T細胞受體γ位點反義RNA 1、人抗原R、三元基序家族蛋白21、缺氧誘導因子-1α在結直腸癌組織中的表達及臨床意義△

柴小兵，褚菲菲，肖興國，吳慧麗

鄭州大學附屬鄭州中心醫院消化內科，河南省結直腸癌診治醫學重點實驗室，鄭州市結直腸癌診治與研究重點實驗室，鄭州 450007

結直腸癌是臨床中常見的一種消化系統惡性腫瘤，其發病與大腸腺瘤、遺傳因素、生活習慣等存在密切關系，常見的臨床癥狀為腹痛、便血以及大便性狀改變等，多見于中老年人群，男性發病率高于女性，近年來結直腸癌的發病率呈上升及年輕化趨勢[1]。目前，手術是治療結直腸癌的主要方法之一，早期明確診斷并及時給予針對性治療可以使患者獲得較好預后。研究指出，復發轉移是影響結直腸癌患者預后的主要因素。結直腸癌的復發轉移機制復雜，某些與腫瘤相關的因子可能起到重要作用[2]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與惡性腫瘤有關，T細胞受體γ位點反義RNA 1（T cell receptor gamma locus antisense RNA 1，TRG-AS1）是近年來新發現的一種惡性腫瘤相關lncRNA[3]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）不僅參與惡性腫瘤新生血管生成，而且在能量代謝過程中具有重要作用[4]。人抗原R（human antigen R，HuR）是胚胎致死性異常視覺基因的蛋白質產物，可以對mRNA的不穩定性進行調節，與多種惡性腫瘤的發生有關[5]。三元基序家族蛋白21（tripartite motif-containing protein 21，TRIM21）是TRIM家族的重要成員，在腫瘤細胞生長和增殖等方面起到重要的調控作用[6]。本研究分析 TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α在結直腸癌組織中的表達及臨床意義，旨在為結直腸癌的治療提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2019年6月于鄭州大學附屬鄭州中心醫院接受手術治療的結直腸癌患者。納入標準：①經病理檢查確診為結直腸癌；②初次行手術治療；③術前未接受過生物免疫治療或放化療等；④臨床資料及隨訪資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②合并免疫系統疾病、心腦血管疾病或血液系統疾病；③合并全身性感染。依據納入和排除標準，本研究共納入103例患者。其中，男性68例，女性35例；年齡34～77歲，平均（54.97±10.68）歲。收集103例結直腸癌患者的結直腸癌組織及癌旁組織（距結直腸癌組織5 cm以上），所有標本均置于低溫保存管，經液氮處理后置于-80℃冰箱中保存備用。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組織化學染色法檢測HuR、TRIM21、HIF-1α表達情況及結果判定 石蠟包埋處理標本，連續切片，厚度為4 μm左右；將切片脫蠟和水化，通過高壓鍋修復抗原，時間為2 min；封閉液孵育60 min；滴加HuR、TRIM21、HIF-1α一抗工作液50 μl，4℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加二抗工作液50 μl，室溫下孵育30 min；加入二氨基聯苯胺顯色，分別應用蘇木精及梯度乙醇進行復染和脫水，然后進行固封和鏡檢。采用熒光倒置顯微鏡觀察染色結果。陽性細胞比例評分：＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞比例評分和染色強度評分相乘，0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為中等陽性，9～12分為強陽性，其中1～9分為陽性。

1.2.2 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測TRG-AS1相對表達量 應用Trizol試劑提取總RNA，然后應用PrimeScript逆轉錄酶試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。采用SYBR Green PCR試劑盒進行基因擴增，引物由武漢擎科生物技術有限公司設計合成，TRG-AS1上游引物5'-ATGAAGAAGCCGCGAAGTGT-3'，下游引物 5'-CACACCCTAATACACATGCCCT-3'；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物5'-TCGACAGTCAGCCGCATCTT-3'，下游引物5'-GGCGCCCAATACGACCAAAT-3'。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環，最后72℃延伸5 min。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法檢測TRG-AS1的相對表達量。

1.3 隨訪方法

出院后第1天開始隨訪，通過門診復查或電話、微信等電子通訊的方式進行隨訪，隨訪截止時間為2022年3月，以患者死亡或復發為隨訪終點。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或McNemar檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織和癌旁組織中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達情況的比較

結直腸癌組織中TRG-AS1相對表達量為（1.50±0.50），明顯高于癌旁組織的（0.71±0.19），差異有統計學意義（t=9.281，P＜0.01）。結直腸癌組織中HuR、HIF-1α陽性率分別為65.05%（67/103）、76.70%（79/103），分別明顯高于癌旁組織的10.68%（11/103）、14.56%（15/103），差異均有統計學意義（P＜0.01）。結直腸癌組織中TRIM21陽性率為30.10%（31/103），明顯低于癌旁組織的91.26%（94/103），差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達情況的比較

不同分化程度、淋巴結轉移情況、血管侵犯情況結直腸癌患者結直腸癌組織中TRG-AS1相對表達量比較，差異均有統計學意義（F=14.116、t=4.688、t=3.038，P＜0.05）；不同浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移情況結直腸癌患者結直腸癌組織中HuR陽性率比較，差異均有統計學意義（χ2=5.864、9.938、7.237，P＜0.05）；不同浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移情況結直腸癌患者結直腸癌組織中TRIM21陽性率比較，差異均有統計學意義（χ2=45.537、7.908、5.859，P＜0.05）；不同浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移情況結直腸癌患者結直腸癌組織中HIF-1α陽性率比較，差異均有統計學意義（χ2=5.498、5.804、5.499，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α的表達情況

2.3 不同TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達情況結直腸癌患者預后的比較

隨訪至2022年3月，103例患者中死亡36例，生存67例，生存率為65.05%。以TRG-AS1相對表達量的中位值為界，中位值以上為高表達，中位值及以下為低表達；TRG-AS1低表達患者的累積生存率為55.6%，高于TRG-AS1高表達患者的31.5%，差異有統計學意義（χ2=6.493，P=0.011）。HuR陰性患者的累積生存率為56.9%，高于HuR陽性患者的37.0%，差異有統計學意義（χ2=4.824，P=0.028）。TRIM21陰性患者的累積生存率為22.4%，低于TRIM21陽性患者的59.0%，差異有統計學意義（χ2=5.827，P=0.015）。HIF-1α陰性患者的累積生存率為72.0%，高于HIF-1α陽性患者的36.6%，差異有統計學意義（χ2=4.422，P=0.035）。（圖1）

圖1 不同TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達情況結直腸癌患者的生存曲線

3 討論

結直腸癌具有較高的發病率及病死率，特別是中晚期患者，即使接受手術、化療、放療等綜合治療，其預后情況仍不容樂觀。近年來，隨著生物信息學、基因檢測技術的發展，多種新型腫瘤標志物逐漸被發現[7]。結直腸癌發病的分子機制尚未明確，仍需要進一步研究其治療靶點。

本研究結果顯示，結直腸癌組織中TRG-AS1相對表達量明顯高于癌旁組織，說明TRG-AS1可能作為一種促癌基因參與結直腸癌的發生發展過程。lncRNA異常表達在惡性腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用，有學者指出，TRG-AS1能夠通過影響微小 RNA（microRNA，miRNA）-877-5p對Zeste 12同源物1抑制因子2（suppressor of zeste 12 homolog，SUZ12）的表達情況進行調控，從而促進膠質母細胞瘤進展[8]。He等[9]研究指出，TRG-AS1可以通過調控miRNA-543/Yes相關蛋白1信號通路促進舌鱗狀細胞癌的發生。目前關于TRG-AS1在結直腸癌中表達上調的機制尚不清楚。分析其原因可能是TRG-AS1受其他轉錄因子調控或編碼基因發生突變導致[10]。本研究結果顯示，不同分化程度、淋巴結轉移情況、血管侵犯情況結直腸癌患者結直腸癌組織中TRG-AS1相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），說明TRG-AS1表達水平與結直腸癌患者病情嚴重程度有關。研究表明，上皮-間充質轉化在結直腸癌進展、轉移和耐藥中發揮重要作用，而TRG-AS1下調有效地抑制了上皮-間充質轉化，TRG-AS1表達水平升高后對上皮-間充質轉化的抑制作用減弱[11]。

據報道，許多轉錄因子參與了惡性腫瘤某些關鍵的生物學過程，包括細胞增殖、凋亡、新生血管生成、免疫反應和轉移等，與患者的生存率存在密切關系[12]。HuR是一種RNA結合蛋白，已被證明通過不同的轉錄后機制（如mRNA衰變和蛋白質翻譯）調節多個基因的表達[13]。本研究結果顯示，結直腸癌組織中HuR陽性率明顯高于癌旁組織，不同浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移情況結直腸癌患者結直腸癌組織中HuR陽性率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明HuR能夠反映結直腸癌患者病情嚴重程度。B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、c-Myc、細胞周期蛋白D（cyclin D）和細胞周期蛋白A（cyclin A）基因為HuR的下游分子，這些基因均參與了細胞增殖和細胞周期等過程，如轉錄因子c-Myc可調節10%～15%的人類基因表達，在細胞增殖、分化、生長和存活過程中發揮重要作用；細胞周期蛋白是細胞周期的基本調節因子，在腫瘤發生中發揮重要作用，cyclin A是細胞通過S期所必需的[14]。HuR通過上調Bcl-2、c-Myc、cyclin D和cyclin A基因表達調節腫瘤細胞增殖和凋亡，促進結直腸癌的發生發展[15]。

TRIM21是TRIM超家族成員，已被發現是多種自身免疫疾病（如炎癥性腸病、系統性紅斑狼瘡和風濕性疾病等）的關鍵調節因子，而且有研究證實，TRIM21是肝細胞癌中潛在的腫瘤抑制因子[16]。本研究結果顯示，結直腸癌組織中TRIM21陽性率明顯低于癌旁組織，說明結直腸癌中TRIM21發揮抑癌基因的作用。Zhou等[17]研究指出，TRIM21在結腸炎相關腫瘤中表達下調，通過調節腫瘤細胞增殖、黏附、組織重塑、血管生成以及炎癥反應來負調節結腸上皮癌變，進而降低結直腸癌的發生風險。本研究結果顯示，不同浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移情況結直腸癌患者結直腸癌組織中TRIM21陽性率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明TRIM21可反映結直腸癌患者病情嚴重程度。其原因可能是TRIM21能夠介導蛋白酶體降解以及Snail蛋白泛素化，調節上皮-間充質轉化過程，進而抑制結直腸癌細胞的侵襲和轉移[18]。

HIF-1α在惡性腫瘤對缺氧的反應中發揮重要作用，在缺氧條件下HIF-1α信號被激活，參與腫瘤的侵襲、轉移以及對放療和化療的抵抗[19]。本研究結果顯示，結直腸癌組織中HIF-1α陽性率明顯高于癌旁組織，說明結直腸癌中HIF-1α發揮促癌基因的作用。HIF-1α表達上調與抑癌基因突變、促癌基因激活有關，還可能與組織氧濃度降低有關。本研究結果顯示，不同浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移情況結直腸癌患者結直腸癌組織中HIF-1α陽性率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明HIF-1α水平同樣可反映結直腸癌患者病情嚴重程度。其原因可能是HIF-1α表達上調可以促進上皮-間充質轉化，進而增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力；另外，在缺氧狀態下，HIF-1α也可以通過誘導p53表達促進腫瘤細胞增殖[20]。本研究還發現，TRG-AS1低表達、HuR陰性、TRIM21陽性、HIF-1α陰性結直腸癌患者的累積生存率分別高于TRGAS1高表達、HuR陽性、TRIM21陰性、HIF-1α陽性患者（P＜0.05），說明 TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達情況與結直腸癌患者預后有關，可能作為評估結直腸癌患者預后的標志物。

綜上所述，結直腸癌組織中TRG-AS1、HIF-1α及HuR表達均升高，TRIM21表達降低，TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達情況與結直腸癌侵襲、轉移及患者預后密切相關，對評估結直腸癌患者病情及預后具有一定的臨床價值。