黃精多糖對睡眠干擾誘導(dǎo)小鼠認(rèn)知功能損傷的作用及機(jī)制研究

劉雨培，張瑛毓，韋 震，劉佳萌，孫 晶，范 蓓，王 瓊，盧 聰, ，劉新民 ，王鳳忠,

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙 410208；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

快節(jié)奏、高壓的生活方式往往會產(chǎn)生失眠、睡眠質(zhì)量下降、晝夜節(jié)律顛倒等問題，長期的睡眠不足會造成認(rèn)知功能損傷[1-2]。認(rèn)知功能損傷是中樞神經(jīng)退行性疾病的前驅(qū)癥狀，認(rèn)知功能下降會導(dǎo)致輕度認(rèn)知障礙，進(jìn)而發(fā)展成為癡呆。而與其它疾病相比，功能性損傷無明確的病變部位，靶點(diǎn)不明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)難以作用。傳統(tǒng)中醫(yī)藥講究整體觀念、天人合一、辯證論治，多成分、多靶點(diǎn)、多途徑整體協(xié)調(diào)在防治功能性損傷方面發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢。同時隨著我國“健康中國2030”國家戰(zhàn)略需求的提出，那么通過中醫(yī)藥與日常飲食相結(jié)合進(jìn)行食養(yǎng)食療來預(yù)防及干預(yù)此類功能性損傷意義重大，因此對具備改善認(rèn)知功效食品功能因子進(jìn)行挖掘并利用研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

黃精為百合科黃精屬（Liliaceae）多年生草本植物的干燥根莖，中國藥典將其分為黃精（Polygonatum sibiricumRed.）、多花黃精（PolygonatumcyrtonemaHua.）、滇黃精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.）3種[3]。黃精作為傳統(tǒng)食藥同源物質(zhì)，具有防治抑郁[4]、改善睡眠障礙[5-7]、改善認(rèn)知障礙[8-9]等多種神經(jīng)精神類疾病的作用[10]。現(xiàn)代研究表明，黃精粉末[11]、黃精水/醇提取物[12]、黃精多糖[13]等均可改善認(rèn)知功能損傷。其中黃精多糖（PolysaccharideofPolygonati Rhizoma，PSP）被認(rèn)為是黃精的主要活性成分[14]，研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖是黃精降低氧化應(yīng)激水平、增強(qiáng)免疫、緩解炎癥反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放等多重生物活性的活性組分，同時具有改善血管性癡呆[15]、東莨菪堿誘導(dǎo)認(rèn)知障礙[16]、D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型[17]、自然衰老記憶損傷模型[11]等多種認(rèn)知損傷的作用。

目前有關(guān)黃精多糖改善認(rèn)知功能相關(guān)研究主要集中于化學(xué)因素引起的認(rèn)知障礙模型，而對于模擬長期暴露于慢性應(yīng)激因素如長期睡眠剝奪下所誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損傷，黃精多糖是否具備改善作用及其可能

的作用機(jī)制研究未見報道。睡眠干擾模型是一種通過模擬人類睡眠缺乏而導(dǎo)致認(rèn)知損傷的慢性應(yīng)激模型，造模方式包括化學(xué)造模和物理造模，化學(xué)造模為藥物睡眠剝奪，物理造模包括輕柔刺激、滾筒法和水平臺法等，滾筒法睡眠干擾是模擬現(xiàn)代亞健康人群建立認(rèn)知功能性損傷模型的重要的手段，因此本實(shí)驗(yàn)采用滾筒式睡眠干擾儀建立睡眠干擾誘導(dǎo)認(rèn)知功能損傷小鼠模型，研究黃精多糖干預(yù)對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)認(rèn)知功能損傷的防護(hù)作用和分子機(jī)制，以期為黃精的精深加工利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性ICR小鼠 18～22 g，72只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號 SCXK（京）2021-0006。本實(shí)驗(yàn)方案開展前已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)動物管理與動物福利委員會（IACUC）的審查許可；小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，飼養(yǎng)條件：溫度（22±2）℃，濕度55%±10%，光照12 h黑暗交替，每籠6只，自由攝食飲水，常規(guī)飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；銀杏葉提取物 （金納多，生產(chǎn)企業(yè)：Dr.Willmar Schwabe GmbH & Co. KG，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字HJ20 140768；每片含銀杏葉提取物（GBE）40 mg，其中銀杏黃酮苷9.6 mg，萜類內(nèi)酯2.4 mg）；黃精多糖 購自上海源葉生物科技有限公司（純度70% 批號S27804）；白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、γ-氨基丁酸（GABA）、乙酰膽堿（Ach）試劑盒 均購自南京建成生物工程研究所。

5810R 高速冷凍離心機(jī) 德國 Eppendorf 公司；M1000 多功能酶標(biāo)儀 瑞士 Tecan 公司；KSYYI18S418M1滾筒式睡眠干擾儀、KSYY-OP- V4.0小鼠曠場實(shí)時檢測分析系統(tǒng)、物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)裝置、KSYY -MWM- 4.0小鼠 Morris水迷宮實(shí)時在線檢測系統(tǒng)、KSYY-AD-V4.0小鼠避暗實(shí)時檢測分析系統(tǒng) 均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、中國航天員中心和北京康森益友科技有限公司聯(lián)合研發(fā)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及給藥 小鼠隨機(jī)分成6組，空白組（蒸餾水）、模型組（蒸餾水）、陽性對照組（銀杏葉提取物40 mg·kg-1）、黃精多糖低劑量組（100 mg·kg-1）、黃精多糖中劑量組（200 mg·kg-1）、黃精多糖高劑量組（400 mg·kg-1），每組12只；按小鼠體重給藥，給藥體積為0.1 ml·10 g-1，每天1次，共計(jì)46 d。

1.2.2 模型建立 本實(shí)驗(yàn)采用滾筒睡眠干擾儀[18]進(jìn)行造模。動物采購后隨機(jī)分組，動物房適應(yīng)3 d，預(yù)防給藥14 d，取隔音并且穩(wěn)定的動物房和睡眠干擾室環(huán)境（溫度：23～25℃，濕度：55%。12 h/12 h明暗周期），在睡眠干擾儀內(nèi)水瓶裝滿飲用水、食物后，將除去空白對照組之外的動物放入睡眠干擾儀中，設(shè)置干擾參數(shù)：轉(zhuǎn)速（1 r/min），旋轉(zhuǎn)1圈休息2 min，隨機(jī)方向轉(zhuǎn)動。動物放入睡眠干擾儀內(nèi)， 15～17 d每天3 h（每天固定相同時間段）適應(yīng)3 d。適應(yīng)期結(jié)束后，18～31 d按此前參數(shù)進(jìn)行睡眠干擾14 d，適應(yīng)及造模期間持續(xù)給藥。

造模結(jié)束后，32 d起開始行為學(xué)檢測，每日檢測結(jié)束后立即將小鼠放回睡眠干擾儀內(nèi)，直至46 d所有行為學(xué)檢測結(jié)束后取材完成。

1.2.3 行為學(xué)檢測

在地面油田鉆井工程中，穩(wěn)定器是指鉆具與井壁之間的支撐裝置，它主要用于減小鉆具的振動及渦動，同時實(shí)現(xiàn)井眼的軌跡控制[12]。目前在油田鉆探領(lǐng)域，鉆具多采用旋翼式穩(wěn)定器，其外包絡(luò)直徑與鉆頭相當(dāng)且與井壁之間具有一定的間隙[13-14]。除此之外，現(xiàn)代油田鉆井工程中也采用多級穩(wěn)定器串聯(lián)的方式，防止鉆具與井壁直接接觸，以減小鉆具的振動，提高鉆具的使用壽命[15-16]。

1.2.3.1 曠場實(shí)驗(yàn) 32 d進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)檢測小鼠自主活動，查看造模方式和藥物是否影響小鼠自主活動。給藥30 min后，將小鼠至于曠場箱（40×40×35 cm）中央?yún)^(qū)，適應(yīng)3 min后點(diǎn)擊開始，記錄小鼠5 min內(nèi)的自主活動情況[19]；檢測結(jié)束后取總路程和平均速度作為主要評價指標(biāo)。

1.2.3.2 物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn) 物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)分為新物體識別和物體新位置識別兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑僮鲄⒄毡緦?shí)驗(yàn)室前期研究方法[20]。給藥30 min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，33～35 d將小鼠背朝入口放入箱體內(nèi)使其自由探索10 min以適應(yīng)箱體環(huán)境，該過程歷時3 d（適應(yīng)期）。36 d進(jìn)行新物體識別模式檢測，將兩個完全相同的物體放入測試箱內(nèi)的固定位置，小鼠自由探索兩物體5 min，然后將小鼠取出（熟悉期），使用酒精擦拭箱體及兩物體以消除小鼠遺留的氣味，30 min后將兩物體中其中一個物體更換成新物體讓小鼠再次探索5 min（測試期），分別記錄熟悉期和測試期5 min內(nèi)小鼠對各物體探索時長；37 d進(jìn)行物體新位置識別模式檢測（熟悉期相同，測試期更換其中一個物體位置，另一個物體保持不變）。評價指標(biāo)采用相對辨別指數(shù)（DI）：DI=（Tn-Tf）/（Tn+Tf）

Tn 和Tf 分別表示 5 min 內(nèi)小鼠對“新舊”物體（或位置）的探索時間

1.2.3.3 避暗實(shí)驗(yàn) 38～39 d避暗實(shí)驗(yàn)流程參照文獻(xiàn)進(jìn)行[21]。避暗實(shí)驗(yàn)分為獲得和鞏固兩個階段，檢測小鼠短時學(xué)習(xí)記憶能力；獲得階段于38 d給藥30 min后小鼠足部沾取生理鹽水，背朝入口，由明室放入，適應(yīng)3 min后，在小鼠進(jìn)入暗室時給予0.5 mA（5 s）電擊，學(xué)習(xí)5 min后取出。鞏固階段于39 d 給藥30 min后小鼠足部沾取生理鹽水，同樣方式放入后立即點(diǎn)擊開始，激活暗室電流，記錄小鼠從放入到第一次進(jìn)入暗室時間以及錯誤次數(shù)。

1.2.3.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 40～45 d實(shí)驗(yàn)流程參照文獻(xiàn)進(jìn)行[22]，檢測小鼠長時空間記憶能力。實(shí)驗(yàn)分為定位航行（5 d）和空間探索階段（1 d）。定位航行實(shí)驗(yàn)，每只每日以不同象限為入水點(diǎn)學(xué)習(xí)2次，給藥30 min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，圓柱形平臺固定一位置放入，水面沒過其1～1.5 cm，入水前后均放在平臺停留10 s，給予其90 s尋找平臺。系統(tǒng)記錄小鼠尋臺時間作為評價指標(biāo)。空間探索階段，將平臺撤去，系統(tǒng)記錄小鼠90 s內(nèi)穿臺次數(shù)。

1.2.4 小鼠血液與海馬組織樣本的采集 行為學(xué)檢測結(jié)束后，46 d給藥30 min后小鼠進(jìn)行眼眶取血，脫頸處死后，低溫剝離小鼠海馬組織；全血4 ℃靜置2 h后，4 ℃離心，分離血清備用；血清和海馬均至于-80 ℃冰箱。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，組間差異進(jìn)行LSD分析比較。分析結(jié)果用GraphPad Prism software8.01軟件繪制圖表，P＜0.05時表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠自主活動的影響

如圖1曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，與空白組相比，模型組小鼠總路程和平均速度未出現(xiàn)顯著性（P＞0.05），表明此睡眠干擾造模方式并不影響小鼠自主活動。與模型組相比，陽性對照組及黃精多糖各劑量組總路程及平均速度雖增加但未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），表明各給藥組無異常興奮或抑制等神經(jīng)毒副作用。

圖1 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠自主活動的影響（Mean±SEM, n=10～12）Fig.1 Effects of PSP the locomotor activities of mice induced by SI in the open field test (Mean±SEM, n=10～12)

2.2 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠物體認(rèn)知的影響

2.2.1 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠新物體識別能力的影響 如圖2（A）所示，各組小鼠熟悉期總探索時間未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），說明各組小鼠的探索能力處于同一水平。圖2（B）顯示，各組小鼠對于實(shí)驗(yàn)中相同的兩個物體（分別標(biāo)記為A1、A2）分別探索時間也無顯著差異（P＞0.05），說明小鼠未對任何一方有偏好。

圖2 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠新物體識別實(shí)驗(yàn)中熟悉期探索時間的影響Fig.2 Effects of PSP on the exploration ability of SI mice in the familiarization phase of the novel object recognition task

圖3給出了黃精多糖對睡眠干擾小鼠新物體識

圖3 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠新物體識別能力的影響Fig.3 Effect of PSP on the novel object recognition ability of SI mice in the test phase

別相對辨別指數(shù)（DI）的影響。與空白組相比，模型組DI顯著降低（P＜0.05），說明模型組小鼠已無法正確辨別新舊物體；與模型組相比，黃精多糖各劑量組小鼠DI均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），說明各給藥組均能識別出新物體，且對新物體更具探索興趣。

2.2.2 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠物體位置識別能力的影響 如圖4所示，與新物體識別熟悉期相同，熟悉期各組小鼠對兩物體的總探索時間及兩物體分別探索時間均未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），說明各組小鼠的探索能力處于同一水平，且無位置偏好。

圖4 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠物體位置識別熟悉期的影響Fig.4 Effects of PSP on the ability of exploration of SI mice in the familiarization phase of the object location recognition task

圖5給出了黃精多糖對睡眠干擾小鼠物體位置識別相對辨別指數(shù)（DI）的影響。與空白組相比，模型組DI顯著性降低（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組及黃精多糖各劑量組小鼠的DI顯著升高（P＜0.01），表明黃精多糖能提高小鼠短時空間記憶能力。

圖5 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠物體位置識別能力的影響Fig.5 Effects of PSP on the object location recognition ability of SI mice in the test phase

2.3 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響

如圖6避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，與空白組相比，模型組錯誤次數(shù)顯著升高，入暗潛伏期顯著降低（P＜0.05），說明睡眠干擾模型組小鼠記憶受到損傷。與模型組相比，黃精多糖（100、200 mg·kg-1）組錯誤次數(shù)顯著降低（P＜0.05），入暗潛伏期顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），說明給藥后模型小鼠記憶能力得到改善。

圖6 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響Fig.6 Effects of PSP on mice induced by SI in passive avoidance test

2.4 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

如表1所示，小鼠在水迷宮定位航行階段尋臺潛伏期結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠尋臺潛伏期逐漸增加，并在4、5 d時尋臺潛伏期呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；與模型組相比，4、5 d陽性對照組潛伏期顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），黃精多糖（100、200 mg·kg-1）組的潛伏期也顯著下降（P＜0.01，P＜0.001）；說明睡眠干擾對小鼠空間記憶造成了損傷，而各給藥組可不同程度改善此造模方式帶來的記憶傷害。

表1 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠水迷宮定位航行尋臺潛伏期的影響Table 1 Effects of PSP on escape latency in Morris water maze task of mice induced by SI

2.5 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠血清、海馬炎性細(xì)胞因子的影響

如圖7所示，與空白組相比，模型小鼠血清和海馬中促炎細(xì)胞因子IL-Iβ、IL-6水平均顯著升高；與模型組相比，黃精多糖（100、200 mg·kg-1）給藥組小鼠血清中促炎因子IL-β含量降低（P＜0.05），而血清中IL-6含量呈降低趨勢；海馬內(nèi)促炎因子IL-1β，IL-6均顯著降低（P＜0.01，P＜0.001）。黃精多糖對小鼠血清與海馬中促炎因子的改善作用存在差異，可能是藥物作用部位的強(qiáng)度不同。

圖7 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠血清、海馬中IL-1β、IL-6的影響Fig.7 Effects of PSP on IL-1β，IL-6 level in serum and hippocampus of mice

2.6 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠海馬神經(jīng)遞質(zhì)的影響

如圖8所示，與空白組相比，模型組小鼠海馬組織內(nèi)GABA水平顯著增加（P＜0.05），Ach水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，黃精多糖各劑量組給藥后小鼠海馬內(nèi)GABA呈顯著降低（P＜0.01），Ach呈增加趨勢，其中黃精多糖（400 mg·kg-1）出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

圖8 黃精多糖對睡眠干擾模型小鼠海馬神經(jīng)遞的影響Fig.8 Effects of PSP on concentration of neurotransmitters in hippocampus of mice

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過曠場、物體認(rèn)知、避暗、水迷宮四個行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來評價睡眠干擾和黃精多糖干預(yù)對小鼠認(rèn)知功能的影響。本實(shí)驗(yàn)中曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠自主活動處于同一水平，表明造模及給藥并未影響小鼠正常活動，這與黃紅等[23]探討睡眠干擾誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙研究中的曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，黃精多糖各劑量組對物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)中小鼠新舊物體、物體位置的識別能力有明顯提高作用，這與Lueptow等[24]探討的小鼠學(xué)習(xí)記憶功能在新物體識別檢測中的表現(xiàn)結(jié)果類似，同時與陳耀輝等[25]在探討黃精相關(guān)復(fù)方對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷時的新物體識別檢測結(jié)果一致；在小鼠短時（避暗）、長時（水迷宮）記憶檢測實(shí)驗(yàn)中，黃精多糖各劑量組能明顯增加小鼠避暗潛伏期、降低錯誤次數(shù)，降低水迷宮尋臺潛伏期，這與劉露露等[17]探討黃精多糖對D-半乳糖致小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的研究中避暗、水迷宮結(jié)果類似。以上結(jié)果說明，黃精多糖干預(yù)可有效改善睡眠干擾致認(rèn)知功能損傷。

睡眠不足引起的認(rèn)知障礙和炎癥因子、神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)，炎癥被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶損傷潛在的機(jī)制[26]，睡眠不足會激活促炎因子IL-1β、IL-6的表達(dá)引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與免疫損傷進(jìn)而影響認(rèn)知功能[27-28]。Ach是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)睡眠和多種認(rèn)知過程所必需的遞質(zhì)[29-30]，GABA為腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與記憶、睡眠等息息相關(guān)[31-32]，腦內(nèi)Ach的異常下降和GABA的異常增高會導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶下降[33-34]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，與模型組相比，黃精多糖各劑量組干預(yù)后能夠顯著降低模型小鼠血清和海馬內(nèi)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6水平，降低海馬組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)GABA水平，升高Ach水平。由此推測黃精多糖改善睡眠干擾小鼠認(rèn)知功能損傷作用可能是通過抑制促炎性因子水平和調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用。

綜上所述，黃精多糖可防治睡眠干擾所致認(rèn)知功能損傷，主要表現(xiàn)在黃精多糖可提高認(rèn)知功能損傷小鼠的短時非空間記憶能力（新物體識別）、短時空間記憶能力（物體位置識別）、長時空間學(xué)習(xí)能力（水迷宮）以及被動逃避記憶能力（避暗），其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)血清和海馬內(nèi)促炎細(xì)胞因子水平和海馬內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平。本研究結(jié)果可為黃精多糖神經(jīng)保護(hù)作用的深入挖掘提、為黃精的精深加工利用提供一定的參考。