糖苷鍵斷裂，導致游離單糖增多，削弱了細胞壁的致密性[21]。另外，推測細胞壁表面蛋白質以及肽鏈發生斷裂，從而增加了毒素與菌體細胞間的相互作用，所以酸性環境下吸附率較高[22]。另一方面，這可能與米酵菌酸的三羧酸結構有關，酸性條件抑制三羧酸結構水解，導致其不能充分與乳桿菌結合[23]。這與Hatab等[24]的結果相似，他們在研究乳酸菌菌株M74和EF031吸附展青霉素的實驗中指出，當pH為3時吸附率最高，而pH高于7時吸附率卻很低。

2.2 菌體濃度與米酵菌酸濃度對菌體吸附米酵菌酸的影響

據圖2a所示，菌體濃度對吸附效果產生了顯著影響。在毒素濃度和溫度一定時，菌體濃度從1 g·L-1提高到5 g·L-1時，米酵菌酸吸附率顯著上升（P＜0.05），而后緩慢增長，在6 g·L-1時吸附率最大，為54.12%。菌株單位吸附量卻呈現顯著下降的趨勢（P＜0.05），當菌體濃度從1 g·L-1提高到6 g·L-1時，單位吸附量從9.25 mg·g-1降到3.06 mg·g-1，這是由于毒素濃度一定時，單位菌體濃度越大即吸附位點越多，單位吸附量越低；而吸附位點總量增多，故而毒素被吸附的越多，總吸附率就越高。

圖2 菌體濃度與米酵菌酸濃度對吸附的影響Fig.2 Effects of bacterial concentration and bongkrekic acid concentration on adsorption

由圖2b可以看出，毒素濃度對吸附的影響較大。當米酵菌酸濃度從10 mg·L-1增加到150 mg·L-1時，菌株的單位吸附量隨著米酵菌酸濃度的升高而顯著增加（P＜0.05），單位吸附量從4.87 mg·g-1增加到37.41 mg·g-1。但吸附率卻隨著米酵菌酸濃度升高而顯著降低（P＜0.05），菌體對米酵菌酸的吸附率從48.53%降低到了22.35%。因此在米酵菌酸濃度為10 mg·L-1時，菌株吸附效果最佳，這是由于菌體密度與吸附位點不變時，低濃度的米酵菌酸可大量被菌體吸附，而米酵菌酸的分子總量增加，在體系中游離分子增多，菌體吸附達到峰值與飽和狀態，導致米酵菌酸的吸附率下降。

2.3 模擬胃腸道環境下的吸附效果

植物乳桿菌可以定植在人體的胃腸道中，能否發揮其益生性取決于胃腸液中酶的活性以及酸度。由圖3所示，時間30 min時菌體在pH為3的胃液中對米酵菌酸的吸附率顯著高于腸液組與正常組（P＜0.05），其吸附率為34.52%；時間60 min時pH為3的胃液組與正常組無顯著性差異（P＞0.05），兩組吸附率分別為47.72%和49.7%，但均顯著高于腸液組吸附率39.65%（P＜0.05）；時間120與60 min時相似，pH為3的胃液組與正常組無顯著性差異（P＞0.05），兩組吸附率分別為45.4%和47.1%，也均顯著高于腸液組吸附率36.38%（P＜0.05）。整體來看，胃液組略低于正常組吸附效果，推測其中的胃蛋白酶和酸性環境可能是引起吸附率降低的原因。但對比pH為2時的胃液組和正常組吸附率可知，低pH時依舊有吸附效果, 因此引起吸附率下降的主要原因是胃蛋白酶的存在。胃蛋白酶起作用于細胞壁上的蛋白質物質，破壞細胞壁原有的網格結構，導致吸附能力下降[25]。而腸液組吸附效果遠遠低于胃液組與正常組，原因是胰蛋白酶對于細胞壁上的磷脂以及蛋白都有顯著影響，同樣也會破化蛋白質結構與影響表達，作用與胃蛋白酶類似。

圖3 模擬胃腸道環境下對吸附米酵菌酸的影響Fig.3 Effects of simulated gastrointestinal environment on adsorption of bongkrekic acid

2.4 吸附等溫曲線的繪制

用四種方程對等溫吸附數據擬合曲線見圖4，相關參數見表1。由表1可知，四種方程對菌株吸附米酵菌酸的擬合度都較高，其中Langmuir方程決定系數R2達到0.987，明顯高于其他三種方程。該模型指出固相吸附劑會均勻地分布結合位點且每個分子只結合一個位點，最終形成一層單分子吸附層[26]。因此本實驗中菌株對米酵菌酸的吸附主要符合單分子層

表1 等溫方程模型擬合參數Table 1 Parameters of isothermal equation model fitting

圖4 不同等溫曲線的擬合Fig.4 Fitting of different isothermal curves

吸附，并且預測出最大單位吸附量Ym為34.59 mg·g-1。在原有方程基礎上增加的無量綱常數的大小決定了吸附的難易程度[27]。當R1為0時，吸附僅為正向進行而不可逆；當R1在0～1之間時，吸附較容易進行；當R1為1時，平衡濃度與吸附量之間為線性關系；當R1大于1時，吸附很難進行。由圖5可知，R1始終是小于1的，說明吸附菌體吸附米酵菌酸較易進行。另外，米酵菌酸濃度越大R1越小，說明米酵菌酸濃度升高會促進吸附的進行。

圖5 分離因子隨米酵菌酸濃度變化Fig.5 Variation of separation factor with bongkrekic acid concentration

2.5 附熱力學擬合分析

熱力學特性研究可以解釋吸附中關于內能的變化，根據式（8）與式（9）計算出ΔG以及ΔH與ΔS，數值見表2。根據表3可知，ΔG在5個溫度下均為負值，說明吸附有自發性，ΔG隨溫度的變化表明吸附過程存在物理吸附[28]。ΔH為正值代表該吸附反應為吸熱性質，數值在0～40 kJ·mol-1之間說明吸附后米酵菌酸分子運動受限且不易發生解吸[29]。綜合熱力學分析表明植物乳桿菌對米酵菌酸的吸附效果很好，其作為吸附劑有很大潛力。

表2 熱力學參數Table 2 Parameter of thermodynamic

2.6 動力學擬合分析

用動力學方程對不同時間的吸附量進行擬合結果見圖6，方程參數見表3。根據表3可知準二級方程擬合決定系數R2為0.985，遠大于另外兩個方程，并且預測出最大吸附量Ym為11.425 mg·g-1，三次實驗實際結果平均值為10.22 mg·g-1，實際值與預測值相差不大，因此準二級動力學方程擬合度最高。該方程的模型假定條件為吸附位點與吸附能力成正比，即植物乳桿菌的吸附能力與自身吸附位點數量成正比[30]，這表明影響吸附位點的因素便是主導吸附效果強弱的關鍵因素。此外，米酵菌酸與植物乳桿菌自身位點結合本質是吸附質與吸附劑之間產生了電子交換，存在電子交換即證明吸附過程中存在化學吸附[31]。

表3 吸附動力學方程模型擬合參數Table 3 Parameters of adsorption kinetic equation model fitting

圖6 不同動力學方程的擬合Fig.6 Fitting of different kinetic equations

3 結論

本研究以植物乳桿菌X1作為吸附劑對米酵菌酸進行吸附，通過實驗發現菌株在時間1 h達到吸附平衡，在pH為3、菌體密度為6 g·L-1、溫度為37 ℃及米酵菌酸濃度為10 mg·L-1時吸附效果最佳。在模擬胃腸液環境中，由于胃蛋白酶與胰蛋白酶的存在導致吸附效果減弱。繪制等溫線結果表明該吸附最符合Langmuir方程，決定系數R2達到0.987，符合單分子層吸附特點。利用動力學方程擬合分析可知準二級動力學模型擬合度最高，決定系數R2達到0.985。綜合熱力學與動力學分析可得，吸附過程為自發、放熱的過程，同時存在物理吸附與化學吸附，溫度越高越利于吸附，且吸附后不易解吸。因此植物乳桿菌X1作為米酵菌酸吸附劑有應用潛力，未來可探究吸附機制及建立動物模型，進行體內乳酸菌脫毒研究，并以乳酸菌為基礎研發制劑，以期減少米酵菌酸對人體和動物的傷害。